CN109913470A - 超量表达甘蓝myb55在甘蓝型油菜分子育种中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了超量表达甘蓝MYB55在甘蓝型油菜分子育种中的应用，通过构建正义超量表达植物载体，转化黑籽甘蓝型油菜品种中双10号后，获得转基因阳性植株。与非转基因的对照植株相比，转基因植株的农艺学形态发生了变化，转基因植株生育期稍延迟3‑5天左右，植株营养器官增大；分枝数及角果数显著增加，提高产量；植株组织解剖显微观察得出，转基因植株茎秆维管束更发达、木质部增厚；对植株收获期茎秆抗折力测定，发现转基因植株的抗折力大大提升，表明BoMYB55参与正调控植株抗倒过程；另外转基因植株叶片接种核盘菌，病斑显著变小；表明BoMYB55不仅能改善植物的生长发育、增加其产量，还参与植物抗倒和抗核盘菌的过程。

Description

超量表达甘蓝MYB55在甘蓝型油菜分子育种中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及超量表达甘蓝MYB55在甘蓝型油菜分子育种中的应用，涉及超量表达甘蓝(Brassica oleracea)MYB55改善生长发育、增产和抗病。

背景技术

甘蓝是一种重要的十字花科芸薹属物种，包含多种栽培类型和野生类型。甘蓝含有很丰富的营养元素，如优质蛋白，纤维素，矿物质，维生素等，其丰富的抗氧化成分，可增强体内酵素系统的解毒能力，中和毒素对DNA产生的伤害，也可预防癌细胞转移。所以甘蓝是全世界重要的蔬菜之一，但其在栽培过程中常常会遭受各种各样的逆境的严重影响，造成巨大损失，尤其是菌核病。所以改善其生长发育过程和提高其对菌核病的抗性是目前甘蓝育种的重要核心目标。

模式生物拟南芥与甘蓝同为十字花科植物，所以拟南芥功能基因组学的研究成果，可以为甘蓝的各种分子机理和基因组学的研究提供依据。前人报道，在拟南芥中AtMYB55参与叶片的形态建成，以及在根中能与AtIRX11互作，而AtIRX11已被证实受SND1和MYB46上调，推测其可能参与次生细胞壁的生物合成。另外，甘蓝型油菜为甘蓝与白菜的异源四倍体，所以，油菜中的基因功能研究同样为甘蓝的基因研究提供依据。Zhao等人在核盘菌处理油菜后的表达谱分析中发现，BnMYB55参与油菜抗菌核病过程。但是，目前甘蓝MYB55基因的成员数、蛋白特征、进化关系、表达的组织特异性、与生长发育、增产、抗倒和抗病的关系和在基因工程中的应用等都未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种超量表达甘蓝MYB55在改善甘蓝型油菜生长发育指标中的应用；本发明的目的之二在于提供超量表达甘蓝MYB55在提高甘蓝型油菜产量中的应用；本发明的目的之三在于提供超量表达甘蓝MYB55在提高甘蓝型油菜抗倒或/和抵抗菌核病中的应用；本发明的目的之四在于提供一种获得高产、抗倒抗病和生长发育优良的甘蓝型油菜的方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、超量表达甘蓝MYB55在改善甘蓝型油菜生长发育指标中的应用，其特征在于：所述甘蓝MYB55的氨基酸序列如SEQ ID No.13所示。

优选的，所述甘蓝MYB55的全长cDNA序列如SEQ ID No.11所示。

优选的，所述甘蓝MYB55的基因组序列如SEQ ID No.12所示。

优选的，改善生长发育指标为茎秆变粗，叶面积变大，根变长、根变粗、须根增加、分枝数增加和角果数增加中的至少一种。

优选的，所述超量表达甘蓝MYB55的方法为将甘蓝MYB55基因构建正义超量表达植物表达载体，然后构建转化体转化甘蓝型油菜，筛选转基因植株即获得超量表达甘蓝MYB55的甘蓝型油菜。

优选的，所述植物表达载体由SEQ ID NO.11所示的151-1161bp插入pFGC5941M载体的CaMV35S启动子和OCS终止子之间而得。

优选的，所述转化子为含所述植物表达载体的根癌农杆菌LBA4404。

2、超量表达甘蓝MYB55在提高甘蓝型油菜产量中的应用。

3、超量表达甘蓝MYB55在提高甘蓝型油菜抗倒或/和抵抗菌核病中的应用。

4、一种获得高产、抗倒抗病和生长发育优良的甘蓝型油菜的方法，包括如下步骤：将SEQ ID NO.11所示的151-1161bp插入pFGC5941M载体的CaMV35S启动子和OCS终止子之间获得超量表达甘蓝MYB55的植物表达载体，然后转化农杆菌获得工程菌，将获得的工程菌转化甘蓝型油菜宿主，筛选转基因植株即获得高产、抗倒抗病和生长发育优良的甘蓝型油菜。

