CN104774252A - 特异调控单宁合成的转录因子PtoMYB115及其用途 - Google Patents

特异调控单宁合成的转录因子PtoMYB115及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及特异调控单宁合成的转录因子PtoMYB115及其用途。本发明公开了转录因子PtoMYB115，具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本发明还提供了含有所述转录因子PtoMYB115的表达载体。本发明还提供了含有所述表达载体的宿主。本发明提供的转录因子通过在转录水平调控毛白杨单宁含量，提高了植株的抗病能力，为获得具有高抗病能力的优质杨树品种提供了新方法。

Description

特异调控单宁合成的转录因子PtoMYB115及其用途
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及特异调控单宁合成的转录因子PtoMYB115及其用途。
背景技术
杨树(Populus spp.)是世界范围内种植最为广泛的一种速生树木。在理想条件下，杨树大约4年即可成材，具有适应性强、繁殖速度快、容易杂交、容易改良遗传性、容易无性繁殖等特点，是重要的建筑用材和造纸原料，同时还可作为可再生能源的原料。毛果杨的基因组测序已经于2006年完成(Tuskan et al.,2006)，被看作是木本转基因植物的模式植物，广泛的运用于林木树种的遗传转化研究。毛白杨(Populus tomentosa)为杨柳科，是我国特有的树种，以黄河流域中、下游为中心分布区(张勇等，2006)。
在自然环境中，杨树常常作为温带系统中的关键物种，他们与多样化的害虫,病原体或共生体相互作用相互影响。杨树受多种病害的侵害且危害严重，主要包括：黑斑病、叶锈病、溃疡病、根癌病和紫根腐病(黄烈健等，2003)。我国杨树人工林面积已超1亿亩，居世界之首。但由于杨树易感染病虫害，导致工程成果难以巩固，甚至失败。使用遗传和分子方法对草本植物与病原菌的相互作用进行了广泛的调查研究，但相比之下，我们关于树种对病原体的防御机制的认识在很大程度上仍然是不完整的(Miranda et al.,2007)。
原花青素(PAs),也被称为浓缩单宁,是多酚类化合物通过类黄酮生物合成途径合成。单宁存在于多种植物中，在抵御食草动物和病原体侵害中起重要作用，尤其在受到昆虫取食、机械伤害、病原体感染后单宁合成含量将明显上升。杨树在受到真菌病侵染后快速强烈系统的激活单宁合成途径说明了单宁对真菌病害的侵染具有防御能力(M ellway et al.,2007)。
通过植物分子学与基因工程研究，单宁合成途径受到多个转录因子的转录调控。其中一大类MYB转录因子，是植物转录因子中最大的家族之一，以含有保守的MYB结构域为共同特征(R1/R2-MYB、R2R3-MYB、R1R2R3-MYB)，含有两个MYB结构域的R2R3-MYB成员最多，广泛参与植物次生代谢调控、细胞的形态发生、胁迫应答、细胞周期控制及分生组织形成等(Bedon et al.,2010)。目前，拟南芥中已经发现130个MYB转录因子，而杨树中有至少存在192个MYB转录因子。近年来，R2R3-MYB在植物环境胁迫中的作用引起了越来越广泛的关注，在植物防卫反应和逆境胁迫应答过程中扮演着非常重要的角色。植物的这种应答反应是一个涉及多个基因、多种信号途径、多种基因产物的复杂过程。转录调控在植物对环境胁迫的应答反应中起着承上启下的作用。类黄酮化合物例如单宁的积累是植物应答逆 境胁迫的一个重要特性，MYB转录因子已被证实广泛的参与类黄酮代谢途径的调控(Akagi et al.,2009)。利用MYB转录因子调控植物体内类黄酮的含量以增强植物对病原菌的抗性，已成为近年来研究植物抗病基因工程的又一新热点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是为提高植物抗性提供一种新选择。
本发明的技术方案是转录因子PtoMYB115，具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
具体的，编码所述转录因子的基因具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
本发明还提供了含有所述转录因子PtoMYB115的表达载体。
具体的，所述的表达载体为超量表达转录因子PtoMYB115的植物表达载体。
具体的，所述的植物表达载体具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列.
