CN113831397A - 一种原花青素物质调控因子NtMYB330及其表达载体、转化体、试剂盒与方法 - Google Patents

一种原花青素物质调控因子NtMYB330及其表达载体、转化体、试剂盒与方法 Download PDF

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Abstract

本发明“一种原花青素物质调控因子NtMYB330及其表达载体、转化体、试剂盒与方法”属于遗传工程技术领域。所述一种原花青素物质调控因子NtMYB330的氨基酸序列中包含：R2重复序列、R3重复序列、[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R结构域、VI[R/P]TKAx1RC[S/T]结构域。所述一种原花青素物质调控因子NtMYB330的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。基于过表达原花青素物质调控因子NtMYB330获得的转基因植株花中的儿茶酸含量平均提高431.5％；表儿茶酸含量平均提高406.5％。说明烟草NtMYB330基因在提高烟草花中原花青素含量方面具有较大的应用前景。

Description

一种原花青素物质调控因子NtMYB330及其表达载体、转化体、 试剂盒与方法
技术领域
本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及一种原花青素物质调控因子NtMYB330及其表达载体、转化体、试剂盒与方法。
背景技术
烟草(学名：Nicotiana tabacum L.)是茄科烟草属植物，一年生草本。原产于南美洲。中国南北各省区广为栽培。该植物可作烟草工业的原料；全株也可作农药杀虫剂；亦可药用，作麻醉、发汗、镇静和催吐剂。
原花青素物质是植物中一类重要的酚类次生代谢产物，具有较强的抗氧化性。在烟草植株中过表达茶叶中原花青素途径相关基因(CsDFR,CsANR)能够显著提高转基因烟草的原花青素物质含量，同时提高转基因烟草清除活性氧自由基的能力，以及抵御烟草叶片斜纹贪夜蛾(Spodoptera litura)侵染的抗性。鉴于原花青素物质对于植物抗逆性等方面的影响，越来越多的研究开始关注原花青素物质代谢途径的调控，尤其是转录水平的调控，并往往以烟草为模式植物，在烟株的花中验证异源基因对原花青素物质合成的调控功能。
国内外对拟南芥、番茄、葡萄等高等植物中原花青素途径的转录调控已有广泛研究，但是在烟草中的相关报道较为罕见，本领域有关烟草中原花青素物质调控因子及其相关基因的克隆更是一片空白。
发明内容
针对本领域现有技术存在的上述空白，本发明提供一种烟草花中原花青素合成正向调控基因NtMYB330，以及烟草花中原花青素合成正向调控基因NtMYB330的克隆方法，同时提供所述的烟草花中原花青素合成正向调控基因NtMYB330的应用。
本发明的技术方案如下：
一种原花青素物质调控因子NtMYB330，其特征在于，其氨基酸序列中包含：R2重复序列、R3重复序列、[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R结构域、VI[R/P]TKAx1RC[S/T]结构域。
所述的原花青素物质调控因子NtMYB330的氨基酸序列从氨基端到羧基端依次包括R2重复序列、R3重复序列、[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R结构域、VI[R/P]TKAx1RC[S/T]结构域；
优选地，所述[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R结构域位于R3重复序列里面；
优选地，所述[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R结构域位于R3重复序列的第12位氨基酸后面；
优选地，所述原花青素物质调控因子NtMYB330的氨基酸序列第11-63位氨基酸为R2重复序列；
优选地，所述原花青素物质调控因子NtMYB330的氨基酸序列第64-115位氨基酸为R3重复序列；
优选地，所述原花青素物质调控因子NtMYB330的氨基酸序列第188-197位氨基酸为VI[R/P]TKAx1RC[S/T]结构域；
优选地，所述原花青素物质调控因子NtMYB330的氨基酸序列第76-95位氨基酸为[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R结构域。
所述的原花青素物质调控因子NtMYB330的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
所述的原花青素物质调控因子NtMYB330的基因序列如SEQ ID NO：1所示；
优选地，所述原花青素物质调控因子NtMYB330为烟草Nicotiana tabacum L.原花青素物质调控因子NtMYB330。
一种可调控原花青素物质合成的表达载体，其特征在于，连接有所述的原花青素物质调控因子NtMYB330的基因序列。
优选地，所述可调控原花青素物质合成的表达载体指，在表达载体上连接了所述原花青素物质调控因子NtMYB330的基因序列；
优选地，所述表达载体选自：pK2GW7载体；
优选地，所述调控为正调控；
优选地，所述原花青素物质包括儿茶酸、表儿茶酸；
优选地，所述正调控指使原花青素物质含量优选提高3倍以上。
一种可调控原花青素物质合成的转化体，其特征在于，转化有所述的一种可调控原花青素物质合成的表达载体。
优选地，所述可调控原花青素物质合成的转化体指，宿主细胞中转化有所述可调控原花青素物质合成的表达载体；
优选地，所述宿主细胞选自：植物细胞或微生物细胞；
优选地，所述植物为烟草；
优选地，所述微生物选自：大肠杆菌、农杆菌。
一种可调控原花青素物质合成的试剂盒，其特征在于，包括：所述的原花青素物质调控因子NtMYB330、和/或，所述的一种可调控原花青素物质合成的表达载体、和/或，所述的一种可调控原花青素物质合成的转化体。
所述的一种可调控原花青素物质合成的试剂盒还包括：原花青素物质调控因子NtMYB330的基因序列的扩增引物、PCR常用试剂、连接转化常用试剂、转基因常用试剂；
优选地，所述原花青素物质调控因子NtMYB330的基因序列的扩增引物包括：
正向引物NtMYB330-BamH I:5’-GGATCCATGGGAAGAAAGCCTTGTTGTTC-3’，
反向引物NtMYB330-Xho I：5’-CTCGAGTCAAGAGGAGAACCCATTAATCC-3’；
优选地，所述PCR常用试剂包括：DNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液、双蒸水；
所述DNA聚合酶优选
Figure BDA0003219419340000031
High-Fidelity DNA Polymerase，所述PCR缓冲液优选5×Phusion HF反应缓冲液；
优选地，所述连接转化常用试剂包括：限制性内切酶、连接缓冲液、表达载体、蛋白酶、感受态细胞、培养基；
优选地，所述限制性内切酶优选BamH I、Xho I；所述限制性内切酶优选CloneaseTMⅡenzyme Mix；所述连接缓冲液优选TE Buffer；所述蛋白酶优选Proteinase K；
优选地，所述表达载体选自：pK2GW7载体；
优选地，所述感受态细胞选自：大肠杆菌感受态细胞、农杆菌感受态细胞；
优选地，所述培养基选自LB培养基。
一种可调控原花青素物质合成的方法，其特征在于，在植物体内过表达所述的原花青素物质调控因子NtMYB330、和/或，在植物体内转化所述的一种可调控原花青素物质合成的表达载体、和/或，用所述的一种可调控原花青素物质合成的转化体侵染植物。
所述的一种可调控原花青素物质合成的方法包括：PCR扩增所述原花青素物质调控因子NtMYB330的基因序列得到PCR扩增产物；
优选地，所述PCR扩增体系包括：4ng/μL植物的cDNA，5×Phusion HF反应缓冲液0.2μL/μL，0.2mM dNTP，0.04U/μL的
Figure BDA0003219419340000032
High-Fidelity DNA Polymerase，0.2μM的正反向引物，其余为水；
优选地，所述正反向引物包括：
正向引物NtMYB330-BamH I:5’-GGATCCATGGGAAGAAAGCCTTGTTGTTC-3’，
反向引物NtMYB330-Xho I：5’-CTCGAGTCAAGAGGAGAACCCATTAATCC-3’；
