CN102226193A - 甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝mybl2基因家族及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝的MYBL2基因家族，白菜MYBL2基因家族包括BrMYBL2-1基因和BrMYBL2-2基因2个成员，甘蓝MYBL2基因家族包括BoMYBL2-1基因和BoMYBL2-2基因2个成员，甘蓝型油菜MYBL2基因家族包括BnMYBL2-1基因、BnMYBL2-2基因、BnMYBL2-3基因和BnMYBL2-4基因4个成员，8个MYBL2基因之间具有较高的同源性；本发明还公开了上述基因家族在植物种皮颜色、种皮厚度等性状的分子育种中的应用，通过构建正义超量表达植物载体，转化甘蓝型油菜黑籽品种中双10号后，与非转基因的外植体对照相比，转基因植株生长发育正常，但种皮中原花青素等色素减少，同时种皮变薄，形成转基因黄籽性状。

Description

甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝MYBL2基因家族及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及甘蓝型油菜(Brassica napus)及其亲本物种白菜(Brassica rapa)和甘蓝(Brassica oleracea)MYBL2基因家族及其应用。

背景技术

芸薹属(Brassica)是芸薹科(Brassicacease)最重要的一个属，含有世界性的重要蔬菜、油料和观赏作物，如白菜(B.rapa)、甘蓝(B.oleracea)和甘蓝型油菜(B.napus)，其中甘蓝型油菜是由白菜和甘蓝通过天然种间杂交并加倍而形成的异源四倍体。拟南芥(Arabidopsis thaliana)是来自芸薹科的研究最深入的模式植物。染色体分子标记共线性研究发现，芸薹属植物之间以及芸薹属与拟南芥之间均存在基因组水平和基因水平的保守性。

甘蓝型油菜黄籽品系具有种皮薄、种皮色素极少、皮壳率低、粗纤维含量低、含油量高、饼粕蛋白含量高等优点，与黑籽品系相比，饼粕的经济价值和油的品质都有所提高。虽然亲本物种白菜和甘蓝中均存在表型稳定的天然黄籽基因型，但甘蓝型油菜中不存在天然的黄籽基因型。已有的甘蓝型油菜黄籽材料主要通过远缘杂交等方式而创造，但其存在黄籽率和黄籽度不高，表型不稳定，易受环境影响而变异，选育效率低，育种周期长，负相关性状难以克服等缺点，远远不能满足生产要求。因此，获得稳定遗传的甘蓝型油菜黄籽性状成为甘蓝型油菜育种的重要目标。长期以来，全世界众多研究者对该性状进行了广泛研究，但到目前为止主要限于传统研究领域，对于黄籽性状形成的分子机理仍然不清楚，还没有任何通过转基因分子育种创造甘蓝型油菜黄籽材料的报道。

类黄酮化合物是广泛存在的植物次生代谢物，它是植物组织中红色、蓝色和紫色花青素色素呈色物质。拟南芥等植物中种皮色素的主要成分是原花青素(proanthocyanidin，PA)单体的聚合物，是由公共苯丙烷-类黄酮-原花青素途径而合成的。

同为芸薹科的模式植物拟南芥功能基因组学的研究成果，为推动芸薹属植物重要性状的分子机理研究和比较基因组学研究提供了重要参考。MYBL2基因目前只在模式植物拟南芥中有研究，它编码R3-MYB类型的转录因子，是一个转录抑制子，通过直接调控DFR和TT8等基因的表达来调控植株花青素的合成，进而调控花青素苷和原花青素的合成，与植株的花青素苷和原花青素性状息息相关，而之前就已经阐明油菜的种皮色素就是原花青素的多聚物，因此MYBL2基因与油菜的黄籽性状的形成有一定的关系。但是，目前甘蓝型油菜、白菜和甘蓝等芸薹属植物MYBL2基因的成员数、蛋白特征、进化关系、表达的组织特异性、与黄籽性状的关系和在基因工程中的应用等都未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝MYBL2基因家族。

为达到上述目的，本发明分别克隆了甘蓝型油菜、白菜、甘蓝MYBL2基因家族成员的全长cDNA和对应的基因组序列，并进行了系统的生物信息学分析和功能比较基因组学研究。结果显示：

白菜MYBL2(BrMYBL2)基因家族包括2个成员：BrMYBL2-1基因和BrMYBL2-2基因；所述BrMYBL2-1基因的基因组序列如SEQ ID No.1所示，全长cDNA序列如SEQ ID No.2所示；所述BrMYBL2-2基因的基因组序列如SEQ ID No.3所示，全长cDNA序列如SEQ ID No.4所示；

甘蓝MYBL2(BoMYBL2)基因家族包括2个成员：BoMYBL2-1基因和BoMYBL2-2基因；所述BoMYBL2-1基因的基因组序列如SEQ ID No.5所示，全长cDNA序列如SEQ ID No.6所示；所述BoMYBL2-2基因的基因组序列如SEQ ID No.7所示，全长cDNA序列如SEQ ID No.8所示；

甘蓝型油菜MYBL2(BnMYBL2)基因家族包括以下4个成员：BnMYBL2-1基因、BnMYBL2-2基因、BnMYBL2-3基因和BnMYBL2-4基因；所述BnMYBL2-1基因的基因组序列如SEQ ID No.9所示，全长cDNA序列如SEQ ID No.10所示；所述BnMYBL2-2基因的基因组序列如SEQ IDNo.11所示，全长cDNA序列如SEQ ID No.12所示；所述BnMYBL2-3基因的基因组序列如SEQ ID No.13所示，全长cDNA序列如SEQ ID No.14所示；所述BnMYBL2-4基因的基因组序列如SEQ ID No.15所示，全长cDNA序列如SEQ ID No.16所示。