本发明还提供了含有所述表达载体的宿主。
具体的，所述的宿主为农杆菌。
本发明还提供了所述转录因子在改良毛白杨溃疡病抗性中的用途。
本发明还提供了所述表达载体在改良毛白杨溃疡病抗性中的用途。
本发明还提供了所述宿主在改良毛白杨溃疡病抗性中的用途。
本发明的有益效果：本发明提供的转录因子通过在转录水平调控毛白杨单宁含量，提高而提高了植株的抗病能力，为获得具有高抗病能力的优质杨树品种提供了新方法。具体涉及发现在毛白杨中一个特异调控单宁合成的转录因子PtoMYB115。在毛白杨中通过超表达转录因子PtoMYB115，在转录水平调控多个跟单宁合成相关的关键酶基因，进而调控单宁含量显著上升，并且对比野生型毛白杨，转基因毛白杨抵抗溃疡病侵害的能力显著提高。本发明为世界范围内广泛栽培的重要造林树种杨树的抗性培育提供新的改良方法。
附图说明
图1：35S：PtoMYB115植物表达载体构建图谱
LB：左边界；PolyA：多聚腺苷酸；Hyg：潮霉素抗性筛选基因；Pro35S：启动子；Tnos：终止子；PtoMYB115：毛白杨转录因子PtoMYB115CDS序列；RB：右边界。 
图2：转基因植株PCR分子检测
以野生型株系和不同转基因株系35S:PtoMYB115的DNA为模板，用测序引物Hyg-F和Hyg-R进行PCR检测；其中M代表Marker DL2000；-为非转基因野生型植株；+为35S:PtoMYB115质粒(阳性对照)。
图3：转基因植株表达量分析
CK为野生型毛白杨，OE1、OE9、OE13分别代表PtoMYB115转基因植株的不同株系。
图4：超表达植株DMACA切片染色和单宁含量分析
A、B、C、D分别是野生型毛白杨的幼叶、根、幼茎、叶柄；E、F、G、H分别是超表达植株的幼叶、根、幼茎、叶柄；I：野生型植株和超表达植株可溶性单宁含量测定；J：野生型植株和超表达植株不溶性单宁含量测定；K：野生型毛白杨儿茶素和表儿茶素出峰时间和吸光度；L：超表达儿茶素和表儿茶素出峰时间和吸光度。
图5：苯丙烷代谢途径关键酶基因表达量分析
A：苯丙烷代谢途径中分支模式图，合成黄酮醇(flavonols)、单宁(proanthocyanidins)、花青素(anthocyanins)、木质素(lignin)，各代谢途径的关键酶基因在箭头处标明；B：单宁合成相关的关键酶基因(CHI1、CHS4、ANR、LAR3、DFR1、F3H)、黄酮醇合成相关的关键酶基因(FLS1)、花青素合成相关的关键酶基因(UFGT1、ANS2)、木质素合成相关的关键酶基因(CCoAOMT1、CAD1、CCR2)表达量分析
Phenylalanine：苯基丙氨酸；cinnamic acid：肉桂酸；4-coumaric acid：对羟基肉桂酸；4-coumaroyl-CoA：4-香豆酰辅酶A；chalcones：查尔酮；flavanones：黄烷酮；dihydroflavonols：二氢黄酮醇；flavonols：黄酮醇；leucocyanidin：无色花青素；cyanidin：花青色素；anthocyanins：花青素；catechin：儿茶素；anthocyanidin：花青素；epicatechin：表儿茶素；proanthocyanidins：原花青素caffeoyl-CoA：咖啡酰辅酶A；feruloyl-CoA：阿魏酰辅酶A；coniferaldehyde：松柏醛；coniferylalcohol：松柏醇；5-OH coniferaldehyde：5-羟基松柏醛sinapaldehyde：芥子醛；sinapyl alcohol芥子醇；S lignin：S型木质素；G lignin：G型木质素；H lignin：H型木质素；PAL：苯丙氨酸氨基裂解酶；C4H：肉桂酸-4-羟基化酶；4CL：4-香豆酰辅酶A连接酶；CHS：查尔酮合成酶；CHI：查尔酮异构酶；F3H：二氢黄酮-3-羟化酶；FLS：黄酮醇合成酶；DFR：二氢黄酮醇4-还原酶；LAR：无花色素还原酶；ANR：花色素还原酶；ANS：花青素合成酶；UFGT：UDP-Glc类黄酮葡萄糖基转移酶；LDOX：无色花色素加双氧酶；CCR：肉桂酰辅酶A还原酶；CAD：肉桂醇脱氢酶；C3H：香豆酸-3-羟基化酶；CCoAOMT：咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶；F5H：阿魏酸-5-羟化酶；COMT：咖啡酸-O-甲基转移酶；PO/LAC：过氧化物酶/漆酶
