CN107698673A

CN107698673A - 红掌AaMYB3转录因子及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN107698673A
Application number: CN201711202153.4A
Authority: CN
Inventors: 李崇晖; 黄素荣; 杨光穗; 尹俊梅
Original assignee: Tropical Crops Genetic Resources Institute CATAS
Current assignee: Tropical Crops Genetic Resources Institute CATAS
Priority date: 2017-11-27
Filing date: 2017-11-27
Publication date: 2018-02-16
Anticipated expiration: 2037-11-27
Also published as: CN107698673B

Abstract

本发明公开了红掌AaMYB3转录因子及其编码基因与应用。本发明所提供的红掌AaMYB3转录因子是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与原花青素合成相关的由a)衍生的蛋白质。本发明所提供的转录因子AaMYB3是从红掌中获得的，属于调控原花青素合成的MYB转录因子家族。通过反转录RT‑PCR，获得了该基因的完整编码框，随后构建超量表达载体并异源转化烟草进行稳定表达，发现该转录因子具有促进原花青素积累的能力。

Description

红掌AaMYB3转录因子及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及红掌AaMYB3转录因子及其编码基因与应用。

背景技术

原花青素(proanthocyanidins)又称缩合单宁，是一类重要的次生代谢产物，属于类黄酮类物质，其大部分的生物合成途径与花青素共享。原花青素由2,3-trans-(+)-黄烷-3-醇(如儿茶素)或2,3-cis-(-)-黄烷-3-醇(如表儿茶素)聚合而成，通常以寡聚物或者多聚物形式存在，在植物体内的生理功能与其他类黄酮化合物类似，主要起到抗氧化、增强抵抗生物胁迫和非生物胁迫的作用。原花青素与花青素类似，在植物体内的代谢受多方面因素调节：首先，其代谢具有严格的时间和组织特异性特征，其次，其代谢受非生物因素(如温度、光照、营养状况)的影响，最后，其代谢与生物胁迫(如害虫或病害)相关。这些因素对原花青素的影响主要表现为影响代谢途径中酶基因上游的转录因子的转录或翻译。

调控原花青素生物合成的转录因子种类众多，其中研究的最广泛、最清楚的有三类，MYB、bHLH和WD40，三者形成复合体，结合到酶基因启动子的顺式作用原件上，从而调控酶基因的转录。拟南芥中原花青素生物合成的转录调控已被广泛研究。AtTT2/AtMYB123(R2R3-MYB)、AtTT8/AtbHLH042(R/b-like bHLH)和AtTTG1(WD40)，三者形成复合体调控原花青素合成途径上的靶基因如BAN/ANR。鉴于原花青素的重要生理功能，在其他植物如饲料作物苜蓿、三叶草，作物类大麦、蔓豆，水果类葡萄、草莓、苹果、桃等植物中，原花青素的代谢调控也有较好的研究。然而目前在观赏植物中的相关研究十分有限。

红掌(Anthurium andraeanum Hort.)原产于中南美洲热带雨林，是热带盆花和切花中的名品。近年来我国红掌产业发展迅速，已成为世界级主产地和消费市场。然而生产中高度依赖荷兰等国进口品种，这些在现代化设施中选育的品种在我国不同的栽培条件下表现出适应性问题，例如不耐受夏季高温高湿、冬季低温、病虫害等威胁红掌生产的问题，严重影响红掌产量和观赏品质，急需开展适应我国气候和栽培条件的红掌抗性新品种的选育。增加植物本体的次生代谢产物积累是提高其抗性的有效手段之一，其中通过调控植物类黄酮类生物合成的途径研究和应用最广。红掌中调控花青素合成的转录因子已被鉴定，然而关于红掌原花青素生物合成的转录调控研究尚未报道。

发明内容

本发明所提供的红掌MYB转录因子，名称为AaMYB3，来源于红掌品种Anthurium‘Tropical’。

本发明所提供的红掌转录因子AaMYB3，是如下a)或b)的蛋白质：

a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与原花青素合成相关的由a)衍生的蛋白质。

序列1由297个氨基酸序列组成，此氨基酸序列具有保守的R2R3重复序列。

所述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述编码基因为如下1)或2)或3)或4)所示：

1)其核苷酸序列是序列表中序列2所示DNA分子；

2)其核苷酸序列是序列表中序列3所示DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA分子具有90％以上的同源性的DNA分子。