上述芸薹属MYBL2基因家族8个成员之间具有较高的同源性，基因组序列一致率为70.6-99.6％，编码区序列一致性为76.7-100％，编码蛋白水平的一致性和相似性分别为60.8-100％和69.3-100％；上述芸薹属MYBL2基因家族8个成员与拟南芥MYBL2(AtMYBL2)基因的基因组序列一致率为66.7％-73.5％，编码区序列一致率为78.2％-81.8％，编码蛋白水平的一致率和相似率分别为60.8％-72.1％和69.3％-79.7％，其中在R3-MYB区域的相似性达到97.1％。核酸水平的序列比对、系统发生聚类、特征性变异碱基、特征性变异氨基酸等方面都表明，上述芸薹属8条MYBL2基因都是AtMYBL2基因的垂直同源基因，具有相似的结构特征。

半定量RT-PCR检测表明，MYBL2基因在白菜、甘蓝、甘蓝型油菜这3个物种除根以外的所有器官中均有总体表达，在甘蓝型油菜中以蕾和花中表达最高，其它器官间差异不大；在白菜中也是以蕾和花中表达最高，下胚轴和茎中表达较低；在甘蓝中子叶、叶、花、细嫩种子中均有相似的较高水平表达，同样是下中轴和茎中表达较低。BnMYBL2基因家族4个成员的器官特异性相似，但常规条件下BnMYBL2-1和BnMYBL2-2比BnMYBL2-3和BnMYBL2-4的表达水平要高。BrMYBL2基因家族2个成员的器官特异性基本相似，但常规条件下BrMYBL2-1比BrMYBL2-2表达水平略低且在后期种子中不表达。BoMYBL2基因家族2个成员的器官特异性也基本相似，但常规条件下BoMYBL2-1比BoMYBL2-2表达水平略低。

RT-PCR还表明，甘蓝型油菜黄籽材料的蕾、花、25天、30天和45天种子中BnMYBL2总体和4个BnMYBL2成员的表达水平均比黑籽中发生明显上调，55天种子中相似；白菜各发育阶段的种子中BrMYBL2的总体表达在黄籽与黑籽间没有明显差异，甚至黄籽的蕾和花中的表达水平比黑籽明显下调；甘蓝黄籽材料的主要发育阶段的种子中BoMYBL2家族2个成员的表达水平均比黑籽有明显的上调，尽管其它器官中差异不大。

基于上述结果，利用本发明的BrMYBL2、BoMYBL2、BnMYBL2基因家族中的任一种或多种基因或基因截短片段，可以构建MYBL2基因重组表达载体和转化体，用于MYBL2基因的超量表达、反义抑制、RNA干扰等。

本发明的目的之二在于提供所述白菜、甘蓝、甘蓝型油菜MYBL2基因家族在植物种皮颜色、种皮厚度等性状的分子育种中的应用。

为达到上述目的，本发明选取BnMYBL2基因家族4个正义超量表达片段BnMYBL2-1ox、BnMYBL2-2ox、BnMYBL2-3ox、BnMYBL2-4ox(核苷酸序列分别如SEQ ID No.10的231-914bp、SEQ ID No.12的190-898bp、SEQ ID No.14的48-729bp、SEQ ID No.15的48-956bp所示，并分别与SEQ ID No.6的231-914bp、SEQ ID No.2的191-899bp、SEQ ID No.8的52-733bp、SEQ IDNo.3的48-958bp高度相似)，将其插入pC2301M1DPB载体的D35SFL启动子(双份CaMV35S启动子并融合有Omega增强子)和NOS终止子之间，构建了BnMYBL2基因家族的正义超量表达载体pCD-BnMYBL2-1ox、pCD-BnMYBL2-2ox、pCD-BnMYBL2-3ox、pCD-BnMYBL2-4ox。选取pCD-BnMYBL2-2ox转化根癌农杆菌LBA4404获得了pCD-BnMYBL2-2ox工程菌株，再通过根癌农杆菌介导的下胚轴侵染法转入甘蓝型油菜典型黑籽品种中双10号，得到了6株外源基因超量表达的转基因植株。转基因植株的外观性状总体上与非转基因植株差异不大，背景性状基本一致，但种皮中原花青素等色素减少，同时种皮变薄，形成转基因黄籽性状，是油菜黄籽性状育种的新资源。

本发明的有益效果在于：本发明提供了MYBL2基因在甘蓝型油菜、白菜、甘蓝中的成员数、各成员的全长cDNA序列和基因组序列、编码蛋白特征、进化关系、表达的器官组织特异性等，并确认了MYBL2基因表达显著上调是所检测的芸薹属黄籽性状的重要成因，采用转基因技术在甘蓝型油菜黑籽品种中正义超量表达MYBL2基因家族的任意一个成员，转基因植株的种皮色素减少，同时种皮变薄。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1甘蓝型油菜(A)、白菜(B)、甘蓝(C)MYBL2基因家族全长cDNA扩增的电泳图。

图2甘蓝型油菜(A)、白菜(B)、甘蓝(C)MYBL2基因家族基因组DNA扩增的电泳图。

图3BnMYBL2-1蛋白(A)和BnMYBL2-3蛋白(B)的二级结构，其它成员的二级结构与此高度相似，纵向从长到短的4种线段分别表示α螺旋、延伸链、β转角和随机卷曲，数字表示蛋白的氨基酸残基的计数。

图4BnMYBL2-1蛋白(A)和BnMYBL2-3蛋白(B)的三级结构，其它成员的MYB域三级结构与此高度相似。

图5BnMYBL2、BoMYBL2、BrMYBL2家族间及与AtMYBL2间的蛋白多重比对，SANT域加框表示，C-端中的4个保守性基序加下划线表示。

图6BnMYBL2、BoMYBL2、BrMYBL2家族与拟南芥(At)等植物的同源蛋白的系统树，各植物物种拉丁学名后面的第1个括弧为蛋白质检索号(protein id)，第2个括弧为该蛋白与相邻最同源蛋白间的距离。