图6：转基因植株抗病实验
A：溃疡病注射侵染野生型毛白杨三天后表型；B：溃疡病注射侵染超表达株系13号毛白杨三天后表型；C：溃疡病注射侵染野生型和超表达株系毛白杨三天后菌斑面积统计；D：定量分析野生型和超表达株系毛白杨中PtoMYB115转录水平。
具体实施方式
实施例1杨树总RNA提取和反转录合成cDNA
1、杨树总RNA提取
以杨树幼叶为材料，将RNA提取中所用的药勺、杵、研钵等均用95％酒精灼烧至冷却后使用。取石英砂一勺于加热器中加热10min冷却后使用。1.5mL离心管、塑料制品等均使用经RNase处理(RNase Free)的AXYGEN产品。
总RNA提取按照华舜Server-SPIN DNA-free Plant RNA Isolation Kit操作步骤进行：
1)在1.5mL离心管中加入裂解液(500μL RL+100μL 10％PVP+10μL 2-ME)；
2)在液氮冷冻条件下将杨树幼叶(100mg)和石英砂混合快速研成粉末，在液氮完全挥发之前，将粉末全部转移到事先配制好的裂解液中，移液枪快速吹打混匀样品；
3)室温放置5min后，全部移入过滤柱中，13400rpm离心5min，将上清全部移入另一个离心管中；
4)加入上清液一半体积的W3，混匀后，全部移入吸附柱，12000rpm离心30s，倒掉收集管内液体，将吸附柱放回收集管中，若总体积超过750μL，则分多次上柱；
5)加入400μL RP，室温静置1min后，离心1min，倒掉收集管内液体，将吸附柱放回收集管中；
6)加入400μL W3液，室温静置1min后，离心1min，倒掉收集管内液体，将吸附柱放回收集管中；
7)向吸附膜中央加入40μL DNaseΙ工作液。室温静置15min后，加入200μL RP液。离心1min。倒掉收集管内液体，将吸附柱放回收集管中；
8)加入600μL W3液，离心1min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放回收集管中；
9)加入250μL W3液，静置1min，离心2min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放回收集管中；
10)将吸附柱移入一个干净的1.5mL离心管中，在吸附膜正中央加入50μL纯水，静置1min，离心2min。将RNA轻微混匀后，保存于-70℃备用。
2、杨树总RNA反转录合成cDNA
用TaKaRa One-step RT PCR Kit试剂盒进行反转录，反转录的反应体系见表1。
表1 反转录的反应体系
RNase Free dH2O 5μL
5×PrimescriptTM Buffer 2μL
Oligo DT Primer 0.5μL
Total RNA 2μL
Primescript RT Enzyme 0.5μL
 
Total 10μL
反转录的反应程序：37℃，15min；85℃，5s。终止反应后，将反应产物于-20℃储存备用。
实施例2PCR引物的设计和PCR扩增获得目的片段
1、PCR引物设计
登陆PHYTOZOME(http://www.phytozome.com)，查询到毛果杨PtrMYB115基因的CDS序列，根据该序列设计了毛白杨PtoMYB115CDS的特异性引物，PtoMYB115片段的上游引物PtoMYB115-F序列为：5'-ATGGGAAGGGCTCCTTGTTG-3'(SEQ ID No.4)，下游引物PtoMYB115-R序列：5'-TTGTCATACCAGCAGTGACT-3'(SEQ ID No.5)；目的片段858bp。
引物由华大基因(北京)代为合成。PCR所用反应试剂均为TaKaRa公司产品：dNTPMixture(各2.5mM)，Taq DNA聚合酶(5U/μL)，附10×PCR Buffer(0.1M Tris-HCl[pH 8.3]),0.5M KCl)和MgCl2(25mM)。