全长的cDNA为899bp，如序列表中序列2所示；其中，序列表中序列2自5’末端第1位到第891位为开放阅读框，开放阅读框部分为891bp，如序列表中序列3所示；其编码序列表中序列1所示的蛋白。

含有所述编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了一种制备原花青素含量提高的转基因植物的方法。

本发明所提供的制备原花青素含量提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：将所述的编码基因导入出发植物中，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物原花青素含量明显提高。

所述编码基因是通过重组表达载体导入的，所述重组表达载体是将所述编码基因插入出发载体pCXSN(T-载体)的多克隆位点得到的；

所述植物为烟草。

扩增所述编码基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围，所述引物对中，一条引物序列如序列表中序列4所示，另一条引物序列如序列表中序列5所示。

所述a)或b)蛋白在作为转录因子中的应用也属于本发明的保护范围。

所述转录因子为调控原花青素生物合成的转录因子。

所述蛋白、所述编码基因在调控原花青素合成中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的转录因子AaMYB3是从红掌中获得的，属于调控原花青素合成的MYB转录因子家族。通过反转录RT-PCR，获得了该基因的完整编码框，随后构建超量表达载体并异源转化烟草进行稳定表达，发现该转录因子具有促进原花青素积累的能力。

附图说明

图1为AaMYB3与已报道的植物调控原花青素合成的MYB氨基酸序列比对图。AtTT2(GenBank序列号CAC40021.1)，拟南芥；VvMYBPA2(ACK56131.1)，葡萄。

图2AaMYB3在红掌发育不同阶段和不同组织中的表达；S1-S5，指佛焰苞发育的5个阶段，D1-D5指肉穗花序发育的5个阶段。

图3转基因烟草花色表型(A)和荧光定量鉴定阳性植株(B)。EV为转化空载pCXSN；Line1～3分别为转化重组质粒pCXSN-AaMYB3的三个株系。

图4转基因烟草花冠中总花青素含量(TAC)和总原花青素(TPC)含量。EV为转化空载pCXSN；Line1～3分别为转化重组质粒pCXSN-AaMYB3的三个株系。

图5转基因烟草花冠中花青素苷和原花青素合成途径上的酶基因与对照相比的相对表达情况。注：标尺Log₂表达量变化倍数(转基因株系/对照)。

具体实施方式

实施例1、红掌AaMYB3基因的克隆

以红掌品种Anthurium‘Tropical’(种苗购自昆明安祖华园艺有限公司)佛焰苞为材料，利用天根多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司，产品目录号为DP441)法提取总RNA，使用Thermo Scientific反转录试剂盒(购自赛默飞世尔科技，产品目录号为K1622)合成cDNA，以此为模板。设计全长cDNA扩增引物：F:5'-ATGGGCAGGAGACCCTGTT-3'(序列表中序列4)；R:5'-CGCCATTACTTCACCCATTC-3'(序列表中序列5)。用上述模板进行扩增，该反应程序为94℃3min,94℃30S,60℃30S,72℃1min 30S,30个循环，72℃。所用DNA聚合酶为Takara ExTaq酶。扩增体系：Extaq酶0.4μL，10×Extaqbuffer 5μL,dNTP mix 4μL，正向引物和反向引物各1μL，模板cDNA1μL，用无菌水补足总体系50μL。扩增产物进行1％琼脂糖电泳，回收目的条带并克隆到pMD 18-T载体(购自宝生物工程(大连)有限公司，产品目录号为6011)上测序。