图7BnMYBL2(A)、BrMYBL2(B)、BoMYBL2(C)家族基因总体和各成员表达的RT-PCR检测，Ro为根，Hy为下胚轴，Co为子叶，St为茎，Le为叶，Bu为蕾，F1为花，10/15D、25/30D、40/45D、45/55D分别为花后10/15天、25/30天、40/45天、45/55天种子，SP为荚果皮。

图8BnMYBL2基因家族4个成员的超量表达片段的扩增产物电泳图，M为Trans2K plus DNA marker，1为BnMYBL2-1ox，2为BnMYBL2-2ox，3为BnMYBL2-3ox，4为BnMYBL2-4ox。

图9酶切图，A为pC2301M1DPB的XbaI+SacI双酶切图，M为λ-HindIII DNA marker，1为未酶切的pC2301M1DPB，2为pC2301M1DPB的双酶切产物；B为BnMYBL2家族重组T载体的SpeI+SacI双酶切图，M为Trans2K plus DNA marker，1、3、5、7分别为未酶切的pGEM-T-BnMYBL2-1ox、pGEM-T-BnMYBL2-2ox、pGEM-T-BnMYBL2-3ox、pGEM-T-BnMYBL2-4ox，2、4、6、8分别为pGEM-T-BnMYBL2-1ox、pGEM-T-BnMYBL2-2ox、pGEM-T-BnMYBL2-3ox、pGEM-T-BnMYBL2-4ox的双酶切产物。

图10BnMYBL2家族正义超量表达载体农杆菌液的PCR检测电泳图，M为Trans2K plusDNA marker，1、3、5、7分别为pCD-BnMYBL2-1ox、pCD-BnMYBL2-2ox、pCD-BnMYBL2-3ox、pCD-BnMYBL2-4ox用引物组合FBML2CRab+RBML2a、FBML2CRab+RBML2b、FBML2CRcd+RBML2c、FBML2CRcd+RBML2d检测，2、4、6、8分别为pCD-BnMYBL2-1ox、pCD-BnMYBL2-2ox、pCD-BnMYBL2-3ox、pCD-BnMYBL2-4ox用引物组合F35S3N+RBML2a、F35S3N+RBML2b、F35S3N+RBML2c、F35S3N+RBML2d检测。

图11中双10号转化pCD-BnMYBL2-2ox后的Basta抗性愈伤再生出小芽。

图12中双10号转化pCD-BnMYBL2-2ox后再生小苗的生根。

图13中双10号超量表达BnMYBL2-2的转基因苗和对照。

图14中双10号转化pCD-BnMYBL2-2ox后再生植株抗Basta复检，#1、#2、#3、#4、#5和#6为6株转基因再生植株，中双10为非转基因阴性对照。

图15中双10号转化pCD-BnMYBL2-2ox后抗Basta再生植株的PCR检测，A、B、C、D、E、F分别为引物组合FBML2CRab+RNOS5N、F35S3N+RBML2b、FBAR+RBAR、FGUS+RGUS、FNPT2+RNPT2、F35S3N+RNOS5N的扩增产物，M为Trans2K plus DNAmarker，1、2、3、4、5、6分别为6株转基因再生植株，CK1为阳性对照(工程菌株)，CK2为阴性对照(中双10号)。

图16中双10号转化pCD-BnMYBL2-2ox后的转基因种子(左)和非转基因种子(右)。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

优选实施例采用的植物材料：甘蓝型油菜为典型黑籽系5B和黄籽系09L587，白菜为白菜型油菜亚种(B.rapa ssp.oleifera)的黑籽系09L597和黄籽系09L600，甘蓝为羽衣甘蓝变种(B.oleracea var.acephala)的黑籽系09L598和黄籽系09L599，均由重庆市油菜工程技术研究中心提供，常规大田试验条件种植。黑籽油菜品种“中双10号”的种子由中国农业科学院油料作物研究所提供。

优选实施例采用的试剂及试剂盒：RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0、DNA Ligation Kit、DNase I(RNase-free)及buffer、RNase Inhibitor、DL-2000及λ-HindIII DNA Marker购自宝生物工程(大连)有限公司；pGEM-T easy载体连接试剂盒购自美国Promega公司；限制性内切酶SacI、XbaI、SpeI等购自立陶宛MBI Fermentas公司；MS(Murashige&Skoog medium，including vitamins)培养基购自荷兰Duchefa公司；DL-2000plus、Easy-Taq酶、dNTPs等试剂购自北京全式金生物技术有限公司；氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、利福平(Rif)、链霉素(Str)、头孢霉素(Cef)、琼脂糖、Tris、CTAB、Tris饱和酚(pH＝8.0)、Tryptone、Yeast Extract、X-gal、IPTG、CTAB等其它生化与分子生物学试剂购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

优选实施例采用的主要仪器：ABI 9700型PCR仪和Veriti^TM多重控温PCR仪购自美国Applied Biosystems公司。

一、白菜、甘蓝、甘蓝型油菜MYBL2基因家族的克隆

克隆所用引物见表1。

表1克隆所用引物

1、白菜、甘蓝、甘蓝型油菜基因组总DNA和总RNA的提取

每个品系取典型植株的嫩叶，采用十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)法提取基因组总DNA，采用1.0％琼脂糖凝胶电泳法和分光光度法评价核酸样品的质量和浓度。电泳结果表明，用CTAB法提取的白菜、甘蓝、甘蓝型油菜基因组总DNA的完整性好，RNA消化完全，分光光度法检测的纯度也较高，可用于PCR扩增及Southern杂交实验。

同时，以白菜、甘蓝、甘蓝型油菜典型黑籽系材料的根、下胚轴、子叶、茎、叶、蕾、花、花后10/15天的种子、花后25/30天的种子、花后40/45天的种子、花后45/55天的种子、荚果皮以及黄籽系材料的生殖器官为材料，采用柱式小量植物总RNA抽提试剂盒按其说明书提取总RNA，用DNase I去除DNA杂质，总RNA用乙醇沉淀后溶于纯水。核酸样品采用1％琼脂糖凝胶电泳检测质量，用Nanodrop紫外分光光度计测定浓度和纯度。电泳分析表明，获得的总RNA特征条带清晰，无明显RNA降解和DNA污染，分光光度法检测评价的质量也较好，能够满足下游实验的要求。