2、PCR扩增目的片段
以杨树cDNA为模板扩增PtoMYB115基因片段，扩增PtoMYB115基因片段的体系见表2。
表2 PCR反应的体系
RNase Free dH2O 3.5μL
GoTaqR Green Master Mix 5μL
PtoMYB115-F 0.5μL
PtoMYB115-R 0.5μL
模板cDNA 0.5μL
Total 10μL
加完样后，短暂离心混匀，并保证液体聚于管底。外源基因和内源基因各加样10管。快速置于PCR仪中，设置以下循环参数：94℃3min，1个循环；94℃30s，55℃30s，72℃1min，33个循环。
扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，若目的条带清晰，大小正确，可按照AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒如下操作步骤，对目的条带进行回收。在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量(提前记录1.5mL离心管重量)，该重量作为一个凝胶体积(如100mg＝100μL体积)。按如下操作进行回收：
①加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后与75℃加热，间断混合(每次2～3min)，直至凝胶块完全熔化；
②加入0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀。当分离的DNA片段小于400bp时，需再加入1个凝胶体积的异丙醇(加Buffer DE-B后混合物颜色变为黄色)；
③吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管中，12000rpm离心1min，弃滤液；
④将制备管置回2mL离心管，加500μLBuffer W1，12000rpm离心30s，弃滤液；
⑤将制备管置回2mL离心管，加700μLBuffer W2，12000rpm离心30s，弃滤液。以同样的方法再用700μLBuffer W2洗涤一次12000rpm离心1min；
⑥将制备管置回2mL离心管，12000rpm离心1min；
⑦将制备管置与1.5mL离心管中，在制备膜中央加入25-30μLEluent，室温静置1min。12000rpm离心1min洗脱DNA。
实施例335S:PtoMYB115载体构建和转化农杆菌EHA105
将扩增片段胶回收之后，载体pCXSN(由华南农业大学王国良教授提供)用XcmI酶切后与回收片段连接，得到35S:PtoMYB115载体(序列如SEQ ID No.3所示)，图谱见图1。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过PCR扩增目的基因片段和酶切验证，得到转化子，并保存菌种。
分别提取从阳性转化子大肠杆菌中提取35S:PtoMYB115质粒，步骤按照Plasmid Mini Kit试剂盒提取步骤，具体操作如下：
①取培养至对数期的菌液于EP管中，13400rpm离心1min收集菌体，弃上清。
②加入预冷的已加入RNase A的SolutionI 250μL涡旋重悬菌体混匀。
③加入250μL SolutionII动作轻柔上下颠倒5-6次，混匀后静置2min。
④加入350μL SolutionIII，上下颠倒5-6次至沉淀出现，13400rpm离心10min。
⑤取上清加入吸附柱(约700μL上清)，吸附柱放置于2mL的收集管中，10000rpm室温离心1min，弃液。
⑥加入500μL HB Buffer，10000rpm室温离心1min，弃液。
⑦加入700μL DNA Wash Buffer，10000rpm室温离心1min，弃液。
⑧重复第7步，加入700μL DNA Wash Buffer，10000rpm室温离心1min，弃液。
⑨将吸附柱放于收集管中，空管13400rpm离心2min。
⑩将吸附柱放于另外一支新的离心管中，加入30-50μL Elution Buffer，静置2min，13400rpm离心1min。于-20℃保存备用。