结果见图1。获得的基因全长的cDNA为899bp，如序列表中序列2所示；其中，序列表中序列2自5’末端第1位到第891位为开放阅读框，开放阅读框部分为891bp，如序列表中序列3所示；其编码序列表中序列1所示的蛋白，序列1由297个氨基酸序列组成，此氨基酸序列具有保守的R2R3重复序列，与拟南芥和葡萄与原花青素合成相关MYB具有较高的保守性，C-端拥有保守的调控原花青素合成MYB转录因子所共有的“V[I/V]R[T/P][K/R]A[I/L/V][R/K]C”的基序。经序列比对，AaMYB3与拟南芥AtTT2和葡萄VvMYBPA2的氨基酸同源性分别为46.2％、57.2％。将该基因命名为AaMYB3，将其编码的蛋白命名为AaMYB3。

实施例2、AaMYB3基因在红掌发育不同阶段和不同组织中的表达水平比较

将红掌品种Anthurium‘Tropical’花(包括佛焰苞和肉穗花序)发育分为5个阶段，阶段1，花(包括佛焰苞和肉穗)全部从保护鞘中抽出；阶段2，花梗伸长但是佛焰苞紧包在花序外；阶段3，佛焰苞半卷曲状态；阶段4，佛焰苞刚全部展开；阶段5，肉穗花序中下部2/3处颜色变白。将叶片分为嫩叶期(深红色叶片松弛卷曲)、成熟期(绿色的成熟叶)。利用天根多糖多酚植物总RNA提取试剂盒分别提取红掌品种Anthurium‘Tropical’(红色)花5个发育阶段的佛焰苞和肉穗花序中，以及嫩叶和成熟叶的总RNA，使用Thermo Scientific反转录试剂盒(购自赛默飞世尔科技，产品目录号为K1622)将总RNA反转录为cDNA。使用TakaraPremix Ex Taq^TM II(Tli RNaseH Plus)(购自宝生物工程(大连)有限公司，产品目录号为RR420A)荧光定量试剂盒分析AaMYB3基因在发育不同阶段和不同组织中的表达水平。实时荧光定量PCR检测AaMYB3基因所用的引物如下：

AaMYB3-qF：5′-TGGAACAGCAGCCTCAGCAA-3′；

AaMYB3-qR：5′-CTTGGTCCGGATAACCCCAT-3′。

实时荧光定量PCR的扩增反应程序：95℃3min；95℃10s、60℃30s，40个循环。

AaMYB3基因的相对表达水平以AaCYP和AaUBQ5基因(序列来源：参考文献Gopaulchan D,Lennon AM,Umaharan P(2013)Identification of reference genes forexpression studies using quantitative RT-PCR in spathe tissue of Anthuriumandraeanum(Hort.).Sci Hort 153:1–7.)为内参进行归一化，用2^–△CT法表示基因的相对定量。

结果见图2。在佛焰苞和肉穗花序中，AaMYB3基因的表达趋势相似，均是随着生长发育先升高再降低。AaMYB3在花梗和叶片中也有较高表达量。可见AaMYB3的表达没有严格的组织特异性。