优选地，所述PCR扩增程序包括：98℃，30秒；以98℃，7秒；62℃，30秒；72℃，45秒为1个循环，共35个循环；72℃延伸7分钟；
优选地，所述方法还包括：将所述PCR扩增产物与表达载体连接得到所述可调控原花青素物质合成的表达载体；
优选地，所述连接指将连接有原花青素物质调控因子NtMYB330的基因序列的表达载体pENTRTMNtMYB330通过LR反应进一步连接得到可调控原花青素物质合成的表达载体pK2GW7-NtMYB330；
优选地，所述LR反应的体系包括：6.25ng/μL-18.75ng/μL的pENTRTMNtMYB330，0.0625μL/μL的连接载体，其余为TE Buffer；
优选地，所述LR反应的步骤包括：连接反应体系混匀，冰浴2min，混匀；加入0.2μL/μL LR CloneaseTMⅡenzyme Mix，混匀，离心，25℃水浴1h；然后加入0.9μL/μL ProteinaseK，混匀，37℃水浴10min；所述混匀方式优选轻弹；
优选地，所述方法还包括：将可调控原花青素物质合成的表达载体pK2GW7-NtMYB330转化至感受态细胞得到可调控原花青素物质合成的转化体；
优选地，所述方法还包括：将可调控原花青素物质合成的转化体侵染植物细胞；
优选地，所述感受态细胞为农杆菌感受态细胞；所述可调控原花青素物质合成的转化体指含有可调控原花青素物质合成的表达载体pK2GW7-NtMYB330的农杆菌克隆；
优选地，所述植物优选烟草；
优选地，所述调控为正调控；
优选地，所述原花青素物质：包括儿茶酸、表儿茶酸；
优选地，所述正调控指使原花青素物质含量优选提高3倍以上。
本发明提供一种烟草花中原花青素物质合成正向调控基因NtMYB330，其特征在于所述的烟草花中原花青素物质合成正向调控基因NtMYB330的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
烟草花中原花青素物质合成正向调控基因NtMYB330编码的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。
所述的烟草花中原花青素物质合成正向调控基因NtMYB330的克隆方法，其特征在于包括以下步骤：
A、提取烟草花组织RNA，反转录得到第一链cDNA；
B、根据NtMYB330基因序列设计合成特异性引物，以反转录得到的第一链cDNA作为模板，进行PCR扩增，回收和纯化PCR产物；
C、纯化扩增产物与TOPO载体连接，连接体系与过程如下：4μL纯化产物、1μL saltsolution、1μL
Figure BDA0003219419340000041
-BluntⅡ-TOPO混匀，25℃，水浴30min；将连好的载体通过热激转化进入大肠杆菌DH5α，加液体培养基振荡培养后涂布至含100mg/L卡那霉素的LB平板上过夜培养，挑取菌落进行菌液培养，质粒提取和PCR检测。筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序。
B步骤中所述的引物为：
正向引物NtMYB330-BamH I:5’-GGATCCATGGGAAGAAAGCCTTGTTGTTC-3’(SEQ IDNO.3)，
反向引物NtMYB330-Xho I：5’-CTCGAGTCAAGAGGAGAACCCATTAATCC-3’(SEQ IDNO.4)。
B步骤中PCR扩增的反应体系是选用Phusion高保真扩增酶反应体系，体系总体积50μL，包括：200ng cDNA，5×Phusion HF反应缓冲液10μL，10mM dNTP 1μL，2U的
Figure BDA0003219419340000051
High-Fidelity DNA Polymerase，10μM的正反向引物各1μL，补水至50μL。
B步骤中PCR扩增的反应条件是在
Figure BDA0003219419340000052
pro扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，7秒；62℃，30秒；72℃，45秒；35个循环；72℃延伸7分钟。
所述的正向调控烟草花中原花青素含量的基因NtMYB330的过表达载体，其特征在于所述的正向调控烟草花中原花青素含量的基因NtMYB330的过表达载体为pK2GW7-NtMYB330。
所述的烟草花中原花青素合成正向调控基因NtMYB330的应用，其特征在于所述的烟草花中原花青素合成正向调控基因NtMYB330在用于获得烟草花中原花青素物质含量显著提高的转基因植株中的应用。
所述获得NtMYB330转基因烟草的方法包括以下步骤：
A、过表达克隆载体的构建：
1、克隆的NtMYB330基因连接TOPO载体
(1)以烟草品种云烟87的花组织的cDNA为模板，利用NtMYB330基因特异引物进行扩增，得到大小约为1.2kb的基因片段，纯化回收；
(2)将回收的NtMYB330基因片段进行TOPO克隆，连接到
Figure BDA0003219419340000053
-BluntⅡ-TOPO(3.5kb)载体后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒进行PCR检测，挑选扩增产物大小约为1.2kb的质粒提取DNA，构建的载体命名为pTOPO-NtMYB330；
(3)由于基因上下游引物分别带有BamH I、Xho I的识别位点，因此选择这两个酶对PCR检测正确的质粒样品进行双酶切检测，酶切结果产生两条片段，大小分别为3.5kb和1.2kb左右，说明目的片段已插入TOPO载体，将目的基因片段(1.2kb)胶回收。
2、植物过表达载体的构建
a、入门克隆pENTRTM2B-NtMYB330的构建
(1)BamH I/Xho I酶切pTOPO-NtMYB330和pENTRTM2B，得到目的基因片段NtMYB330和载体pENTRTM2B线性化片段，胶回收后进行连接、转化感受态细胞DH5α；
(2)挑取转化DH5α后的克隆，提取质粒DNA，BamH I/Xho I酶切，酶切结果为3.5kb的载体片段和1.2kb左右的片段为正确的克隆，正确的克隆命名为pENTRTM2B-NtNtMYB330；
b、通过LR反应得到植物表达载体
(1)入门克隆pENTRTMNtMYB330和表达载体pK2GW7 LR反应后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到植物表达载体pK2GW7-NtMYB330。利用BamH I/Xho I酶切鉴定pK2GW7-NtMYB330，正确的克隆可以切出两条片段大约1.2kb和11kb。
上述LR反应体系：构建成功的入门载体pENTRTM-NtMYB330(50-150ng)1-7μL，0.5μLDestination Vector，TE Buffer至总体积8μL；混匀，冰浴2min，轻弹2次；加入2μL LRCloneaseTMⅡenzyme Mix，轻弹，混匀，离心，25℃水浴1h；然后加入1μL Proteinase K轻弹，混匀，37℃水浴10min。
B、烟草的遗传转化：
(1)表达载体转化农杆菌
从-80℃冰箱中取出农杆菌感受态细胞，放置冰上溶解后加入4μL重组表达载体pK2GW7-NtMYB330；液氮速冻1分钟，转入37℃水浴5分钟，再冰浴2分钟，向混合物中加入1mLLB液体培养基，28℃、220rpm培养3-4小时；培养物涂布于含有壮观霉素100mg/L和利福平25mg/L的LB固体培养基上，28℃倒置培养2-3天，可见含有目的载体的农杆菌克隆；
(2)烟草转化
a、挑取含有目标载体的农杆菌克隆，在含有壮观霉素和利福平的LB平板上划线，28℃培养2-3天；刮取划线菌斑接菌于含有壮观霉素和利福平的MS培养基中，28℃，220rpm振荡培养，菌液浓度达到OD＝0.5-0.8时6,000rpm离心5分钟富集菌体，弃上清，再用20mL液体MS培养基重悬菌体，得到含目标载体的农杆菌悬浮菌液；
b、将烟草叶片置于500mL广口瓶中，加入适量75％乙醇，漂洗1min；弃乙醇，加入0.1％的HgCl2溶液，置摇床上室温振荡15～30分钟；弃HgCl2溶液，用无菌水冲洗6遍；
c、将烟草叶片取出，用无菌吸水纸吸去表面液体，使用剪刀将无菌叶片切成约1cm×1cm的小片，将切成小片的烟草叶片放入含目标载体的无菌MS液体培养基悬浮菌液中，静置15～20min；取出烟草叶片，使用无菌滤纸吸去多余菌液，于含有6-BA(0.02mg/L)、NAA(2mg/L)的MS培养基中25℃暗培养两天；随后，把烟草叶片转入分化培养基中，切口接触培养基，于温室条件下分化培养；分化培养基为含有6-BA(0.5mg/L)、NAA(0.1mg/L)、卡那霉素(100mg/L)、头孢霉素(500mg/L)的MS培养基，每2-3周继代培养1次，切口处逐渐长出愈伤组织，最终分化出芽；