优选的，所述甘蓝型油菜宿主为甘蓝型油菜典型黑籽品种中双10号种子。

本发明的有益效果在于：本发明提供了MYB55基因在甘蓝的成员数及其全长cDNA序列和基因组序列、编码蛋白特征、进化关系、表达的器官组织特异性等，并确认了MYB55基因表达显著上调使甘蓝型油菜生长发育改善，如茎、根的木质部大大加厚，茎、根更粗，一次分枝数略有增加，二次分枝数大大增加；单株荚角数大大增加，单株产量大大提高，提高产量；转基因植株的茎秆木质部变厚，抗折力提升，再加上根系变得更发达，最终使转基因植株抗倒伏能力增加，另外对转基因植株茎秆接种核盘菌，病斑显著比野生型植株小。

因此MYB55基因能够使甘蓝型油菜整体生长发育和株型在农学上有很大的改进，抗倒伏性大大提高，对油菜至今没有攻克的癌症性病害——菌核病的抗性大大提高，且性状的逆向变化即副作用很少，因此可用于甘蓝型油菜的分子育种。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为甘蓝BoMYB55基因家族全长cDNA(A)和基因组DNA(B)扩增的电泳图。

图2为BoMYB55蛋白的二级结构；纵向从长到短的4种线段分别表示α螺旋、延伸链、β转角和随机卷曲；数字表示蛋白的氨基酸残基的计数。

图3为BoMYB55蛋白的三级结构。

图4为BoMYB55家族与部分拟南芥MYB转录因子的系统发育关系。

图5为BoMYB55(A)家族基因的RT-PCR检测，Ro：根；St：茎；Le：叶；Fl：花；Se：花后30d种子；SP：荚果皮。

图6为BoMYB55的超量表达载体图谱。

图7为超量表达BoMYB55组培过程。

图8为转基因植株PCR鉴定及其与对照植株表达水平的比较。

图9为转基因植株生长发育表型变化。

图10为转基因植株产量表型变化。

图11为转基因植株组织解剖结构变化(A,B分别为WT和转基因植株；Bar：500um)。

图12为转基因植株抗折力变化。

图13为转基因植株抗病表型变化。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

优选实施例采用的植物材料：甘蓝为Brassica oleracea var.acephala，由重庆市油菜工程技术研究中心提供，常规大田试验条件种植。黑籽油菜品种“中双10号”的种子由中国农业科学院油料作物研究所的张学昆研究员提供。

优选实施例采用的试剂及试剂盒：EASYspin植物RNA快速提取试剂盒购自北京博迈德生物技术有限公司；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect RealTime)反转录试剂盒购自大连TaKaRa公司；荧光定量试剂盒FastStart Essential DNAGreen Master购自Roche公司；各种限制性内切酶XbaI、BamHI和SacI等为立陶宛MBIFermentas公司产品；Murashige&Skoog(MS)培养基购自荷兰Duchefa公司；GoldView核酸染料购自北京赛百盛基因技术有限公司；CTAB、TE buffer、DNA Loading Buffer、利福平(Rif)、链霉素(Str)、卡那霉素(Kan)、氨苄青霉素(Amp)、头孢噻肟钠(Cef)、琼脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物、asta除草剂均购自上海生工生物工程技术服务有限公司；

优选实施例采用的主要仪器：美国Applied Biosystems公司ABI 9700型PCR仪，Bio-Rad CFX96Touch^TM荧光定量PCR仪；以及分子生物学和植物基因工程的其它常规仪器、设备和设施。

实施例1、甘蓝MYB55基因家族的克隆

本发明实施例所用引物见表1。

表1、本发明实施例所用引物

1、甘蓝基因组总DNA和总RNA的提取

取甘蓝植株的嫩叶，采用十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)法提取基因组总DNA，采用1.0％琼脂糖凝胶电泳法和分光光度法评价核酸样品的质量和浓度。同时，以甘蓝的根、茎、叶、花、花后30d的种子、花后20d的荚果皮为材料，采用柱式小量植物总RNA抽提试剂盒按说明书提取总RNA，用DNase I去除DNA杂质，总RNA乙醇沉淀后溶于纯水。核酸样品采用1％琼脂糖凝胶电泳检测质量，用Nanodrop紫外分光光度计测定浓度和纯度。