实施例3、红掌AaMYB3基因表达载体的构建和功能分析

以已测序的pMD 18-T-AaMYB3质粒为模板，用Extaq酶(购自宝生物工程(大连)有限公司，产品目录号为RR001A)扩增(扩增所用的引物序列：扩增引物：F:5'-ATGGGCAGGAGACCCTGTT-3'；R:5'-CGCCATTACTTCACCCATTC-3')出包含完整ORF和终止密码子的AaMYB3片段(序列表中序列2自5’末端第1位到第891位)，通过TA克隆连接到pCXSN(T-载体)(公众可从中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所获得，记载过pCXSN(T-载体)的非专利文献是：Chen S,Songkumarn P,Liu J,Wang G.A versatile zero backgroundT-Vector system for gene cloning and functional genomics.Plant Physiology,2009,150:1111–1121)上，并测序确认连接无误，使用OMEGA质粒小量提取试剂盒II试剂盒(购自广州飞扬生物工程有限公司，产品目录号D6945)，按照说明书所述方法提取构建好的过表达质粒，将构建好的过表达质粒转入农杆菌EHA105菌株感受态细胞(农杆菌EHA105感受态细胞购自北京华越洋生物公司，产品目录号为GX0133-100s)，按照产品使用说明书所描述方法转化质粒，28℃培养2天，获得单菌落。利用PCR方法使用引物：F:5'-ATGGGCAGGAGACCCTGTT-3'；R:5'-CGCCATTACTTCACCCATTC-3'检测目的基因，所检测单菌落均为阳性菌株。用与上述相同的方法，将pCXSN(T-载体)转入农杆菌EHA105菌株，得到包含pCXSN空载体的农杆菌，以包含pCXSN空载体的农杆菌为阴性对照菌株。采用叶盘法转化烟草(Nicotiana tabacum cv.Wisconsin 38)(记载过烟草(Nicotiana tabacumcv.Wisconsin 38)的非专利文献是：Li C,Qiu J,Yang G,et al.Isolation andcharacterization of a R2R3-MYB transcription factor gene related toanthocyanin biosynthesis in the spathes of Anthurium andraeanum(Hort.).PlantCell Reports,2016,35(10):2151-2165.)，具体方法如下：挑取上述单菌落接种于10mL附加50mg/L Kan、50mg/L Rif的YEB液体培养基中(YEB培养基配方：蛋白胨5g/L，酵母提取物1g/L，牛肉浸膏5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.493g/L，pH7.0)，28℃，180rpm振荡培养过夜；取100μL活化菌液接种到25mL不含抗生素的YEB液体培养基中，相同条件下继续培养至对数生长期(约2小时左右)，室温下，4,000rpm离心，收集菌体，并用MS0液体培养基(MS培养基基本成分+蔗糖30g/L，pH5.8)稀释到OD600＝0.6备用。选取生长旺盛的烟草无菌苗(转接后10-15天)叶片，用锋利手术刀片切成1cm²小片，弃去中脉；将烟草叶片浸泡于上述制备好的EHA105菌液中，确保叶片切口边缘完全与菌液接触，浸泡15min；倾去菌液，将感染叶片转移到灭菌吸水纸上吸去多余菌液；将叶片转移到共培养培养基中(培养基配方：MS0+6-BA 1mg/L+NAA0.1mg/L，pH5.8)，叶片背面朝上，暗中共培养48h；将共培养后的叶片转接到分化培养基上(分化培养基配方：MS0+6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L+Kan 150mg/L+Cef 400mg/L，pH5.8)，光照培养(光照/黑暗时间16/8h，温度25℃)；10天后将叶片转接到继代培养基上(继代培养基配方MS0+Kan 150mg/L+Cef 400mg/L，pH5.8)；待分化出的小芽长至2-3cm，将其切下转接到生根培养基上(生根培养基配方1/2MS0+Kan 150mg/L，pH5.8)。待接种于生根培养基中生根成苗。待根系长到8-10cm长时，将再生苗转入温室中，晚上揭去封口膜，白天封上，进行炼苗。5天后，将锻练好的苗取出，在水中洗去附着于根上的培养基，并移栽入预备好的无菌基质(泥炭土：蛭石＝1:1，v/v)中。待幼苗成活后，采集叶片，使用植物基因组DNA提取试剂盒(购自成都福际生物技术有限公司，产品目录号DE-06112)提取烟草基因组DNA，利用PCR方法使用引物：F:5'-ATGGGCAGGAGACCCTGTT-3'；R:5'-CGCCATTACTTCACCCATTC-3'检测目的基因，能扩增出目的片段的即为含有AaMYB3编码基因的烟草植株。待烟草结实后，收集成熟种子，播种于灭菌的泥炭土：蛭石(1:1，v/v)中，待种子萌发20天后，采集烟草叶片使用植物叶片直接PCR试剂盒(购自成都福际生物技术有限公司，产品目录号TP-02112)，使用引物AaMYB3-qF：5′-TGGAACAGCAGCCTCAGCAA-3′；AaMYB3-qR：5′-CTTGGTCCGGATAACCCCAT-3′，参照试剂盒说明书进行目标基因PCR检测，扩增出条带的即为含有AaMYB3编码基因的烟草T1代植株。