d、将长至3-5cm的芽切下，转入MS培养基诱导生根，取出生根后的转基因植株用自来水洗净培养基，移植于灭菌的营养土中；
e、转基因植株经NPTII基因特异引物：
NPTII-F:5’-TCGGCTATGACTGGGCACAACAGA-3’(SEQ ID NO.5)，
NPTII-R:5’-AAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCG-3’(SEQ ID NO.6)PCR验证扩增，鉴定转基因阳性植株。
本发明的第一目的是这样实现的，所述的烟草花中原花青素物质合成正向调控基因NtMYB330的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：
A、提取烟草花组织RNA，反转录得到第一链cDNA；
B、根据NtMYB330基因序列设计合成特异性引物，以反转录得到的第一链cDNA作为模板，进行PCR扩增，回收和纯化PCR产物；
C、纯化扩增产物通过试剂盒反应与TOPO载体连接，连接体系与过程如下：4μL纯化产物、1μL salt solution、1μL
Figure BDA0003219419340000071
-BluntⅡ-TOPO混匀，25℃，水浴30min；将连好的载体通过热激转化进入大肠杆菌DH5α，加液体培养基振荡培养后涂布至含100mg/L卡那霉素的LB平板上过夜培养，挑取菌落进行菌液培养，质粒提取和PCR检测。筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序。
本发明的第三目的是这样实现的，所述的烟草花中原花青素物质合成正向调控基因NtMYB330在获得烟草花中原花青素物质含量显著提高的转基因植株中的应用；即所述的烟草花中原花青素物质合成正向调控基因NtMYB330用于提高烟草花中原花青素物质的含量。
本发明公开了一种原花青素物质调控因子NtMYB330及其表达载体、转化体、试剂盒与方法，原花青素物质合成正向调控基因NtMYB330核苷酸序列如SEQ ID：No.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID：No.2所示。本发明公开的烟草花中原花青素物质合成正向调控因子NtMYB330基因的克隆方法，具体步骤包括：A、确定NtMYB330基因序列；B、提取烟草花组织RNA，反转录得到第一链cDNA；C、根据NtMYB330基因序列设计合成特异性引物，以cDNA作为模板，进行PCR扩增；D、回收和纯化PCR产物，并测序；E、构建含NtMYB330基因的过表达载体。将过表达载体通过农杆菌介导的转化在烟草中过表达，制备转基因植株。相较于空载体对照，获得的转基因植株花中的儿茶酸含量平均提高431.5％；表儿茶酸含量平均提高406.5％。说明烟草NtMYB330基因在提高烟草花中原花青素含量方面具有较大的应用前景。
本发明通过转录组测序获得与类黄酮物质合成途径结构基因共表达的若干MYB转录因子，其中NtMYB330基因编码的蛋白质序列，除在氨基端含有R2R3重复序列以及和bHLH蛋白结合的高度保守的[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R结构域外，其羧基端序列中存在VI[R/P]TKAx1RC[S/T]结构域，而含有该结构域的R2R3-MYB型转录因子被认为参与调控原花青素的合成，属于原花青素调控因子进化分支二。将NtMYB330的蛋白质序列与其它已知调控功能的植物R2R3-MYB转录因子的蛋白序列进行同源性分析，发现NtMYB330属于原花青素调控因子进化分支二。
转录因子复合体参与调控类黄酮不同分支途径(如花青素、原花青素分支途径)的结构基因的转录活性，是调控类黄酮物质合成的主要机制。转录因子复合体包括负责结合DNA的R2R3型MYB转录因子，以及bHLH转录因子和WD40调节蛋白，其中R2R3-MYB转录因子决定复合体能够调控哪些目标基因。本发明克隆得到的烟草NtMYB330，其为调控类黄酮途径的R2R3-MYB型转录因子，并且直接参与转录调控原花青素物质的合成。本发明通过相关实验结果表明过表达NtMYB330基因能够显著提高烟草花中儿茶酸和表儿茶酸的含量，此结果为利用植物基因工程技术提高烟草花中原花青素物质含量提供了靶标基因。
本发明克隆的烟草原花青素调控因子NtMYB330一定程度揭示了烟草自身原花青素代谢途径的调控机理，丰富了高等植物该领域的研究，也有利于烟草作为模式植物和研究平台用于其他植物原花青素相关基因的功能研究。
本发明从烟草中得到一个烟草花中原花青素物质合成正向调控基因NtMYB330，具体步骤为：通过转录组测序获得与类黄酮物质合成途径结构基因共表达的若干MYB转录因子，其中NtMYB330基因编码的蛋白质序列与其他已知调控功能的植物R2R3-MYB转录因子的蛋白序列的同源性分析暗示NtMYB330属于原花青素调控因子进化分支二。根据该基因序列信息设计基因特异引物进行PCR反应，得到目的产物；对目的产物测序，得到NtMYB330基因序列；利用农杆菌介导的遗传转化方法获得NtMYB330基因的过表达(OE)株系，对NtMYB330进行功能鉴定，结果表明过表达NtMYB330基因能够显著提高烟草花中原花青素物质的积累量，相较于空载体对照，获得的转基因植株花中的儿茶酸含量平均提高431.5％；表儿茶酸含量平均提高406.5％。说明烟草NtMYB330基因在提高烟草花中原花青素含量方面具有较大的应用前景。
附图说明
图1为本发明的实验例1中NtMYB330基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图，NtMYB330大小为1164bp，L:DL 5000DNA Marker；
图2为本发明的实验例3中菌落PCR检测重组过表达载体pK2GW7-NtMYB330的农杆菌转化效果，L为DL 2000DNA Ladder，1、2、3为PCR产物；
图3为本发明的实验例3中NtMYB330基因组织特异性表达分析结果。由于基因的相对表达量在不同的组织中差异较大。图3的柱状图将Y轴折断的处理为本领域现有技术文章常见的图表处理方法，这样处理的目的在于，当不同处理/组织的差异较大时，“花”和“种子”的柱子很高，而“茎”、“叶”的柱子基本看不到。为了表示出表达量低的组织，对Y轴做折断处理，空缺部分就把差异从视觉上缩小。
图4为本发明的实验例4中T2代NtMYB330基因转基因植株花中原花青素物质生物合成途径基因的表达水平分析；VC为空载体对照，OE1和OE2为转基因株系，A为NtDFR1，B为NtDFR2，C为NtANS1，D为NtANS2，E为NtLAR1，F为NtLAR2，G为NtANR1，H为NtANR2。“*”和“**”分别表示该转基因植株的基因相对表达量与空载体对照VC在0.05和0.01水平上差异显著；
图5为T2代NtMYB330基因转基因植株花中原花青素物质含量分析；A为儿茶酸含量分析，B为表儿茶酸含量分析，VC为空载体对照，OE1和OE2为转基因株系。“*”和“**”分别表示该转基因植株的原花青素物质含量与空载体对照VC在0.05和0.01水平上差异显著。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
第1组实施例、本发明的原花青素物质调控因子NtMYB330
本组实施例提供一种原花青素物质调控因子NtMYB330。本组所有的实施例都具备如下共同特征：原花青素物质调控因子NtMYB330的氨基酸序列中包含：R2R3重复序列、[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R结构域和VI[R/P]TKAx1RC[S/T]结构域。
[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R结构域记载于“A single amino acid substitution inthe R3 domain of GLABRA1 leads to inhibition of trichome formation inArabidopsis without affecting its interaction with GLABRA3”一文中；