电泳结果表明，用CTAB法提取的甘蓝基因组总DNA的完整性好，RNA消化完全，分光光度法检测的纯度也较高，可用于PCR扩增及Southern杂交实验。电泳分析表明，获得的总RNA特征条带清晰，无明显RNA降解和DNA污染，分光光度法检测评价的质量也较好，能够满足下游实验的要求。

2、甘蓝各器官总cDNA第一链的获得

将上述1中所提的RNA等量混合后用Takara公司的PrimeScript RT reagent Kitwith gDNA Eraser(Perfect Real Time)反转录试剂盒，得到甘蓝各器官总cDNA第一链。

3、甘蓝MYB55基因家族的电子克隆

拟南芥MYB55基因(AtMYB55)位于4号染色体(AT4G01680)上，其cDNA(AT4G01680)为1248bp。将其cDNA序列提交到NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)网站上进行核酸序列比对(nucleotide blast)，在Organism中输入Brassica oleracea(taxid:3712)，在Database中选择Others和Refrence RNA sequence(refseq-rna)，在Optimize for选择Somewhat similar sequences(blatsn)，然后点击BLAST进行比对，比对结果显示GenBank中没有注释成BoMYB55的基因，但有1条注释的其他MYB转录因子的基因同源分值较高，将其创建序列到拟南芥网站去比对，发现其为拟南芥AtMYB55的垂直同源基因，所以推测甘蓝中可能只存在1条MYB55基因，对应的独立基因命名为BoMYB55。

4、甘蓝MYB55基因家族全长cDNA的克隆

以甘蓝混合器官总cDNA第一链为模板，以表1所列的引物组合进行PCR扩增，PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳显示，引物组合FBoMYB55+RBoMYB55扩增出了一条约1400bp的条带(图1，A)。胶回收、TA克隆后，批量克隆子的菌液PCR检测表明插入片段长度出现了多态性，均送样测序，测序结果的BLASTn以及与AtMYB55的比对表明它是甘蓝MYB55基因，条带测序获得的标准全长cDNA的长度均为1411bp，命名为BoMYB55mRNA，如SEQ ID NO.11所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。

5、甘蓝MYB55基因家族基因组DNA的克隆

将模板替换成甘蓝基因组总DNA，进行与前面一样的PCR扩增，电泳结果显示，引物组合FBoMYB55+RBoMYB55扩增出了一条约1600bp的条带(图1，B)。胶回收、TA克隆后，菌液PCR检测没有多态性，测序获得的准确长度为1606bp，命名为BoMYB55gene，如SEQ ID NO.12所示。

实施例2、BoMYB55基因家族的生物信息学分析

在Vector NTI Advance 11.5上进行序列比对、开放阅读框(ORF)查找与翻译，在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/网站上进行BLAST和蛋白序列的CDD搜索，在http://bip.weizmann.ac.il/和www.expasy.org等网站提供链接的生物信息学网站上进行蛋白质结构分析，在http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html和http://www.ebi.ac.uk/clustalw/等网站上进行基因和蛋白质序列多重比对和聚类分析。

1、甘蓝MYB55基因家族的结构分析

1.1甘蓝MYB55基因家族的结构参数

BoMYB55基因的DNA序列为1606bp，均有3个外显子和2个内含子，最长标准mRNA均为1411bp，最长5′非编码区(5′UTR)为150bp，最长3′UTR为250bp，编码区(开放读码框ORF，包括终止密码子)为1011bp，编码区的GC含量为42.93％，明显高于非编码区(5′UTR+3′UTR+内含子)的GC含量(29.65％)，符合功能基因的结构特点(表2)。

表2、BoMYB55家族基因的基本特征

1.2甘蓝MYB55家族蛋白的基本参数、亚细胞定位和可能的转录后修饰

推导的BoMYB55蛋白均为336个氨基酸残基，分子量为37.68kD，等电点均为6.93，带电氨基酸占32.15％，酸性氨基酸占10.42％，碱性氨基酸占11.39％，极性氨基酸占37.39％，疏水氨基酸占26.7％，为碱性蛋白，单个氨基酸中以亮氨酸含量最高，其次是苏氨酸，然后是丝氨酸。

SignalP5.0预测它们没有信号肽。Softberry-ProComp、WoLFPSORT和Plant-mPLoc均预测它们定位于细胞核；TMpred预测它们没有任何跨膜域。NetPhos 3.1预测它们有52个潜在的磷酸化位点，主要是丝氨酸磷酸化位点(表3)。