2、白菜、甘蓝、甘蓝型油菜生殖器官总cDNA第一链的获得

取白菜、甘蓝、甘蓝型油菜黑籽材料的蕾、花、花后10/15天种子(10/15D)、花后25/30天种子(25/30D)、花后40/45天种子(40/45D)、花后45/55天种子(45/55D)的总RNA各0.25μg混匀，采用RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0按其说明书进行Oligo dT-Adaptor Primer为引物的反转录，获得混合生殖器官总cDNA第一链。

3、芸薹属MYBL2基因家族的电子克隆

拟南芥MYBL2基因(AtMYBL2)位于1号染色体BAC克隆子F23N20(GenBank Accession Number：AC016972.7)上，其mRNA(GenBank Accession Number：NM_105772.2)为986bp。其它物种中并无MYBL2的克隆与登录。将NM_105772.2序列提交到NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)上进行核酸序列比对(nucleotide blast)，限定Organism为Brassica，限定Database为Expressed sequence tags(est)时从BLASTn结果中提取芸薹属MYBL2基因的候选EST序列，限定Database为Genomic survey sequences(gss)时从BLASTn结果中提取芸薹属MYBL2基因的候选GSS序列。在默认参数下，将这些候选EST和GSS序列进行BLASTn比对，与AtMYBL2具有垂直同源关系的序列即为芸薹属MYBL2基因的正式EST和GSS序列，舍弃与AtMYBL2不具有垂直同源关系的候选序列。将正式EST和GSS序列下载到本地电脑上，采用Vector NTI Advance 9.0创建序列，然后以AtMYBL2为参照序列，将EST和GSS序列标签逐条添加比对，直至完成多重比对。根据多重比对结果，将每个物种内部属于同一个独立基因(Unigene)的标签序列拼接成Contig。

通过芸薹属EST BLASTn，共获得甘蓝型油菜、白菜、甘蓝MYBL2基因家族的EST序列13、2和0条。通过芸薹属GSS BLASTn，共获得甘蓝型油菜、白菜、甘蓝MYBL2基因的GSS序列0、7和2条。标签和Contig的比对表明，甘蓝型油菜、白菜、甘蓝中可能分别只存在4、2、2条MYBL2基因，对应的独立基因分别命名为BnMYBL2-1～BnMYBL2-4、BrMYBL2-1～BrMYBL2-2、BoMYBL2-1～BoMYBL2-2，而且BnMYBL2-1、BnMYBL2-3的标签分别与BoMYBL2-1、BoMYBL2-2的标签具有对应性，BnMYBL2-2、BnMYBL2-4的标签分别与BrMYBL2-1、BrMYBL2-2的标签具有对应性。

4、甘蓝型油菜、白菜、甘蓝MYBL2基因家族全长cDNA的克隆

以甘蓝型油菜混合生殖器官总cDNA第一链为模板，以表1所列的引物组合进行PCR扩增，PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳显示，引物组合FBML2a+RBML2a、FBML2b+RBML2b、FBML2cd+RBML2c、FBML2cd+RBML2d分别扩增出了一条约950、900、750、700bp的条带，并伴有弱带或smear(图1A)。胶回收、TA克隆后，批量克隆子的菌液PCR检测表明插入片段长度出现了多态性，均送样测序，测序结果的BLASTn以及与AtMYBL2的比对表明它们均是甘蓝型油菜MYBL2基因，950、900、750、700bp条带测序获得的标准全长cDNA的长度分别为914、898、729、680bp，分别命名为BnMYBL2-1mRNA、BnMYBL2-2mRNA、BnMYBL2-3mRNA、BnMYBL2-4mRNA。

以白菜混合生殖器官总cDNA第一链为模板，以表1所列的引物组合进行PCR扩增，PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳显示，引物组合FBML2b+RBML2b、FBML2cd+RBML2d分别扩增出了一条约900、700bp的条带(图1B)。胶回收、TA克隆后，批量克隆子的菌液PCR检测表明插入片段长度出现了多态性，均送样测序，测序结果的BLASTn以及与AtMYBL2的比对表明它们均是白菜MYBL2基因，900、700bp条带测序获得的标准全长cDNA的长度分别为899、680bp，分别命名为BrMYBL2-1mRNA、BrMYBL2-2mRNA。

以甘蓝混合生殖器官总cDNA第一链为模板，以表1所列的引物组合进行PCR扩增，PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳显示，引物组合FBML2a+RBML2a、FBML2cd+RBML2c分别扩增出了一条约950、750bp的条带(图1C)。胶回收、TA克隆后，批量克隆子的菌液PCR检测表明插入片段长度出现了多态性，均送样测序，测序结果的BLASTn以及与AtMYBL2的比对表明它们均是甘蓝MYBL2基因，950、750bp条带测序获得的标准全长cDNA的长度分别为914、733bp，分别命名为BoMYBL2-1mRNA、BoMYBL2-2mRNA。

测序还表明，3个物种MYBL2全长cDNA产生克隆子长度多态性的原因是存在1个甚至2个内含子保留而未剪接的现象。

5、甘蓝型油菜、白菜、甘蓝MYBL2基因家族基因组DNA的克隆

将模板替换成甘蓝型油菜基因组总DNA，进行与前面一样的PCR扩增，电泳结果显示，引物组合FBML2a+RBML2a、FBML2b+RBML2b、FBML2cd+RBML2c、FBML2cd+RBML2d分别扩增出了一条约1200、1150、1000、950bp的条带(图2A)。胶回收、TA克隆后，菌液PCR检测没有多态性，测序获得的准确长度分别为1181、1164、1023、956bp，分别命名为BnMYBL2-1gene、BnMYBL2-2gene、BnMYBL2-3gene、BnMYBL2-4gene。