在温室中养护至开花后，测定T1代植株花冠中的相关基因表达量、花青素苷(参考文献Li C,Qiu J,Yang G,et al.Isolation and characterization of a R2R3-MYBtranscription factor gene related to anthocyanin biosynthesis in the spathesof Anthurium andraeanum(Hort.).Plant Cell Reports,2016,35(10):2151-2165.)和原花青素含量(参考文献Verdier J,Zhao J,Torres-Jerez I,et al.MtPAR MYBtranscription factor acts as an on switch for proanthocyanidin biosynthesisin Medicago truncatula.Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America,2012,109(5):1766.)。测定相关基因表达量方法如下：利用植物总RNA提取试剂盒(购自成都福际生物技术有限公司，产品目录号RE-05011)分别提取烟草不同株系的处于刚全部展开阶段的花冠总RNA，使用Thermo Scientific反转录试剂盒(购自赛默飞世尔科技，产品目录号为K1622)将总RNA反转录为cDNA。使用Takara Premix Ex Taq^TM II(Tli RNaseH Plus)荧光定量试剂盒(购自宝生物工程(大连)有限公司，产品目录号为RR420A)分析AaMYB3基因和烟草内源与原花青素合成相关的酶基因：CHS、CHI、F3H、F3′H、DFR、ANS、GT、LAR、ANR1、ANR2的表达水平。实时荧光定量PCR检测基因所用的引物如下：

AaMYB3-qF：5′-TGGAACAGCAGCCTCAGCAA-3′，

AaMYB3-qR：5′-CTTGGTCCGGATAACCCCAT-3′；

CHS-qF：5′-TTGTTCGAGCTTGTCTCTGC-3′，

CHS-qR：5′-AGCCCAGGAACATCTTTGAG-3′；

CHI-qF：5′-GTCAGGCCATTGAAAAGCTC-3′，

CHI-qR：5′-CTAATCGTCAATGCCCCAAC-3′；

F3H-qF：5′-CAAGGCATGTGTGGATATGG-3′，

F3H-qR：5′-TGTGTCGTTTCAGTCCAAGG-3′；

F3′H-qF：5′-CAAGGTGGCGTATGCTTAGGA-3′，

F3′H-qR：5′-GTGGTGCACACGTTCAACAGTT-3′；

DFR-qF：5′-AACCAACAGTCAGGGGAATG-3′，

DFR-qR：5′-TTGGACATCGACAGTTCCAG-3′；

ANS-qF：5′-AATGACCAACCCTCTGGCAAT-3′，

ANS-qR：5′-GGCCAGATGGATAAGTCGCA-3′；

GT-qF：5′-GAGTGCATTGGATGCCTTTT-3′，

GT-qR：5′-CCAGCTCCATTAGGTCCTTG-3′；

LAR-qF：5′-TCAAGGTCCTTTACGCCATC-3′，

LAR-qR：5′-ACGAACCTGCTTCTCTTTGG-3′；

ANR1-qF：5′-CATTTGACTTTCCCAAACGC-3′，

ANR1-qR：5′-ATTGGGCTTTTGAGTTGTGC-3′；

ANR2-qF：5′-TGTTCCCACTTGGGATGATA-3′，

ANR2-qR：TGCACCTATACTCTGTTAGTGGC-3′。

花青素测定方法：取新鲜烟草花冠，称重，液氮研磨，用0.1％盐酸甲醇在4℃下浸提24h，过滤，得到花青素提取液。总花青素苷的测定为利用紫外—可见分光光度计(U-2910)测定515nm处的吸光值，利用标准品矢车菊素3–芸香糖苷(购于Sigma-Aldrich公司，产品序号36428-1MG-F)做标准曲线，总花青素苷含量以mg·g^-1FW表示，重复3次。