转化农杆菌的操作如下：
①取5μL 35S:PtoMYB115质粒分别于200μL的农杆菌EHA105感受态细胞中，混匀。
②立即在冰上放置30min，迅速放入液氮2min，37℃水浴5min。
③加入800μL空的YEP液体培养基，混匀后置28℃、200rpm培养4-6h。
④5000rpm离心8min，弃900μL上清液，将剩余100μL菌液混合，用消毒冷却的涂布棒将100μL菌液均匀涂于YEP+40mg/L Rif+50mg/L Kan+50mg/L Gen固体培养基上，28℃条件下倒置培养2d。
⑤将工程菌命名为EHA105-35S:PtoMYB115，加15％甘油保存于-80℃，用于后续遗传转化实验。
实施例4毛白杨遗传转化
转化材料为野生型的毛白杨叶片，采用根癌农杆菌介导的遗传转化方法(Zhichun Jia et al.,2010)。
1)农杆菌的活化 
将含有重组质粒(35S:PtoMYB115)的农杆菌EHA105接种到YEP固体培养基(含50mg/LKan+40mg/L Rif；Rif：利福平；Kan：卡那霉素)上，28℃培养1～2d；挑取单菌落接种于含有50mg/L Kan、40mg/L Rif的YEP液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.8～1.0；取200μL一活菌液转到新鲜的YEP培养基中，28℃振荡培养6～8h，当OD600达到0.6～0.8时离心收集菌体，用添加了AS(乙酰丁香酮)的WPM液体培养基30mL重悬后放入28℃摇床中振荡培养1～2h即可用于转化。
2)农杆菌的转化 
选取无菌苗顶上的幼嫩叶片，在超净工作台上将其切成0.5×0.5cm2的小块，放入重悬好的菌液中浸染10～15min，期间不断摇晃菌液。
3)毛白杨的共培养
将浸染过的材料用镊子小心夹出放在含有无菌滤纸的平板上吸干菌液，将叶片背面向下平铺在WPM1固体培养基上，于25℃培养箱中暗培养2d。
4)毛白杨的选择培养
2d之后将转化过的外植体移到WPM2选择培养基上，在25℃、光照为2000～10000Lux条件下的光照培养箱中选择培养3～4周，其间每10d更换一次培养基。
5)毛白杨的生芽培养
当叶片周围出现白色疏松愈伤时，将其移入生芽培养基WPM3上，在25℃，光照为2000～10000Lux条件下的光照培养箱中诱导生芽，时间约4～5周，每10d更换一次培养基。
6)毛白杨的生根培养
当不定芽长至约2cm时，切下并转入生根培养基WPM4中，10d左右即生根。
7)转基因毛白杨的移栽
当生根的幼苗长至约8cm且根系比较发达时，取出幼苗，洗净根部的琼脂，移栽到温室中培养。
WPM基本培养基(Lloyd G et al.,1980)：WPM+30g蔗糖+6g琼脂
WPM液体培养基：WPM+30g蔗糖
WPM共培养基(WPM1)：WPM+ZT 2.0mL+NAA1.0mL+As 1.0mL；
WPM选择培养基(WPM2)：WPM+ZT 2.0mL+NAA1.0mL+Cef 2.0mL+相应抗生素；
WPM生芽培养基(WPM3)：WPM+ZT 2.0mL+NAA0.1mL+Cef 2.0mL+相应抗生素
WPM生根培养基(WPM4)：WPM+NAA0.1mL+Cef 2.0mL+相应抗生素。以上WPM培养基均为一升(L)量，pH均为5.80～5.85。
YEP培养基(L)：蛋白胨10g，酵母浸出液10g，NaCl 5g，pH为7.0，121℃高温高压灭菌20min。固体培养基在灭菌前加入相应的琼脂10～12g。
LB培养基(L)：蛋白胨10g，酵母浸出液5g，NaCl 10g，pH为7.0，121℃高温高压灭菌20min。固体培养基在灭菌前加入相应的琼脂10～12g。
实施例5转基因植株PCR分子检测
分别选取10～15株转基因的抗性再生植株，提取毛白杨基因组DNA。方法如下：1)准备若干已灭菌的10ml离心管。取其一支，加入3ml CTAB和90ulβ–巯基乙醇，65℃水浴锅预热。
2)取约0.3g的毛状根，吸干其表面水分，于液氮中磨成粉末，转入上述预热的CTAB抽提液中，涡旋混匀。