VI[R/P]TKAx1RC[S/T]结构域记载于“The Arabidopsis TT2 gene encodes anR2R3 MYB domain protein that acts as a key determinant for proanthocyanidinaccumulation in developing seed”一文中；
R2R3重复序列记载于“Ectopic expression of the coleus R2R3 MYB-Typeproanthocyanidin regulator gene SsMYB3 alters the flower color in transgenictobacco”一文中。
在一些实施例中，所述的原花青素物质调控因子NtMYB330的氨基酸序列从氨基端到羧基端依次包括R2R3重复序列、[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R结构域、VI[R/P]TKAx1RC[S/T]结构域。
在一些实施例中，所述的原花青素物质调控因子NtMYB330的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。
在另一些实施例中，所述的原花青素物质调控因子NtMYB330基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
优选地，所述原花青素物质调控因子NtMYB330为烟草Nicotiana tabacum L.原花青素物质调控因子NtMYB330。
第2组实施例、本发明的可调控原花青素物质合成的表达载体
本组实施例提供一种可调控原花青素物质合成的表达载体。本组所有的实施例都具备如下共同特征：连接有第1组实施例任一项所提供的原花青素物质调控因子NtMYB330的基因序列。
优选地，所述可调控原花青素物质合成的表达载体指，在表达载体上连接了所述原花青素物质调控因子NtMYB330的基因序列；
优选地，所述表达载体选自：pK2GW7载体；
优选地，所述对原花青素物质合成的调控为正调控；
优选地，所述原花青素物质：包括儿茶酸、表儿茶酸；
优选地，所述正调控指使原花青素物质含量优选提高3倍以上。
第3组实施例、本发明的可调控原花青素物质合成的转化体
本组实施例提供一种可调控原花青素物质合成的转化体。本组所有的实施例都具备如下共同特征：可调控原花青素物质合成的转化体中转化有第2组实施例任意一项所提供的一种可调控原花青素物质合成的表达载体。
优选地，所述可调控原花青素物质合成的转化体指，宿主细胞中转化有所述可调控原花青素物质合成的表达载体；
优选地，所述宿主细胞选自：植物细胞或微生物细胞；
优选地，所述植物选自：拟南芥、烟草；
优选地，所述微生物选自：大肠杆菌、农杆菌。
本领域技术人员根据本发明的教导，可尝试将本发明的原花青素物质调控因子NtMYB330、可调控原花青素物质合成的表达载体、可调控原花青素物质合成的转化体通过本领域常规的转基因操作对除拟南芥、烟草以外的其它植物进行转基因，即，在除拟南芥、烟草以外的其它植物中转入原花青素物质调控因子NtMYB330的基因过表达载体，理论上可取得与本发明转基因烟草类似的正向调控原花青素物质(儿茶酸、表儿茶酸)的效果。第4组实施例、本发明的可调控原花青素物质合成的试剂盒
本组实施例提供一种可调控原花青素物质合成的试剂盒。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述试剂盒包括：第1组实施例任一项所提供的原花青素物质调控因子NtMYB330、和/或，第2组实施例任一项所提供的一种可调控原花青素物质合成的表达载体、和/或，第3组实施例任一项所提供的一种可调控原花青素物质合成的转化体。
在进一步的实施例中，所述的一种可调控原花青素物质合成的试剂盒还包括：原花青素物质调控因子NtMYB330的基因序列的扩增引物、PCR常用试剂、连接转化常用试剂、转基因常用试剂；
优选地，所述原花青素物质调控因子NtMYB330的基因序列的扩增引物包括：
正向引物NtMYB330-BamH I:5’-GGATCCATGGGAAGAAAGCCTTGTTGTTC-3’，
反向引物NtMYB330-Xho I：5’-CTCGAGTCAAGAGGAGAACCCATTAATCC-3’；
优选地，所述PCR常用试剂包括：DNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液、双蒸水；
在一些具体的实施例中，所述DNA聚合酶优选
Figure BDA0003219419340000111
High-Fidelity DNAPolymerase，所述PCR缓冲液优选5×Phusion HF反应缓冲液；
优选地，所述连接转化常用试剂包括：限制性内切酶、连接缓冲液、表达载体、蛋白酶、感受态细胞、培养基；
优选地，所述限制性内切酶优选BamH I、Xho I；所述LR反应体系优选CloneaseTMⅡenzyme Mix；所述连接缓冲液优选TE Buffer；所述蛋白酶优选Proteinase K；
优选地，所述表达载体选自：pK2GW7载体；基于本领域的技术常识，结合本发明的教导，本领域技术人员可根据实际生产的需要，选择使用其它本领域常见的表达载体。
优选地，所述感受态细胞选自：大肠杆菌感受态细胞、农杆菌感受态细胞；基于本领域的技术常识，结合本发明的教导，本领域技术人员可根据实际生产的需要，选择使用其它本领域常见的感受态细胞。感受态细胞在生物学本质上也是表达载体的宿主细胞。
优选地，所述培养基选自LB培养基。
第5组实施例、本发明的一种可调控原花青素物质合成的方法
本组实施例提供一种可调控原花青素物质合成的方法。本组所有的实施例都具备如下共同特征：在植物体内过表达第1组实施例任一项所提供的原花青素物质调控因子NtMYB330、和/或，在植物体内转化第2组实施例任一项所提供的一种可调控原花青素物质合成的表达载体、和/或，用第3组实施例任一项所提供的一种可调控原花青素物质合成的转化体侵染植物。
在具体的实施例中，所述的一种可调控原花青素物质合成的方法包括：PCR扩增所述原花青素物质调控因子NtMYB330的基因序列得到PCR扩增产物；
优选地，所述PCR扩增体系包括：4ng/μL植物的cDNA，5×Phusion HF反应缓冲液0.2μL/μL，0.2mM dNTP，0.04U/μL的
Figure BDA0003219419340000121
High-Fidelity DNA Polymerase，0.2μM的正反向引物，其余为水；
优选地，所述正反向引物包括：
正向引物NtMYB330-BamH I:5’-GGATCCATGGGAAGAAAGCCTTGTTGTTC-3’，
反向引物NtMYB330-Xho I：5’-CTCGAGTCAAGAGGAGAACCCATTAATCC-3’；
优选地，所述PCR扩增程序包括：98℃，30秒；以98℃，7秒；62℃，30秒；72℃，45秒为1个循环，共35个循环；72℃延伸7分钟；
优选地，所述方法还包括：将所述PCR扩增产物与表达载体连接得到所述可调控原花青素物质合成的表达载体；
优选地，所述连接指将连接有原花青素物质调控因子NtMYB330的基因序列的表达载体pENTRTMNtMYB330通过LR反应进一步连接得到可调控原花青素物质合成的表达载体pK2GW7-NtMYB330；
优选地，所述LR反应的体系包括：6.25ng/μL-18.75ng/μL的pENTRTMNtMYB330，0.0625μL/μL的连接载体，其余为TE Buffer；
优选地，所述LR反应的步骤包括：连接反应体系混匀，冰浴2min，混匀；加入0.2μL/μL LR CloneaseTMⅡenzyme Mix，混匀，离心，25℃水浴1h；然后加入0.9μL/μL ProteinaseK，混匀，37℃水浴10min；所述混匀方式优选轻弹；
优选地，所述方法还包括：将可调控原花青素物质合成的表达载体pK2GW7-NtMYB330转化至感受态细胞得到可调控原花青素物质合成的转化体；
优选地，所述方法还包括：将可调控原花青素物质合成的转化体侵染植物细胞；
优选地，所述感受态细胞为农杆菌感受态细胞；所述可调控原花青素物质合成的转化体指含有可调控原花青素物质合成的表达载体pK2GW7-NtMYB330的农杆菌克隆；
优选地，所述植物优选烟草；
优选地，所述对原花青素物质合成的调控为正调控；
优选地，所述原花青素物质：包括儿茶酸、表儿茶酸；
优选地，所述正调控指使原花青素物质含量优选提高3倍以上。
本发明最具体的实施例如下所述：