将模板替换成白菜基因组总DNA，进行与前面一样的PCR扩增，电泳结果显示，引物组合FBML2b+RBML2b、FBML2cd+RBML2d分别扩增出了一条约1150、950bp的条带(图2B)。胶回收、TA克隆后，菌液PCR检测没有多态性，测序获得的准确长度分别为1165、958bp，分别命名为BrMYBL2-1gene、BrMYBL2-2gene。

将模板替换成甘蓝基因组总DNA，进行与前面一样的PCR扩增，电泳结果显示，引物组合FBML2a+RBML2a、FBML2cd+RBML2c分别扩增出了一条约1200、1000bp的条带(图2C)。胶回收、TA克隆后，菌液PCR检测没有多态性，测序获得的准确长度分别为1214、1027bp，分别命名为BoMYBL2-1gene、BoMYBL2-2gene。

二、BnMYBL2、BrMYBL2、BoMYBL2基因家族的生物信息学分析

在Vector NTI Advance 9.0上进行序列比对、开放阅读框(ORF)查找与翻译，在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/网站上进行BLAST和蛋白序列的CDD搜索，在http://bip.weizmann.ac.il/和www.expasy.org等网站提供链接的生物信息学网站上进行蛋白质结构分析，在http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html和http://www.ebi.ac.uk/clustalw/等网站上进行基因和蛋白质序列多重比对和聚类分析。

1、甘蓝型油菜、白菜、甘蓝MYBL2基因家族的结构分析

1.1甘蓝型油菜、白菜、甘蓝MYBL2基因家族的结构参数

BnMYBL2、BrMYBL2、BoMYBL2家族8个全长基因的DNA序列为956-1214bp，均有3个外显子和2个内含子，最长标准mRNA为680-914bp，最长5′非编码区(5′UTR)为47-230bp，最长3′UTR为46-118bp，编码区(开放读码框ORF，包括终止密码子)为576-636bp，编码区的GC含量为42.45-44.50％，明显高于非编码区(5′UTR+3′UTR+内含子)的GC含量(26.09-33.28％)，符合功能基因的结构特点(表2)。

EST标签和全长cDNA扩增的结果表明，BnMYBL2-1、BnMYBL2-2、BrMYBL2-1、BoMYBL2-1具有两组转录起始位点区域，二者相隔138-178bp，推测具有双启动子现象，在上游组起始位点转录得到的mRNA具有长的5’UTR，其上有2-3个上游ORF(uORF)，而以下游组起始位点转录得到的mRNA的5’UTR较短且其上不含uORF，因此推测上游组转录是一种表达的负调控方式。

在它们的3’UTR中都存在AATAAA或AAATGAAA的疑似poly(A)加尾信号，已有EST标签表明它们存在可变性poly(A)加尾位点的现象。转录起始位点和加尾位点的可变性使同一个基因产生多种长度的mRNA分子，根本差异是UTR的长度的可变性，结合5’UTR的uORF和内含子的可变性剪接，达到负调控的目的。

表2BnMYBL2、BrMYBL2、BoMYBL2家族基因的基本特征

1.2甘蓝型油菜、白菜、甘蓝MYBL2家族蛋白的基本参数、亚细胞定位和可能的转录后修饰

推导的BnMYBL2、BrMYBL2、BoMYBL2家族8个蛋白为191-211个氨基酸残基，分子量为21.72-23.95kD，极性氨基酸占31.12-33.18％，疏水氨基酸占26.53-28.91％，带电氨基酸占33.16-34.03％，酸性氨基酸占9.69-10.99％，碱性氨基酸占12.04-14.29％，等电点为8.32-9.61，为碱性蛋白，单个氨基酸中以丝氨酸含量最高，其次是亮氨酸，然后是碱性氨基酸K或R。

SignalP3.0预测它们没有信号肽。Softberry-ProComp和WoLFPSORT均预测它们定位于细胞核；虽然TargetP1.1预测它们可能定位于线粒体，但可信等级低。TMpred预测它们没有任何跨膜域，REP预测它们没有重复结构。NetPhos2.0预测它们有9-14个潜在的磷酸化位点，主要是丝氨酸磷酸化位点(表3)。

表3BnMYBL2、BrMYBL2、BoMYBL2家族编码蛋白的基本特征

1.3甘蓝型油菜、白菜、甘蓝MYBL2家族蛋白的保守域、保守基序和高级结构

NCBI保守域搜索(NCBI Conserved Domain Search)表明，BnMYBL2、BrMYBL2、BoMYBL2家族8个蛋白的N₃₆-L₇₉或N₃₈-L₈₁为SANT保守域(cd00167)，该保守域是转录因子SWI3、ADA2、N-CoR和TFIIIB的DNA结合域，由串联重复的SANT与DNA进行序列特异性地结合，而在转录抑制子复合物中单个SANT也能够与DNA结合。

SOPMA软件预测，BnMYBL2、BrMYBL2、BoMYBL2家族8个蛋白的二级结构主要为随机卷曲(52.36-64.29％)，其次是α-螺旋(17.86-23.22％)和延伸链(9.18-19.90％)，β-转角占5.10-6.64％，在蛋白的中前部有3个明显的α-螺旋，其中2个最大的α-螺旋位于SANT保守域中，延伸链主要分布于蛋白的中部的后部，而β-转角则主要分布于蛋白的中部的前部(表3，图3)。

由于没有其它植物的MYBL2可高度同源的蛋白的三维结构模型信息，所以Swiss-Model并没有预测到它们的完整三维结构，但基于模型1h88C预测出了它们的SANT域的三级结构(图4)。与二级结构一致，SANT域的三级结构主体为α-螺旋。