原花青素含量测定方法：取新鲜烟草花冠，称重，液氮研磨，用70％丙酮：29.5％水：0.5％乙酸在4℃下浸提24h，过滤，得到原花青素提取液。取50μL浸提液与200μL DMACA溶液混合(DMACA购于Sigma-Aldrich公司，产品序号D4506-1G)，DMACA溶液配方：0.1％DMACA：90％乙醇：10％HCl)，测定640nm下的吸光值，每隔1min测定一次，连续测定20min，取最大值。利用标准品表儿茶素(购于北京索莱宝科技有限公司，产品序号SE8100)做标准曲线，原花青素含量以mg·g^-1FW表示，重复3次。

以上测定项目均以转化空载的烟草T1代植株花冠为对照(EV)。

结果见图3-4。异源表达AaMYB3基因导致转基因烟草与对照相比花冠颜色变淡(图3中A)，经荧光定量PCR检测，转基因株系中AaMYB3确定表达，结果可信(图3中B)。且转基因烟草花冠中的花青素苷含量与对照(转空载)相比显著降低，而原花青素含量比对照显著增加(图4)。转基因烟草花冠中与花青素苷和原花青素合成途径上的酶基因表达量均比对照有所提高，其中DFR和LAR以及ANR2提高幅度最大(图5)。

序列表

<110> 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所

<120> 红掌AaMYB3转录因子及其编码基因与应用

<130> P170527/RKY

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 297

<212> PRT

<213> 红掌品种Anthurium 'Tropical'

<400> 1

Met Gly Arg Arg Pro Cys Cys Ser Lys Glu Gly Leu Asn Arg Gly Ala

1 5 10 15

Trp Ser Ala Leu Glu Asp Lys Ile Leu Val Asp Tyr Ile Lys Ile His

20 25 30

Gly Glu Gly Lys Trp Arg Asp Leu Pro Gln Arg Ala Gly Leu Lys Arg

35 40 45

Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Leu Asn Tyr Leu Arg Pro Asp

50 55 60

Ile Lys Arg Gly Asn Ile Ser Tyr Asp Glu Glu Glu Leu Ile Ile Arg

65 70 75 80

Leu His Ala Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Leu

85 90 95

Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Ser Ser Leu

100 105 110

Ser Lys Lys Leu Gln Gly Asp Ser Pro Arg Pro Gly Gly Gln Lys Arg

115 120 125

Leu Cys Arg Pro Asn Asn Asp Lys Lys Pro Ala Ser Arg Arg Gly Val

130 135 140

His Ala His Gly Val Ile Arg Thr Lys Ala Ser Arg Cys Thr Lys Ala

145 150 155 160

Phe Phe Pro Ser Gly Gln His Glu Ala Gly Ala Asn Gln Ala Gly Asp

165 170 175

Ala Thr Cys Gln Glu Thr Pro Pro Ser Pro Ala Leu Pro Arg Asp Asp

180 185 190

Asp Pro Leu Ala Asp Ile Leu Leu Gly Leu Asp Ile Asp Glu Leu Met

195 200 205

Trp Glu Thr Glu Leu Ala Trp Leu Ser Thr Pro Ser Ala Gly Gly Gly

210 215 220

His Pro Gln Asp Ala Asn Gly Leu Leu Asp Gly Glu Glu Arg Arg Ala

225 230 235 240

Ala Leu Cys Gly Ser Asp Gly Asp Glu Tyr Thr Ser Ser Ser Cys Pro

245 250 255

His His Arg Leu Val Leu Glu Glu Thr Val Leu Glu Glu Trp Arg Glu

260 265 270

Cys Leu Glu Pro Val Ala Val Ala Asp Leu Thr Ala Thr Val Asp Ser

275 280 285

Cys Leu Asp Ser Glu Glu Trp Val Lys

290 295

<210> 2

<211> 899

<212> DNA

<213> 红掌品种Anthurium 'Tropical'