本发明所述的烟草花中原花青素合成正向调控基因NtMYB330的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
所述的烟草花中原花青素合成正向调控基因NtMYB330编码的氨基酸序列如SEQID NO：2所示。
本发明所述的烟草花中原花青素合成正向调控基因NtMYB330的克隆方法，其特征在于包括以下步骤：
A、提取烟草花组织RNA，反转录得到第一链cDNA；
B、根据NtMYB330基因序列设计合成特异性引物，以反转录得到的第一链cDNA作为模板，进行PCR扩增，回收和纯化PCR产物；
C、纯化扩增产物通过试剂盒反应与TOPO载体连接，连接体系与过程如下：4μL纯化产物、1μL salt solution、1μL
Figure BDA0003219419340000133
-BluntⅡ-TOPO混匀，25℃，水浴30min；将连好的载体通过热激转化进入大肠杆菌DH5α，加液体培养基振荡培养后涂布至含100mg/L卡那霉素的LB平板上过夜培养，挑取菌落进行菌液培养，质粒提取和PCR检测。筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序。
B步骤中PCR扩增的反应体系是选用Phusion高保真扩增酶反应体系，体系总体积50μL，包括：200ng cDNA，5×Phusion HF反应缓冲液10μL，10mM dNTP 1μL，2U的
Figure BDA0003219419340000131
High-Fidelity DNA Polymerase，10μM的正反向引物各1μL，补水至50μL。
B步骤中PCR扩增的反应条件是在
Figure BDA0003219419340000132
pro扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，7秒；62℃，30秒；72℃，45秒；35个循环；72℃延伸7分钟。
本发明所述的烟草花中原花青素物质合成正向调控基因NtMYB330的应用为所述的烟草花中原花青素物质合成正向调控基因NtMYB330在用于获得烟草花中原花青素物质含量显著提高的转基因植株中的应用。
所述获得烟草花中原花青素物质含量显著提高的转基因植株的方法包括以下步骤：
A、过表达克隆载体的构建：
1、克隆的NtMYB330连接TOPO载体
(1)以烟草品种云烟87的花组织的cDNA为模板，利用NtMYB330基因特异引物进行扩增，得到大小约为1.2kb的基因片段，纯化回收；
(2)将回收的NtMYB330基因片段进行TOPO克隆，连接到
Figure BDA0003219419340000141
-BluntⅡ-TOPO(3.5kb)载体后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒进行PCR检测，挑选扩增产物大小约为1.2kb的质粒提取DNA，构建的载体命名为pTOPO-NtMYB330；
(3)由于基因上下游引物分别带有BamH I、Xho I的识别位点，因此选择这两个酶对PCR检测正确的质粒样品进行双酶切检测，酶切结果产生两条片段，大小分别为3.5kb和1.2kb左右，说明目的片段已插入TOPO载体，将目的基因片段(1.2kb)胶回收。
2、植物过表达载体的构建
a、入门克隆pENTRTM2B-NtMYB330的构建
(1)BamH I/Xho I酶切pTOPO-NtMYB330和pENTRTM2B，得到目的基因片段NtMYB330和载体pENTRTM2B线性化片段，胶回收后进行连接、转化感受态细胞DH5α；
(2)挑取转化DH5α后的克隆，提取质粒DNA，BamH I/Xho I酶切，酶切结果为3.5kb的载体片段和1.2kb左右的片段为正确的克隆，正确的克隆命名为pENTRTM2B-NtNtMYB330；
b、通过LR反应得到植物表达载体
(1)入门克隆pENTRTMNtMYB330和表达载体pK2GW7 LR反应后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到植物表达载体pK2GW7-NtMYB330。利用BamH I/Xho I酶切鉴定pK2GW7-NtMYB330，正确的克隆可以切出两条片段大约1.2kb和11kb。
上述LR反应体系：构建成功的入门载体pENTRTMNtMYB330(50-150ng)1-7μL，0.5μLDestination Vector，TE Buffer至总体积8μL；混匀，冰浴2min，轻弹2次；加入2μL LRCloneaseTMⅡenzyme Mix，轻弹，混匀，离心，25℃水浴1h；然后加入1μL Proteinase K轻弹，混匀，37℃水浴10min。
B、烟草的遗传转化：
(1)表达载体转化农杆菌
从-80℃冰箱中取出农杆菌感受态细胞，放置冰上溶解后加入4μL重组表达载体pK2GW7-NtMYB330；液氮速冻1分钟，转入37℃水浴5分钟，再冰浴2分钟，向混合物中加入1mLLB液体培养基，28℃、220rpm培养3-4小时；培养物涂布于含有壮观霉素100mg/L和利福平25mg/L的LB固体培养基上，28℃倒置培养2-3天，可见含有目的载体的农杆菌克隆；
(2)烟草转化
a、挑取含有目标载体的农杆菌克隆，在含有壮观霉素和利福平的LB平板上划线，28℃培养2-3天；刮取划线菌斑接菌于含有壮观霉素和利福平的MS培养基中，28℃，220rpm振荡培养，菌液浓度达到OD＝0.5-0.8时6,000rpm离心5分钟富集菌体，弃上清，再用20mL液体MS培养基重悬菌体，得到含目标载体的农杆菌悬浮菌液；
b、将烟草叶片置于500mL广口瓶中，加入适量75％乙醇，漂洗1min；弃乙醇，加入0.1％的HgCl2溶液，置摇床上室温振荡15～30分钟；弃HgCl2溶液，用无菌水冲洗6遍；
c、将烟草叶片取出，用无菌吸水纸吸去表面液体，使用剪刀将无菌叶片切成约1cm×1cm的小片，将切成小片的烟草叶片放入含目标载体的无菌MS液体培养基悬浮菌液中，静置15～20min；取出烟草叶片，使用无菌滤纸吸去多余菌液，于含有6-BA(0.02mg/L)、NAA(2mg/L)的MS培养基中25℃暗培养两天；随后，把烟草叶片转入分化培养基中，切口接触培养基，于温室条件下分化培养；分化培养基为含有6-BA(0.5mg/L)、NAA(0.1mg/L)、卡那霉素(100mg/L)、头孢霉素(500mg/L)的MS培养基，每2-3周继代培养1次，切口处逐渐长出愈伤组织，最终分化出芽；
d、将长至3-5cm的芽切下，转入MS培养基诱导生根，取出生根后的转基因植株用自来水洗净培养基，移植于灭菌的营养土中；
e、转基因植株经NPTII基因特异引物：
NPTII-F:5’-TCGGCTATGACTGGGCACAACAGA-3’(SEQ ID NO.5)，
NPTII-R:5’-AAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCG-3’(SEQ ID NO.6)PCR验证扩增，鉴定转基因阳性植株。
下面以具体实验例对本发明做进一步说明：
实验例1、NtMYB330基因的分离克隆，包括以下几个步骤：
1、确定NtMYB330基因序列：
通过转录组测序获得与类黄酮物质合成途径结构基因共表达的若干MYB转录因子，其中NtMYB330基因编码的蛋白质序列与其他已知调控功能的植物R2R3-MYB转录因子的蛋白序列的同源性分析暗示NtMYB330属于原花青素调控因子进化分支二。根据该基因序列设计基因克隆引物进行PCR反应，得到目的产物；
正向引物NtMYB330-BamH I:5’-GGATCCATGGGAAGAAAGCCTTGTTGTTC-3’(SEQ IDNO.3)，
反向引物NtMYB330-Xho I：5’-CTCGAGTCAAGAGGAGAACCCATTAATCC-3’(SEQ IDNO.4)。
为了构建过表达载体，在上述引物中引物酶切位点(下划线所示)BamH I和Xho I；
2、使用Trizol试剂盒(Invitrogen)提取烟草品种云烟87的花组织的RNA，按试剂盒提供的说明书进行操作。
3、以反转录得到的第一链cDNA作为模板，用引物NtMYB330-BamH I F/NtMYB330-Xho I R对进行PCR扩增，选用Phusion高保真扩增酶反应体系，体系总体积50μL，包括：200ng cDNA，5×Phusion HF反应缓冲液10μL，10mM dNTP 1μL，2U的
Figure BDA0003219419340000161
High-Fidelity DNA Polymerase，10μM的正反向引物各1μL，补水至50μL。PCR反应在