2、甘蓝型油菜、白菜、甘蓝MYBL2家族的同源性和系统发生关系

2.1核酸与蛋白水平的同源性

Vector NTI上的两两比对表明，BnMYBL2、BrMYBL2、BoMYBL2家族8个全长基因之间在gDNA水平一致率为70.6-99.6％，编码区水平的一致率为76.7-100％。NCBI BLASTn表明，BnMYBL2、BrMYBL2、BoMYBL2家族8个全长基因与AtMYBL2的同源性最高，Vector NTI计算的gDNA水平一致率为66.7-73.5％，编码区水平的一致率为78.2-81.8％(表4)。在核酸水平，它们还与一些其它MYB基因有一定同源性。它们在编码区的保守性显著高于非编码区的保守性，但内含子在剪接边界处是保守的，5’UTR和3’UTR中也存在一些保守性的局部区域，应当与基因表达活动有关。Vector NTI上的两两比对表明，BnMYBL2、BrMYBL2、BoMYBL2家族8个全长基因的推导蛋白之间的一致率为60.8-100％，相似率为69.3-100％。

表4BnMYBL2、BrMYBL2、BoMYBL2家族8个基因间的基因组序列一致率(斜体，上)、编码区一致率(斜体，下)、蛋白一致率(正体，上)和蛋白相似率(正体，下)(％)

NCBI BLASTn表明，BnMYBL2、BrMYBL2、BoMYBL2家族8个全长基因与AtMYBL2蛋白的同源性最高，Vector NTI计算的一致率为60.8-72.1％，相似率为69.3-79.7％(表4)。在蛋白水平，它们还与许多其它MYB蛋白有一定同源性。蛋白水平的多重比对表明，它们在SANT域的保守性显著高于其它区域的保守性，但在该保守结构域之后的C-端中还存在4个显著的保守性的基序，一致性序列分别为KRKLMKMGIDPTNHRLYHHTNYISR、ETDIISDQ-SSSVSESC、LPDLNI和GSTXQ，它们也许与MYBL2蛋白参与转录抑制作用或转录因子复合物的形成有关(图5)。

2.2系统发生关系

将BLASTp显示的与芸薹属MYBL2有同源性的代表性植物MYB蛋白下载，与芸薹属8个MYBL2蛋白和AtMYBL2蛋白一起在Vector NTI Advance上利用ClustalW多重比对而构建系统树(图6)。系统树上揭示了4个具有同源关系的MYB蛋白类型，芸薹属的8个MYBL2蛋白分为2组，它们与菘蓝的一个MYB(ABF50789.1)首先聚在一起，再与拟南芥的AtMYBL2和一个MYB相关转录因子(CAA92280.1)聚为一个单R域转录因子大类，另外3个大类是由AtMYB4等构成的R2R3-MYB类型转录因子，4个大类互相独立。该结果表明，芸薹属的8个MYBL2蛋白、AtMYBL2、ABF50789.1和CAA92280.1互为垂直同源基因(orthologs)，且芸薹属的2组MYBL2基因是由芸薹属祖先中的1个MYBL2基因在芸薹属与拟南芥属分开后通过基因加倍而产生的。

3、甘蓝型油菜、白菜、甘蓝MYBL2家族表达特征和与黄籽性状的关系

选择甘蓝型油菜、白菜、甘蓝典型黑籽系材料的根、下胚轴、子叶、茎、叶、蕾、花、花后10/15天的种子、花后25/30天的种子、花后40/45天的种子、花后45/55天的种子、荚果皮12个组织器官的总RNA作为模板，采用RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0反转录为总cDNA，用半定量RT-PCR分析MYBL2基因家族表达组织性特征。用引物组合FBML2C2+RBML2C1检测各物种中MYBL2基因的总体表达水平。用引物组合FBML2C2+RNML2S1、FBML2C2+RNML2S2、FBML2C2+RNML2S3、FBML2C2+RNML2S4分别用于检测基因成员BnMYBL2-1/BoMYBL2-1、BnMYBL2-2/BrMYBL2-1、BnMYBL2-3/BoMYBL2-2、BnMYBL2-4/BrMYBL2-2的表达水平，以上反应均在在50μl标准Taq-PCR体系中进行，PCR反应程序为：94℃预变性2min→33个扩增循环(94℃变性1min→55℃退火1min→72℃延伸1min)→72℃保温10min。三个物种的内标引物为F26S+R26S，扩增看家基因26S的531bp，PCR反应程序除循环数改为20个循环外，其余与前述一致。

20个循环的RT-PCR在甘蓝型油菜、甘蓝、白菜这3个物种黑籽和黄籽材料的各器官间扩增出了亮度一致的内标基因26SrRNA的条带，说明各器官组织间的起始总RNA量、反转录效率、PCR效率等较为一致，在此基础上进行目的基因的RT-PCR结果可信。

采用芸薹属MYBL2基因家族所有8个成员的共保守点引物进行的33个循环的RT-PCR扩增(图7)表明，MYBL2基因在这3个物种除根以外的所有器官中均有总体表达，在甘蓝型油菜中以蕾和花中最高，其它器官间差异不大，在白菜中也是以蕾和花中最高，下胚轴和茎中较低，在甘蓝中子叶、叶、花、细嫩种子中均有相似的较高水平表达，同样是下中轴和茎中较低。BnMYBL2基因家族各成员的器官特异性相似，但BnMYBL2-1和BnMYBL2-2比BnMYBL2-3和BnMYBL2-4要高。BrMYBL2基因家族2个成员的器官特异性基本相似，但BrMYBL2-1比BrMYBL2-2表达水平略低且在后期种子中不表达。BoMYBL2基因家族2个成员的器官特异性也基本相似，但BoMYBL2-1比BoMYBL2-2表达水平略低。

RT-PCR还表明，甘蓝型油菜黄籽材料的蕾、花、25D、30D和45D种子中BnMYBL2的总体和4个BnMYBL2成员的表达水平均比黑籽中发生明显上调，55D种子中相似；白菜各发育阶段的种子中BrMYBL2的总体表达在黄籽与黑籽间没有明显差异，甚至黄籽的蕾和花中的表达水平比黑籽明显下调；甘蓝的黄籽材料的主要发育阶段的种子中BoMYBL2家族2个成员的表达水平均比黑籽有明显的上调，尽管其它器官中差异不大。