3)于65℃水浴45min，中途间隔(轻柔)振荡三次混匀。
4)冰上冷至室温后加入等体积氯仿︰异戊醇(24︰1)，轻柔颠倒混匀后平放乳化10min。18℃，10000转/分，离心10min。
5)取上清(约2ml)于另一干净的10mL离心管中，加入等体积氯仿︰异戊醇(24︰1)，轻柔颠倒混匀后平放乳化10min。18℃，10000转/分，离心10min。
6)吸取上清于另一10mL离心管中，加入等体积-20℃预冷的异丙醇，颠倒混匀能见白色絮状沉淀，量少可短暂离心。
7)枪头吸出絮状沉淀，用500ml 75％(V/V)乙醇漂洗两次，500ml无水乙醇再漂洗一次，吸干乙醇。沉淀于37℃恒温箱中干燥至出现半透明。
8)用25μL无菌水溶解沉淀，得毛状根DNA粗提物。
9)向DNA粗提物中加入约1ul RNase，于37℃酶解RNA1h。
10)DNA样品，-20℃保存备用。 
模板DNA为毛状根的基因组DNA，通过扩增潮霉素标记基因Hyg(562bp)进行筛选。设计Hyg基因的特异性引物，序列如下：
Hyg-F：5′-ATCGGACGATTGCGTCGCATC-3′(SEQ ID No.6)；
Hyg-R：5′-GTGTCACGTTGCAAGACCTG-3′(SEQ ID No.7)。
PCR反应体系同表2，反应程序：94℃预变性3min，1个循环；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸1min，共31个循环；72℃延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，检测结果见图2：以转基因不同株系的DNA为模板扩增时，获得一条预期大小一致的540bp的潮霉素基因片段，同阳性对照一致，而野生型植株DNA阴性对照没有扩增出特异条带，结果表明外源目的基因35S：PtoMYB115已成功整合到毛白杨基因组上。
实施例6转基因植株表达量分析
将野生型毛白杨和获得的15株转基因阳性植株分别提取RNA后反转录成cDNA，方法同实施例1，设计内参基因Pto18s引物(Quanzi Li et al.,2012)：
18s-F：5′-CGAAGACGATCAGATACCGTCCTA-3′(SEQ ID No.8)
18s-R：5′-TTTCTCATAAGGTGCTGGCGGAGT-3′(SEQ ID No.9)。
将野生型和1-15号转基因株系的cDNA进行PCR扩增，PCR反应体系同表2。
反应程序：94℃预变性3min，1个循环；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，依次进行25、26、27、28、29、30循环数扩增；72℃延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。选择循环次数在线性范围内，可以看见不同株系cDNA浓度差异的循环数，并将不同浓度差异的cDNA稀释至同一浓度，进而将同一浓度的野生型和超表达株系的cDNA通过PCR扩增目的基因PtoMYB115分析PtoMYB115在不同转基因植株中表达量高低，PCR反应体系同表2，引物序列：PtoMYB115-F:5'-ATGGGAAGGGCTCCTTGTTG-3'，PtoMYB115-R：5'-TTGTCATACCAGCAGTGACT-3'。筛选得到OE1、OE9、OE13号株系表达量较高(图3)。
实施例7超表达植株DMACA切片染色和单宁含量分析
DMACA染色：
取相同生长时期的根和幼叶，叶柄和茎做徒手切片，用30％的乙酸(V/V:乙酸/甲醇)脱色处理12h后，用75％的乙醇冲洗三次，用DMACA染液染色1min(Li YG et al.,1996)，蓝色即为单宁的分布区域，在显微镜下观察着色情况并拍照。图4中野生型毛白杨的幼叶、叶 柄、幼茎几乎没有染成蓝色，也就是说单宁含量很低几乎没有积累，而根染成蓝色有一定含量的单宁积累；转基因毛白杨的幼叶叶脉、叶柄和幼茎表皮均染成蓝色，根中蓝色程度比野生型更蓝，对比野生型毛白杨单宁显著累积。
提取超表达植株OE1、OE9、OE13株系的单宁，采用分光光度计发进行可溶性缩合单宁和不溶性缩合单宁含量的测定，方法如下:
可溶性缩合单宁含量的测定：
1)取0.5g转基因毛白杨相同生长时期的叶片，液氮速冻研磨；
2)加入5ml提取液(丙酮为70％，V/V＝7:3,含有0.1％【W/V】的抗坏血酸)，超声处理1h，室温黑暗提取24h；
3)10000r/min取上清于另一洁净离心管中，在上清中加入NaCl使水相和丙酮分层，吸取丙酮相，弃水相；
4)重复2,3步；
5)将提取液冷冻干燥，用2ml甲醇(含有0.1％[W/V]的抗坏血酸)溶解，过滤保存。
6)在洁净试管中加入洁净0.5ml最终提取液，3ml香草醛(质量分数为3％,甲醇溶)，1.5ml浓盐酸反应15min，反应中试管用锡箔纸包紧；
7)测定反应液在550nm下的吸光度，对照标准曲线计算出可溶性缩合单宁含量。
不溶性缩合单宁含量的测定：
1)提取可溶性缩合单宁剩余的残渣，风干后加入5ml甲酸-正丁醇，超声1h后测定其在500nm处的吸光度；
2)将提取液沸水浴1h后再次测定其在500nm处的吸光度； 
3)将两次测定结果取差值，对照标准曲线，测定其不溶性缩合单宁的含量。
图4I中野生型可溶性单宁含量106μg/g，超表达植株OE1、OE9、OE13可溶性单宁含量对比野生型显著升高；图4J中野生型不溶性单宁含量354mg/g，超表达植株OE1、OE9、OE13不溶性单宁含量对比野生型明显升高。
提取三株超表达植株可溶性单宁，通过高效液相色谱(HPLC)分析单宁前体儿茶素与表儿茶素含量变化，图4L超表达植株OE13通过峰图吸光值和峰面积计算儿茶素和表儿茶素含量均比图4K中野生型儿茶素和表儿茶素含量高。
实施例8苯丙烷途径关键酶基因表达量分析
针对实施例6筛选到的超表达株系OE1、OE9、OE13，利用野生型和三株超表达株系同一浓度的cDNA进行苯丙烷代谢途径(见图5A)的各个关键酶基因的PCR扩增，反应体系同表2，引物序列如下：
CHI1-F：5′-GGCAAGTTCATAAAGTTCACGG-3′(SEQ ID No.10)；
CHI1-R：5′-CGATTTCTGGTACAGACCCATC-3′(SEQ ID No.11)。
CHS4-F：5′-TGGTCAAGCATTGTTCGGTG-3′(SEQ ID No.12)；
CHS4-R：5′-TGTCTAGTGGCTCGCAGTTTCT-3′(SEQ ID No.13)。
DFR1-F：5′-CAATCAATGCCACCAAGTCTCC-3′(SEQ ID No.14)；
DFR1-R：5′-TCCACAGCACCTGCGAACA-3′(SEQ ID No.15)。
ANR-F：5′-ACAGGGTTTGTGGCATCTTTG-3′(SEQ ID No.16)；
ANR-R：5′-CCAGGTGGGTGGTTTCTCA-3′(SEQ ID No.17)。
ANS2-F：5′-CTGGAAATGTTCAAGGGTATGG-3′(SEQ ID No.18)；
ANS2-R：5′-TTGAGGGCACTTGGGGTAGT-3′(SEQ ID No.19)。
LAR3-F：5′-CTCACCCTGCTGATGTTCCTC-3′(SEQ ID No.20)；
LAR3-R：5′-ACGGTTCTAAATGGCAACTCTG-3′(SEQ ID No.21)。
FLS1-F：5′-GAGCAGCCAGCAACAACCA-3′(SEQ ID No.22)；
FLS1-R：5′-GCCTTCAAGCCCTAACCCTAA-3′(SEQ ID No.23)。
F3H-F：5′-GCAGGGTGTAGCAGCTAAAATG-3′(SEQ ID No.24)；
F3H-R：5′-AGGATGTCTGGGTGCCGTAT-3′(SEQ ID No.25)。
UFGT1-F：5′-ATGTCCGATCATGTAGCAGTC-3′(SEQ ID No.26)
UFGT1-R：5′-ACCATCCCACACTTCGTATG-3′(SEQ ID No.27)。
CCoAOMT2-F：5′-TCTCCCAGTAATTCAGAAAGC-3′(SEQ ID No.28)；