Figure BDA0003219419340000162
pro扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，7秒；62℃，30秒；72℃，45秒；35个循环；72℃延伸7分钟。回收和纯化PCR产物。PCR扩增产物的电泳图如图1所示。
4、纯化扩增产物与载体连接：连接体系与过程如下：4μL纯化产物、1μL saltsolution、1μL
Figure BDA0003219419340000163
-BluntⅡ-TOPO(Invitrogen)混匀，25℃，水浴30min；将连接好的载体通过热激转化大肠杆菌DH5α，加液体培养基振荡培养后涂布至含100mg/L卡那霉素的LB平板上过夜培养，挑取菌落进行菌液培养，质粒提取和PCR检测。筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序。
步骤4中所述的培养基配方及制备方法是称取胰蛋白胨8-12g，酵母提取物5g，NaCl 10g溶解于1L蒸馏水中，121℃灭菌25min得到。
实验例2、过表达载体构建
1、克隆的NtMYB330连接TOPO载体
(1)以烟草品种云烟87的花组织的cDNA为模板，利用NtMYB330基因特异引物进行扩增，得到大小约为1.2kb的基因片段，纯化回收；
(2)将回收的NtMYB330基因片段进行TOPO克隆，连接到
Figure BDA0003219419340000164
-BluntⅡ-TOPO(3.5kb)载体后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒进行PCR检测，挑选扩增产物大小约为1.2kb的质粒提取DNA，构建的载体命名为pTOPO-NtMYB330；
(3)由于基因正反游引物分别带有BamH I、Xho I的识别位点，因此选择这两个酶对质粒DNA样品进行双酶切检测，酶切结果产生两条片段，大小分别为3.5kb和1.2kb左右，说明目的片段已插入TOPO载体；
2、植物过表达载体的构建
a、入门克隆pENTRTM2B-NtMYB330的构建
(1)BamH I/Xho I酶切pTOPO-NtMYB330和pENTRTM2B，得到目的基因片段NtMYB330和载体pENTRTM2B线性化片段，胶回收后进行连接、转化感受态细胞DH5α；
(2)挑取转化DH5α后的克隆，提取质粒DNA，BamH I/Xho I酶切，酶切结果为3.8kb的载体片段和1.2kb左右的片段为正确的克隆，正确的克隆命名为pENTRTM2B-NtNtMYB330；
b、通过LR反应得到植物表达载体
(1)入门克隆pENTRTMNtMYB330和表达载体pK2GW7 LR反应后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到植物表达载体pK2GW7-NtMYB330。利用BamH I/Xho I酶切鉴定pK2GW7-NtMYB330，正确的克隆可以切出两条片段，大小约1.2kb和11kb。
上述LR反应体系：构建成功的入门载体pENTRTMNtMYB330(50-150ng)1-7μL，0.5μLDestination Vector(即pK2GW7载体)，TE Buffer至总体积8μL；混匀，冰浴2min，轻弹2次；加入2μL LR CloneaseTMⅡenzyme Mix，轻弹，混匀，离心，25℃水浴1h；然后加入1μLProteinase K轻弹，混匀，37℃水浴10min。
实验例3、烟草的遗传转化
(1)表达载体转化农杆菌
从-80℃冰箱中取出农杆菌感受态细胞，放置冰上溶解后加入4μL重组表达载体pK2GW7-NtMYB330；液氮速冻1分钟，转入37℃水浴5分钟，再冰浴2分钟，向混合物中加入1mLLB液体培养基，28℃、220rpm培养3-4小时；培养物涂布于含有壮观霉素100mg/L和利福平25mg/L的LB固体培养基上，28℃倒置培养2-3天，可见含有目的载体的农杆菌克隆；
(2)烟草转化
a、挑取含有目标载体的农杆菌克隆，在含有壮观霉素和利福平的LB平板上划线，28℃培养2-3天；刮取划线菌斑接菌于含有壮观霉素和利福平的MS培养基中，28℃，220rpm振荡培养，菌液浓度达到OD＝0.5-0.8时6,000rpm离心5分钟富集菌体，弃上清，再用20mL液体MS培养基重悬菌体，得到含目标载体的农杆菌悬浮菌液；
b、将烟草叶片置于500mL广口瓶中，加入适量75％乙醇，漂洗1min；弃乙醇，加入0.1％的HgCl2溶液，置摇床上室温振荡15～30分钟；弃HgCl2溶液，用无菌水冲洗6遍；
c、将烟草叶片取出，用无菌吸水纸吸去表面液体，使用剪刀将无菌叶片切成约1cm×1cm的小片，将切成小片的烟草叶片放入含目标载体的无菌MS液体培养基悬浮菌液中，静置15-20min；取出烟草叶片，使用无菌滤纸吸去多余菌液，于含有6-BA(0.02mg/L)、NAA(2mg/L)的MS培养基中25℃暗培养两天；随后，把烟草叶片转入分化培养基中，切口接触培养基，于温室条件下分化培养；分化培养基为含有6-BA(0.5mg/L)、NAA(0.1mg/L)、卡那霉素(100mg/L)、头孢霉素(500mg/L)的MS培养基，每2-3周继代培养1次，切口处逐渐长出愈伤组织，最终分化出芽；
d、将长至3-5cm的芽切下，转入MS培养基诱导生根，取出生根后的转基因植株用自来水洗净培养基，移植于灭菌的营养土中；
e、转基因植株经NPTII基因特异引物：
NPTII-F:5’-TCGGCTATGACTGGGCACAACAGA-3’(SEQ ID NO.5)，
NPTII-R:5’-AAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCG-3’(SEQ ID NO.6)
PCR验证扩增，鉴定转基因阳性植株。菌落PCR检测结果如图2所示。
(3)基因组织特异性表达分析实验
种植栽培烟草云烟87，开花提取根、茎、叶片、花、种子RNA，反转录得到第一链cDNA。根据NtMYB330基因序列设计qRT-PCR引物：
NtMYB330-F:5’-GGATCCATGGGAAGAAAGCCTTGTTGTTC-3’(SEQ ID NO.3)，
NtMYB330-R:5’-CTCGAGTCAAGAGGAGAACCCATTAATCC-3’(SEQ ID NO.4)。
以烟草Actin基因作为内参，Actin-F：CTGAGGTCCTTTTCCAACCA和Actin-R：TACCCGGGAACATGGTAGAG。以种子cDNA为模板进行荧光定量PCR，反应在Roche LightCycler480上利用LightCycler 480SYBR Green I master进行，20μL体系含有10μLLightCycler480SYBR Green I master(2×)，正反引物各1μL(10μmol/L)，cDNA 1μL(反转录产物稀释4倍)，7μL灭菌蒸馏水。反应程序如下：98℃预变性30s；98℃变性7s，62℃退火30s，72℃延伸45s；35个循环。荧光定量PCR结果采用2-△△Ct方法计算NtMYB330基因的相对表达量。每个处理设3个生物学重复，由Excel软件绘制柱状图(图3)。本发明的NtMYB330基因组织特异性表达分析结果如图3所示，该基因在烟草的根、花、种子等组织中表达量较高。
实验例4、转基因植株分析
T2代转基因株系提取总RNA，利用TaKaRa公司PrimeScriptTM RT reagent Kit反转录试剂盒合成cDNA作为模板进行实时荧光定量PCR分析，对获得的过表达(OE)株系，进行表型分析(图4)。T2代转基因株系实验结果表明，NtMYB330基因过表达株系与空载体对照相比，获得的转基因植株花中的儿茶酸含量平均提高431.5％；表儿茶酸含量平均提高406.5％ (图5)。
SEQUENCE LISTING
<110> 云南省烟草农业科学研究院
<120> 一种原花青素物质调控因子NtMYB330及其表达载体、转化体、试剂盒与方法
<130> P210400/YCN
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1164
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 烟草Nicotiana tabacum L.原花青素物质调控因子基因NtMYB330
<400> 1
atgggaagaa agccttgttg ttctaaagaa ggattaaaca aaggggcatg gactcctatg 60