三、芸薹属MYBL2基因家族的应用

1、BnMYBL2基因家族成员正义片段的克隆

采用甘蓝型油菜5B混合总cDNA或基因组DNA为模板，采用引物组合FBML2CRab+RBML2a、FBML2CRab+RBML2b、FBML2CRcd+RBML2c、FBML2CRcd+RBML2d分别扩增BnMYBL2基因家族4个成员的正义片段(BnMYBL2-1ox、BnMYBL2-2ox、BnMYBL2-3ox、BnMYBL2-4ox)，电泳显示的产物片段大小与预期相同，前三者来源于为cDNA，BnMYBL2-4ox来源于gDNA(图8)。将其分别回收，与pGEM T-easy连接，转化DH5α，挑选PCR阳性的单克隆菌液测序，结果显示，BnMYBL2-1ox、BnMYBL2-2ox、BnMYBL2-3ox、BnMYBL2-4ox的长度分别为695bp、720bp、694bp、921bp，与该基因的全长cDNA或gDNA序列相比，除了不含有5’UTR以外，其它区间一致，没有突变。

2、BnMYBL2基因家族成员正义转化植物表达载体的构建

采用SpeI+SacI完全双酶切方式，将BnMYBL2-1ox、BnMYBL2-2ox、BnMYBL2-3ox、BnMYBL2-4ox从重组T-载体质粒上切下并回收。同时用XbaI+SacI完全双酶切载体pC2301M1DPB并回收开环的载体骨架(图9)。利用T4 DNA聚合酶，将目的基因分别与载体骨架进行粘性末端的标准连接，形成正义植物表达载体pCD-BnMYBL2-1ox、pCD-BnMYBL2-2ox、pCD-BnMYBL2-3ox和pCD-BnMYBL2-4ox，目的基因由CaMV35S启动子驱动，后接NOS终止子，形成表达盒。将其转化DH5α，得到抗Kan的克隆子，分别经各引物组合进行PCR检测，阳性克隆子提取质粒转化根癌农杆菌LBA4404，PCR阳性克隆子即为工程菌株(图10)。

3、农杆菌介导的正义超量植物表达载体pCD-BnMYBL2-2ox转化黑籽甘蓝型油菜

所有组织培养操作均在标准的植物组织培养条件下进行，超净工作台、培养间、驯化间的洁净级别分别为100级、10000级和100000级，相应试剂、材料、器皿均按规程进行无菌处理。甘蓝型油菜典型黑籽品种中双10号种子在清水中浸泡1～2h，用75％乙醇表面消毒1min，用无菌水冲洗3次，再用0.1％升汞浸泡15min，无菌水多次冲洗干净，然后接种于MS固体培养基[MS粉4.41g/L+Phytagel 2.6g/L+蔗糖30.0mg/L，pH5.8，灭菌锅温热灭菌；不加Phytagel即为液体培养基]上，25℃、2000Lux光照、16h/d光周期培养(后面的组培间培养条件除特别注明者外，均与此相同)。切取苗龄8天左右无菌苗的下胚轴，切成长约0.5-1.0cm的小段，接种到预培培养基MSp[MS培养基+1.0mg/L 6-苄基氨基嘌呤(6-BA)+1.0mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)]上预培养3天。

-80℃保存的工程菌株在加有100.0mg/L Kan+20.0mg/L Str+40.0mg/L Rif的LB液体培养基中于28℃、250r/min振荡培养1-2天，使农杆菌生长至对数期，转接培养1次，5000rpm、10min室温离心收集菌体，用浸染培养基MSm[MS液体培养基+1.0mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)+1.0mg/L 6-苄基氨基嘌呤(6-BA)+100μM乙酰丁香酮(AS)]调节细菌浓度至OD600约0.5，即为浸染液。

将预培养后的下胚轴段浸入浸染液中5-10min，期间间歇性轻轻摇荡，然后将小胚轴段在灭菌纸上吸干多余的菌液，接种到共培培养基MSc[MS固体培养基+1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L 2，4-D+50μM AS]中，23.5℃暗培养48小时。用杀菌液体培养基MSk[MS液体培养基+1.0mg/L 2，4-D+1.0mg/L 6-BA+500mg/L头孢霉素(Cef)]浸泡洗涤外植体3×10min，用灭菌纸吸干表面液体，转接到诱导筛选培养基MSi[MS固体培养基+1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L 2，4-D+500mg/L Cef+15ppm Basta]中培养，约2周继代1次，至长出肉眼可见的抗性愈伤，再转接到分化培养基MSd[MS固体培养基+4.0mg/L 6-BA+2.0mg/L玉米素(ZT)+5.0mg/L AgN03+500mg/L Cef+15ppm Basta]中培养14天以上，诱导愈伤组织分化出小芽(图11)，再转接到茎分化培养基MSs(MS固体培养基+3.0mg/L 6-BA+2.0mg/L ZT+500mg/L Cef+10ppm Basta)中培养至长出小茎，再转接到长茎培养基MSe(M固体培养基+0.05mg/L 6-BA+500mg/LCef+10ppm Basta)中培养至长完整的茎片，再转接到生根培养基MSr[MS固体培养基+2mg/L萘乙酸(NAA)]中培养至长出发达根系(图12)，生根后的小苗经驯化后，移栽到含有灭菌珍珠岩、蛭石、草炭土(质量比为1∶1∶1)混合物的盆钵中，按温室盆栽进行管理，最终获得6株转基因再生植株(图13)。