表3、BoMYB55家族编码蛋白的基本特征

蛋白名称	BoMYB55	蛋白名称	BoMYB55
				氨基酸残基数(aa)	336	3种最丰氨基酸	L,T,S
分子量(kDa)	37.68	丝氨酸磷酸化位点数	28
				等电点	6.93	苏氨酸磷酸化位点数	21
电荷(pH 7)	-0.22	酪氨酸磷酸化位点数	3
				带电氨基酸比例(％)	32.15	保守域	SANT
酸性氨基酸比例(％)	10.42	α-螺旋(％)	27.68
				碱性氨基酸比例(％)	11.39	延伸链(％)	15.18
极性氨基酸比例(％)	37.39	β-转角(％)	8.33
				疏水氨基酸比例(％)	26.7	随机卷曲(％)	48.81

1.3甘蓝MYB55家族蛋白的保守域、保守基序和高级结构

NCBI保守域搜索(NCBI Conserved Domain Search)表明，BoMYB55家族1个蛋白为SANT保守域(cl28544)，该保守域是转录因子SWI3、ADA2、N-CoR和TFIIIB的DNA结合域。

SOPMA软件预测，BoMYB55的二级结构主要为随机卷曲(48.81％)，其次是α-螺旋(27.68％)和延伸链(15.18％)，β-转角(8.33％)(表3，图2)。

Swiss-Model预测到它们完整三维结构(图3)。

2、甘蓝MYB55家族的同源性和系统发生关系

2.1核酸与蛋白水平的同源性

Vector NTI上的两两比对表明，BoMYB55全长基因与AtMYB55的同源性最高，Vector NTI计算的gDNA水平一致率为70.8％，编码区水平的一致率为82.4％，编码蛋白水平的一致率和相似率分别为83.2％和85.5％(表4)。在核酸水平，它们还一些其它MYB基因有一定同源性。它们在编码区的保守性显著高于非编码区的保守性，但内含子在剪接边界处是保守的，5’UTR和3’UTR中也存在一些保守性的局部区域，应当与基因表达活动有关。在蛋白水平，它们还与许多其它MYB蛋白有一定同源性(图4)。

表4、BoMYB55基因与AtMYB55基因之间的基因组序列一致率(斜体，上)、编码区一致率(斜体，下)、蛋白一致率(正体，上)和蛋白相似率(正体，下)(％)

2.2系统发生关系

将BLASTp显示的与甘蓝MYB55有相似性的拟南芥MYB蛋白下载，与甘蓝MYB55蛋白一起在Vector NTI Advance上利用ClustalW多重比对而构建系统树(图4，C)。系统树上揭示了甘蓝MYB55蛋白和拟南芥MYB55首先聚为一类，表明甘蓝MYB55蛋白是AtMYB55的垂直同源基因(orthologs)。

实施例3、甘蓝MYB55家族表达特征和抗菌核病的关系

选择甘蓝典型黑籽系材料的根、茎、叶、花、花后30d的种子、花后20d的荚果皮6个组织器官以及接种核盘菌0h、0.5h、3h、9h、24h和48h后病斑周围2cm成熟叶片的RNA样品作为模板，采用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录为总cDNA，用荧光定量RT-PCR分析MYB55基因家族表达组织性特征。用引物组合FBoMYB55Q+RBoMYB55Q检测BoMYB55的表达水平，反应均在25μl标准FastStart Essential DNA Green Master-PCR体系中进行，PCR反应的程序皆为：95℃预变性10min→45个扩增循环(95℃变性10s→62℃退火30s)→熔解曲线65℃到95℃。

RT-PCR结果表明BoMYB55在以上器官都有表达，但在茎中显著表达，其表达量远远高于其它器官。另外，BoMYB55受菌核病快速诱导，在接种核盘菌0.5h后迅速上调。说明BoMYB55参与油菜抗核盘菌过程(图5)。

实施例4、甘蓝MYB55基因家族的应用

1、BoMYB55基因家族成员正义片段的克隆

采用甘蓝混合总cDNA为模板，采用引物组合FBMYB55OE+RBMYB55OE扩增BoMYB55基因的正义片段(BoMYB55ox)，电泳显示的产物片段大小与预期相同。将其分别回收，与pMD19-T连接，转化DH5α，挑选PCR阳性的单克隆菌液测序，结果显示，BoMYB55ox的长度为1011bp，与该基因的全长cDNA序列相比，除了不含有5’UTR以外，其它区间一致，没有突变。