gaggataaaa ttctaataga ttatatcaaa gtaaatggtg aagggaaatg gagaaatctt 120
cccaaaagag ctggtcttaa aagatgtgga aagagttgca gactaaggtg gctgaattat 180
ctaaggccag acattaagag gggaaatata actccagatg aagaagatct cattatcaga 240
cttcataaac ttcttggaaa tagatggtct ctgatagctg gaaggttacc agaacgaaca 300
gacaatgaaa tcaagaatta ttggaacaca aacatcggca aaaaactaca acaaggagtt 360
gctcctggtc agccaaaccg cataatatct tccattaatc gtcagcgccc tcgttctagt 420
catgccaaat cttccaagtc cgacccagtt acccaaccaa acaaaaataa tcaagaacac 480
acagttccta atcaggattc acagtatttg ctaacagacg ttggattcgg aggatcatcg 540
tcttcttcat ccccgtgttt ggttatccgc acaaaggcaa ttaggtgcac taaagttttt 600
attactcctc ctcctactag tagttcggtt gctgagccac agaatgttga tcagtctcac 660
aatgagattg ctcaaagggc tagtaattct cactcagtct tcccaccttg caccaggaat 720
cccgttgagt tcttacgctt tcatgttgac aactcaattc ttgataatga taacgatgac 780
aaggtaatgg cggaggattt gacaatagaa aatgcaaata ctattgtagc atcgtcctca 840
tcatcgtcat cattatcagt gtcatctttg tccgagcagc aacaaccaat atcaggatca 900
acaccaactt tctctggaga attggaaaat tataacttta attttatgtt tggttttgat 960
atggacgatc cttttctttc tgagcttcta aatgcacctg atatatgtga aaacttggag 1020
aatacaacta ctgttggaga tagttgcagc aaaaacgaaa aggaaaggag ctatttccct 1080
tcgaattata gtcaaacaac attgttcgca gaagatacgc aacacaacga tttggaactt 1140
tggattaatg ggttctcctc ttga 1164
<210> 2
<211> 387
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 烟草Nicotiana tabacum L.原花青素物质调控因子NtMYB330
<220>
<221> REPEAT
<222> (11)..(63)
<223> R2重复序列
<220>
<221> REPEAT
<222> (64)..(115)
<223> R3重复序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (76)..(95)
<223> [DE]Lx2[RK]x3Lx6Lx3R结构域
<220>
<221> misc_feature
<222> (188)..(197)
<223> VI[R/P]TKAx1RC[S/T]结构域
<400> 2
Met Gly Arg Lys Pro Cys Cys Ser Lys Glu Gly Leu Asn Lys Gly Ala
1 5 10 15
Trp Thr Pro Met Glu Asp Lys Ile Leu Ile Asp Tyr Ile Lys Val Asn
20 25 30
Gly Glu Gly Lys Trp Arg Asn Leu Pro Lys Arg Ala Gly Leu Lys Arg
35 40 45
Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Leu Asn Tyr Leu Arg Pro Asp
50 55 60
Ile Lys Arg Gly Asn Ile Thr Pro Asp Glu Glu Asp Leu Ile Ile Arg
65 70 75 80
Leu His Lys Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Leu
85 90 95
Pro Glu Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Thr Asn Ile
100 105 110
Gly Lys Lys Leu Gln Gln Gly Val Ala Pro Gly Gln Pro Asn Arg Ile
115 120 125
Ile Ser Ser Ile Asn Arg Gln Arg Pro Arg Ser Ser His Ala Lys Ser
130 135 140
Ser Lys Ser Asp Pro Val Thr Gln Pro Asn Lys Asn Asn Gln Glu His
145 150 155 160
Thr Val Pro Asn Gln Asp Ser Gln Tyr Leu Leu Thr Asp Val Gly Phe
165 170 175
Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Pro Cys Leu Val Ile Arg Thr Lys
180 185 190
Ala Ile Arg Cys Thr Lys Val Phe Ile Thr Pro Pro Pro Thr Ser Ser
195 200 205
Ser Val Ala Glu Pro Gln Asn Val Asp Gln Ser His Asn Glu Ile Ala
210 215 220
Gln Arg Ala Ser Asn Ser His Ser Val Phe Pro Pro Cys Thr Arg Asn
225 230 235 240
Pro Val Glu Phe Leu Arg Phe His Val Asp Asn Ser Ile Leu Asp Asn
245 250 255
Asp Asn Asp Asp Lys Val Met Ala Glu Asp Leu Thr Ile Glu Asn Ala
260 265 270
Asn Thr Ile Val Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Ser Val Ser
275 280 285
Ser Leu Ser Glu Gln Gln Gln Pro Ile Ser Gly Ser Thr Pro Thr Phe
290 295 300
Ser Gly Glu Leu Glu Asn Tyr Asn Phe Asn Phe Met Phe Gly Phe Asp
305 310 315 320
Met Asp Asp Pro Phe Leu Ser Glu Leu Leu Asn Ala Pro Asp Ile Cys
325 330 335
Glu Asn Leu Glu Asn Thr Thr Thr Val Gly Asp Ser Cys Ser Lys Asn
340 345 350
Glu Lys Glu Arg Ser Tyr Phe Pro Ser Asn Tyr Ser Gln Thr Thr Leu
355 360 365
Phe Ala Glu Asp Thr Gln His Asn Asp Leu Glu Leu Trp Ile Asn Gly
370 375 380
Phe Ser Ser
385
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 正向引物NtMYB330-BamH I
<400> 3