<400> 2

atgggcagga gaccctgttg ttccaaggag ggcctcaata gaggtgcatg gtcggctctc 60

gaggacaaga tcctcgtcga ctacatcaag atccacggcg aaggcaaatg gcgggacctc 120

ccccagcgag caggtctgaa acgctgcggc aagagctgcc gtctccgctg gttgaactac 180

ctgcggcccg acatcaagag aggaaacatc tcctacgacg aagaggagct catcatcaga 240

ctccatgccc tcctcgggaa ccgatggtcc ctcatcgctg ggagactccc agggcgaaca 300

gacaatgaaa tcaagaacta ctggaacagc agcctcagca agaagttgca gggcgactcc 360

cctcgcccgg gcgggcagaa acggctctgc agacccaaca acgacaagaa gccggcgagc 420

cgtcgaggag tccatgcaca tggggttatc cggaccaagg cgagcaggtg caccaaggcc 480

ttcttcccat ccgggcaaca cgaagcggga gcaaaccaag cgggggacgc cacctgccag 540

gagacgcccc cgtcgcctgc cctccctcgc gacgacgacc ccctcgcgga catcctcctc 600

ggcttggaca tcgacgagct catgtgggaa acggaactgg cgtggctgag cacgcccagc 660

gccggcgggg gtcacccgca ggatgccaac gggcttttgg atggagagga gcgaagagca 720

gcactgtgcg gaagcgacgg cgacgagtac acgtcgtcgt cgtgcccgca ccaccgactt 780

gtgctggagg aaacagttct ggaggagtgg agggaatgcc ttgaaccagt tgcagtggca 840

gacctgacag ccacagtgga ttcatgcctc gactccgagg aatgggtgaa gtaatggcg 899

<210> 3

<211> 891

<212> DNA

<213> 红掌品种Anthurium 'Tropical'

<400> 3

atgggcagga gaccctgttg ttccaaggag ggcctcaata gaggtgcatg gtcggctctc 60

gaggacaaga tcctcgtcga ctacatcaag atccacggcg aaggcaaatg gcgggacctc 120

ccccagcgag caggtctgaa acgctgcggc aagagctgcc gtctccgctg gttgaactac 180

ctgcggcccg acatcaagag aggaaacatc tcctacgacg aagaggagct catcatcaga 240

ctccatgccc tcctcgggaa ccgatggtcc ctcatcgctg ggagactccc agggcgaaca 300

gacaatgaaa tcaagaacta ctggaacagc agcctcagca agaagttgca gggcgactcc 360

cctcgcccgg gcgggcagaa acggctctgc agacccaaca acgacaagaa gccggcgagc 420

cgtcgaggag tccatgcaca tggggttatc cggaccaagg cgagcaggtg caccaaggcc 480

ttcttcccat ccgggcaaca cgaagcggga gcaaaccaag cgggggacgc cacctgccag 540

gagacgcccc cgtcgcctgc cctccctcgc gacgacgacc ccctcgcgga catcctcctc 600

ggcttggaca tcgacgagct catgtgggaa acggaactgg cgtggctgag cacgcccagc 660

gccggcgggg gtcacccgca ggatgccaac gggcttttgg atggagagga gcgaagagca 720

gcactgtgcg gaagcgacgg cgacgagtac acgtcgtcgt cgtgcccgca ccaccgactt 780

gtgctggagg aaacagttct ggaggagtgg agggaatgcc ttgaaccagt tgcagtggca 840

gacctgacag ccacagtgga ttcatgcctc gactccgagg aatgggtgaa g 891

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 全长cDNA扩增引物F

<400> 4

atgggcagga gaccctgtt 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 全长cDNA扩增引物r

<400> 5

cgccattact tcacccattc 20

Claims

1.一种蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：

a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下1)或2)或3)或4)所示：

1)其核苷酸序列是序列表中序列2所示DNA分子；

2)其核苷酸序列是序列表中序列3所示DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA分子具有90％以上的同源性的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。

5.一种制备原花青素含量提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：将权利要求2或3所述的编码基因导入出发植物中，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物原花青素含量明显提高。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

所述植物为烟草。

7.扩增权利要求2或3所述编码基因全长或其任一片段的引物对，所述引物对中，一条引物序列如序列表中序列4所示，另一条引物序列如序列表中序列5所示。

8.权利要求1所述的蛋白在作为转录因子中的应用。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述转录因子为调控原花青素生物合成的转录因子。

10.权利要求1所述的蛋白、权利要求2或3所述编码基因在调控原花青素合成中的应用。