同时，以无Basta筛选压的相同组培条件下获得的中双10号再生植株为非转基因阴性对照。

4、转基因植株的鉴定

(1)转基因植株的Basta复检鉴定

用浓度为200ppm的Basta溶液对6株转基因再生植株(#1～#6)和阴性对照植株的叶片进行涂染处理(图14)，结果显示这6株都是阳性植株，均抗Basta。

(2)转基因植株的PCR鉴定

分别取6株转基因再生植株和阴性对照植株的叶片，提取基因组总DNA，采用FBML2CRab+RNOS5N、F35S3ND+RBML2b、FBAR+RBAR、FGUS+RGUS、FNPT2+RNPT2、F35S3ND+RNOS5N这6对引物组合进行复合PCR检测。结果显示，这6株转基因再生植株在6种引物组合的检测下，都分别扩出了与阳性对照(CK1，工程菌株)一样大小的条带，而阴性对照植株(CK2)无条带，证明这6株均为转基因阳性植株(图15)。

5、转基因植株的性状调查

在转基因植株生长发育的过程中，对转基因植株与非转基因植株的长势、株型、花、蕾、叶、荚果等形态特征进行了比较观察，结果发现，两者并无明显差异，长势基本一致，株型也没有明显变化，花色均为鲜黄色，叶片均为钝尖型，结荚也正常，说明超量表达BnMYBL2基因家族成员后，包括基本生长发育在内的背景性状没有明显改变。但是，转基因种子的种皮色素明显减少，种子外观呈黄褐色和黄棕色，同时种皮变薄，与非转基因种子的典型黑色种皮形成了鲜明对比(图16)。表明甘蓝型油菜等芸薹属植物MYBL2基因家族是种皮色素等性状的负调控基因，在黑籽甘蓝型油菜中超量表达后能够达到抑制种皮色素积累的效果，创造出新型的甘蓝型油菜黄籽材料。

最后说明的是，以上实施例仅用以举例说明本发明的技术方案，但并非限制于此。尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。这里特别申明，应用形式上的如下改变也都必然属于本发明的精神和范围所覆盖：

1、本发明中的基因和其片段，除了序列表中所列的核苷酸序列以外，也包括来自于这3个物种的其它MYBL2等位基因的序列，还包括来自于这3个物种的其它亚种、生态型或品种的MYBL2基因序列，尽管它们与序列表中所列的核苷酸序列可能有小的差异。

2、本发明中的基因和其片段，除了序列表中所列的核苷酸序列以外，也包括与它们在连续80bp及以上有98.00％以上一致性的任意核苷酸序列。

3、本发明中所构建的4个超量表达载体，除了优选实施例中所举的转化pCD-BnMYBL2-2ox以外，转化其它任意一个载体也可获得相似的效果。

4、本发明中的基因和其片段，除了优选实施例中所举的用于甘蓝型油菜以外，还可以应用于其它物种。

5、本发明中的基因和其片段，除了优选实施例中所举的采用正义超量表达技术抑制花青素和原花青素的合成、创造转基因新型黄籽性状，还可以采用反义、RNA干扰、CRES-T等技术，来抑制MYBL2基因的表达，进而促进植物组织中花青素苷或原花青素的合成与积累，创造转基因的植株彩色性状。

6、本发明中的基因和其片段，除了优选实施例中所举的采用pC2301M1DPB进行载体构建以外，还以采用其它载体来进行载体构建；本发明中的载体构建物，除了优选实施例中所举的采用根癌农杆菌LBA4404介导的改良叶盘法进行转化以外，也可以采用其它方法进行植物转化。

Claims (7)

1.甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝MYBL2基因家族，其特征在于：

所述白菜MYBL2基因家族包括2个成员：BrMYBL2-1基因和BrMYBL2-2基因；所述BrMYBL2-1基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.2所示；所述BrMYBL2-2基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.4所示；

所述甘蓝MYBL2基因家族包括2个成员：BoMYBL2-1基因和BoMYBL2-2基因；所述BoMYBL2-1基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.6所示；所述BoMYBL2-2基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.8所示；

所述甘蓝型油菜MYBL2基因家族包括4个成员：BnMYBL2-1基因、BnMYBL2-2基因、BnMYBL2-3基因和BnMYBL2-4基因；所述BnMYBL2-1基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.10所示；所述BnMYBL2-2基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.12所示；所述BnMYBL2-3基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.14所示；所述BnMYBL2-4基因的全长cDNA序列如SEQ IDNo.16所示。

2.根据权利要求1所述的甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝MYBL2基因家族，其特征在于：

所述BrMYBL2-1基因的基因组序列如SEQ ID No.1所示；所述BrMYBL2-2基因的基因组序列如SEQ ID No.3所示；

所述BoMYBL2-1基因的基因组序列如SEQ ID No.5所示；所述BoMYBL2-2基因的基因组序列如SEQ ID No.7所示；

所述BnMYBL2-1基因的基因组序列如SEQ ID No.9所示，所述BnMYBL2-2基因的基因组序列如SEQ ID No.11所示，所述BnMYBL2-3基因的基因组序列如SEQ ID No.13所示，所述BnMYBL2-4基因的基因组序列如SEQ ID No.15所示。

3.含有权利要求1或2所述甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝MYBL2基因家族中任一种或多种基因或基因截短片段的重组表达载体。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为含有BnMYBL2基因家族正义超量表达片段BnMYBL2-1ox、BnMYBL2-2ox、BnMYBL2-3ox或BnMYBL2-4ox的正义超量植物表达载体，所述BnMYBL2-1ox的核苷酸序列如SEQ ID No.10的231-914bp所示，所述BnMYBL2-2ox的核苷酸序列如SEQ ID No.12的190-898bp所示，所述BnMYBL2-3ox的核苷酸序列如SEQ ID No.14的48-729bp所示，所述BnMYBL2-4ox的核苷酸序列如SEQ ID No.15的48-956bp所示。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述正义超量植物表达载体是将正义超量表达片段BnMYBL2-1ox、BnMYBL2-2ox、BnMYBL2-3ox或BnMYBL2-4ox插入pC2301DPB载体的D35SFL启动子和NOS终止子之间而得到。

6.含有权利要求3或4或5所述重组表达载体的转化体。

7.权利要求1或2所述甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝MYBL2基因家族在植物种皮颜色、种皮厚度性状的分子育种中的应用。

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