ggatccatgg gaagaaagcc ttgttgttc 29
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 反向引物NtMYB330-Xho I
<400> 4
ctcgagtcaa gaggagaacc cattaatcc 29
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物NPTII-F
<400> 5
tcggctatga ctgggcacaa caga 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物NPTII-R
<400> 6
aagaaggcga tagaaggcga tgcg 24

Claims (10)

1.一种原花青素物质调控因子NtMYB330，其特征在于，其氨基酸序列中包含：R2重复序列、R3重复序列、[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R结构域、VI[R/P]TKAx1RC[S/T]结构域。
2.根据权利要求1所述的原花青素物质调控因子NtMYB330，其特征在于，其氨基酸序列从氨基端到羧基端依次包括R2重复序列、R3重复序列、[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R结构域、VI[R/P]TKAx1RC[S/T]结构域；
优选地，所述[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R结构域位于R3重复序列里面；
优选地，所述[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R结构域位于R3重复序列的第12位氨基酸后面；
优选地，所述原花青素物质调控因子NtMYB330的氨基酸序列第11-63位氨基酸为R2重复序列；
优选地，所述原花青素物质调控因子NtMYB330的氨基酸序列第64-115位氨基酸为R3重复序列；
优选地，所述原花青素物质调控因子NtMYB330的氨基酸序列第188-197位氨基酸为VI[R/P]TKAx1RC[S/T]结构域；
优选地，所述原花青素物质调控因子NtMYB330的氨基酸序列第76-95位氨基酸为[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R结构域。
3.根据权利要求1或2所述的原花青素物质调控因子NtMYB330，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
4.根据权利要求3所述的原花青素物质调控因子NtMYB330，其特征在于，其基因序列如SEQ ID NO：1所示；
优选地，所述原花青素物质调控因子NtMYB330为烟草Nicotiana tabacum L.原花青素物质调控因子NtMYB330。
5.一种可调控原花青素物质合成的表达载体，其特征在于，连接有权利要求1-4任一所述的原花青素物质调控因子NtMYB330的基因序列。
优选地，所述可调控原花青素物质合成的表达载体指，在表达载体上连接了所述原花青素物质调控因子NtMYB330的基因序列；
优选地，所述表达载体选自：pK2GW7载体；
优选地，所述调控为正调控；
优选地，所述原花青素物质包括儿茶酸、表儿茶酸；
优选地，所述正调控指使原花青素物质含量优选提高3倍以上。
6.一种可调控原花青素物质合成的转化体，其特征在于，转化有权利要求5所述的一种可调控原花青素物质合成的表达载体。
优选地，所述可调控原花青素物质合成的转化体指，宿主细胞中转化有所述可调控原花青素物质合成的表达载体；
优选地，所述宿主细胞选自：植物细胞或微生物细胞；
优选地，所述植物为烟草；
优选地，所述微生物选自：大肠杆菌、农杆菌。
7.一种可调控原花青素物质合成的试剂盒，其特征在于，包括：权利要求1-4任一所述的原花青素物质调控因子NtMYB330、和/或，权利要求5所述的一种可调控原花青素物质合成的表达载体、和/或，权利要求6所述的一种可调控原花青素物质合成的转化体。
8.根据权利要求7所述的一种可调控原花青素物质合成的试剂盒，其特征在于，还包括：原花青素物质调控因子NtMYB330的基因序列的扩增引物、PCR常用试剂、连接转化常用试剂、转基因常用试剂；
优选地，所述原花青素物质调控因子NtMYB330的基因序列的扩增引物包括：
正向引物NtMYB330-BamH I:5’-GGATCCATGGGAAGAAAGCCTTGTTGTTC-3’，
反向引物NtMYB330-Xho I：5’-CTCGAGTCAAGAGGAGAACCCATTAATCC-3’；
优选地，所述PCR常用试剂包括：DNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液、双蒸水；
所述DNA聚合酶优选
Figure FDA0003219419330000021
High-Fidelity DNA Polymerase，所述PCR缓冲液优选5×Phusion HF反应缓冲液；
优选地，所述连接转化常用试剂包括：限制性内切酶、连接缓冲液、表达载体、蛋白酶、感受态细胞、培养基；
优选地，所述限制性内切酶优选BamH I、Xho I；所述限制性内切酶优选CloneaseTMⅡenzyme Mix；所述连接缓冲液优选TE Buffer；所述蛋白酶优选Proteinase K；
优选地，所述表达载体选自：pK2GW7载体；
优选地，所述感受态细胞选自：大肠杆菌感受态细胞、农杆菌感受态细胞；
优选地，所述培养基选自LB培养基。
9.一种可调控原花青素物质合成的方法，其特征在于，在植物体内过表达权利要求1-4任一所述的原花青素物质调控因子NtMYB330、和/或，在植物体内转化权利要求5所述的一种可调控原花青素物质合成的表达载体、和/或，用权利要求6所述的一种可调控原花青素物质合成的转化体侵染植物。
10.根据权利要求9所述的一种可调控原花青素物质合成的方法，其特征在于，包括：PCR扩增所述原花青素物质调控因子NtMYB330的基因序列得到PCR扩增产物；
优选地，所述PCR扩增体系包括：4ng/μL植物的cDNA，5×Phusion HF反应缓冲液0.2μL/μL，0.2mM dNTP，0.04U/μL的
Figure FDA0003219419330000031
High-Fidelity DNA Polymerase，0.2μM的正反向引物，其余为水；
优选地，所述正反向引物包括：
正向引物NtMYB330-BamH I:5’-GGATCCATGGGAAGAAAGCCTTGTTGTTC-3’，
反向引物NtMYB330-Xho I：5’-CTCGAGTCAAGAGGAGAACCCATTAATCC-3’；
优选地，所述PCR扩增程序包括：98℃，30秒；以98℃，7秒；62℃，30秒；72℃，45秒为1个循环，共35个循环；72℃延伸7分钟；
优选地，所述方法还包括：将所述PCR扩增产物与表达载体连接得到所述可调控原花青素物质合成的表达载体；
优选地，所述连接指将连接有原花青素物质调控因子NtMYB330的基因序列的表达载体pENTRTMNtMYB330通过LR反应进一步连接得到可调控原花青素物质合成的表达载体pK2GW7-NtMYB330；
优选地，所述LR反应的体系包括：6.25ng/μL-18.75ng/μL的pENTRTMNtMYB330，0.0625μL/μL的连接载体，其余为TE Buffer；
优选地，所述LR反应的步骤包括：连接反应体系混匀，冰浴2min，混匀；加入0.2μL/μLLR CloneaseTMⅡ enzyme Mix，混匀，离心，25℃水浴1h；然后加入0.9μL/μL Proteinase K，混匀，37℃水浴10min；所述混匀方式优选轻弹；
优选地，所述方法还包括：将可调控原花青素物质合成的表达载体pK2GW7-NtMYB330转化至感受态细胞得到可调控原花青素物质合成的转化体；
优选地，所述方法还包括：将可调控原花青素物质合成的转化体侵染植物细胞；
优选地，所述感受态细胞为农杆菌感受态细胞；所述可调控原花青素物质合成的转化体指含有可调控原花青素物质合成的表达载体pK2GW7-NtMYB330的农杆菌克隆；
优选地，所述植物优选烟草；
优选地，所述调控为正调控；
优选地，所述原花青素物质：包括儿茶酸、表儿茶酸；
优选地，所述正调控指使原花青素物质含量优选提高3倍以上。
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