CCoAOMT2-R：5′-CAAAGTCCCTGTAGTACCTCAC-3′(SEQ ID No.29)。
CCR2-F：5′-AAAGAGGCTATTCAAGGGTG-3′(SEQ ID No.30)；
CCR2-R：5′-GACAGTGGGCTGCAACAAT-3′(SEQ ID No.31)。
CAD1-F：5′-ATCTCGCTCCTTACACCTAT-3′(SEQ ID No.32)；
CAD1-R：5′-CTCCTCTTAGCCCACTCTG-3′(SEQ ID No.33)。
图5B中超表达株系OE1、OE9、OE13中与单宁合成相关的关键酶基因(PAL5、CHI1、CHS4、ANR、LAR3、DFR1、F3H)表达量均比野生型明显提高，而与黄酮醇合成相关的关键酶基因(FLS1)、花青素合成相关的关键酶基因(UFGT1、ANS2)、木质素合成相关的关键酶基因(CCoAOMT1、CAD1、CCR2)表达量对比野生型基本没有显著变化，说明了PtoMYB115在转录水平专一调控单宁合成关键酶基因从而调控单宁的合成。
实施例9转基因植株抗病实验
保存的溃疡病菌种接种在PDA培养基上，用于接种野生型和超表达植株。将25～28℃ 暗培养3～5d的杨树溃疡病的菌丝体及连带培养基切成直接6mm的小圆块，用保鲜膜将有菌丝的一面粘贴在毛白杨野生型和超表达植株第三或第四层幼叶上，并使之固定，将其置于室外阴凉处，并保持湿润状态，每株植物接种三片叶子，3d后观察感病情况观察并计算野生型和超表达植株的菌斑面积大小，图6B超表达植株OE13叶片的菌斑面积显著比6A野生型植株菌斑面积小，图6D对菌斑面积相对大小统计，超表达植株OE1、OE9、OE13菌斑面积均比野生型植株菌斑面积小。
以PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)反转录试剂盒反转得到的cDNA为模板(同实施例1)，按照SYBR Premix Ex TaqTMII操作说明进行荧光定量PCR，引物序列：qPtoMYB115-F:5′-ATGGGAAGGGCTCCTTGTT-3′(SEQ ID No.34)；qPtoMYB115-R：5′-GATGTCTGGTCGTAAATAAT-3′(SEQ ID No.35)。得到超表达株系与野生型的相对表达量的结果，图6C对感病后的叶片进行PtoMYB115表达水平的定量分析，超表达植株OE1、OE9、OE13中PtoMYB115转录表达水平比野生型植株明显升高。本发明说明溃疡病侵染转基因毛白杨后，PtoMYB115受到诱导表达量提高，进一步在转录水平激活与单宁合成相关的关键酶基因表达使之表达量明显上升，从而调控单宁的合成也显著提高，最终由于单宁含量的提高使得转基因毛白杨提高抵御溃疡病侵害的能力。

Claims (10)

1.转录因子PtoMYB115，具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
2.如权利要求所述的转录因子，其特征在于：编码所述转录因子的基因具有如SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列。
3.含有权利要求1或2所述转录因子的表达载体。
4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于：所述的表达载体为超量表达转录因子的植物表达载体。
5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于：所述的植物表达载体具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
6.含有权利要求3～5任一项所述表达载体的宿主。
7.如权利要求6所述的宿主，其特征在于：所述的宿主为农杆菌。
8.权利要求1或2所述转录因子在改良毛白杨溃疡病抗性中的用途。
9.权利要求3～5任一项所述表达载体在改良毛白杨溃疡病抗性中的用途。
10.权利要求6或7所述宿主在改良毛白杨溃疡病抗性中的用途。
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