2、BoMYB55基因家族成员正义转化植物表达载体的构建

基因片段采用XbaI完全单酶切，回收1029bp的基因片段备用。基因片段用微量NcoI进行极短时间、精确到分钟的部分酶切(中间采用冰水浴停切，电泳时显示为1019/1029、919、843、743、182、106bp六带等量共存时为最佳状态，1019bp片段缺失或量极少则表示失败，需要进一步减少NcoI酶量和缩短酶切时间)，回收1019bp完整基因片段条带备用(其它条带均为不完整基因片段)。pFGC5941M采用NcoI+XbaI完全酶切后回收骨架备用。基因与载体骨架之间进行粘性末端连接，使目标基因亚克隆到pFGC5941M中CaMV 35S启动子与OCS 3’之间，形成超量表达载体pFGC5941M-BoMYB55ox。将其转化DH5α，得到抗Kan的克隆子，分别经各引物组合进行PCR检测，阳性克隆子提取质粒转化根癌农杆菌LBA4404，PCR阳性克隆子即为工程菌株(图6)。

3、农杆菌介导的正义超量植物表达载体pFGC5941M-BoMYB55ox转化黑籽甘蓝型油菜

所有组织培养操作均在标准的植物组织培养条件下进行，超净工作台、培养间、驯化间的洁净级别分别为100级、10000级和100000级，相应试剂、材料、器皿均按规程进行无菌处理。甘蓝型油菜典型黑籽品种中双10号种子在清水中浸泡1～2h后，用75％乙醇表面消毒1min后用无菌水冲洗3次，然后用0.1％升汞浸泡15min，无菌水多次冲洗干净，然后接种于MS固体培养基[MS粉4.41g/L+Phytagel 2.6g/L+蔗糖30.0mg/L，pH5.8，灭菌锅温热灭菌；不加Phytagel即为液体培养基]上，25℃、2000Lux光照、16h/d光周期培养(后面的组培间培养条件除特别注明者外，均与此相同)。切取苗龄8天左右无菌苗的下胚轴切成长约0.5～1.0cm的小段，接种到预培培养基MSp[MS培养基+1.0mg/L 6-苄基氨基嘌呤(6-BA)+1.0mg/L2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)]上预培养3天。

-80℃保存的工程菌株在加有100.0mg/L Kan+20.0mg/L Str+40.0mg/L Rif的LB液体培养基中于28℃、250r/min振荡培养1～2天，使农杆菌生长至对数期，转接培养一次。5000rpm、10min室温离心收集菌体，用浸染培养基MSm[MS液体培养基+1.0mg/L 2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)+1.0mg/L 6-苄基氨基嘌呤(6-BA)+100μM乙酰丁香酮(AS)]调节细菌浓度至OD₆₀₀约0.5左右，即为浸染液。

将预培养后的下胚轴段浸入浸染液中5-10min，期间间歇性轻轻摇荡，然后将小胚轴段在灭菌纸上吸干多余的菌液，接种到共培培养基MSc[MS固体培养基+1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L 2,4-D+50μM AS]中，23.5℃暗培养48小时。用杀菌液体培养基MSk[MS液体培养基+1.0mg/L 2,4-D+1.0mg/L 6-BA+500mg/L头孢霉素(Cef)]浸泡洗涤外植体3×10min，用灭菌纸吸干表面液体，转接到诱导筛选培养基MSi[MS固体培养基+1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L2,4-D+500mg/L Cef+15ppm Basta]中培养，约2周继代1次，至长出肉眼可见的抗性愈伤，再转接到分化培养基MSd[MS固体培养基+4.0mg/L 6-BA+2.0mg/L玉米素(ZT)+5.0mg/L AgNO₃+500mg/L Cef+15ppm Basta]中培养14天以上，诱导愈伤组织分化出小芽，再转接到茎分化培养基MSs(MS固体培养基+3.0mg/L 6-BA+2.0mg/L ZT+500mg/L Cef+10ppm Basta)中培养至长出小茎，再转接到长茎培养基MSe(M固体培养基+0.05mg/L 6-BA+500mg/L Cef+10ppmBasta)中培养至长完整的茎片，再转接到生根培养基MSr[MS固体培养基+2mg/L萘乙酸(NAA)]中培养至长出发达根系，生根后的小苗经驯化后，移栽到含有灭菌珍珠岩、蛭石、草炭土(质量比为1:1:1)混合物的盆钵中，按温室盆栽进行管理，最终获得多株再生植株(图7)。

同时，以无Basta筛选压的相同组培条件下获得的中双10号再生植株为非转基因阴性对照。

4、转基因植株的鉴定

(1)转基因植株的Basta复检鉴定

用浓度为200ppm的Basta溶液对转基因再生植株和对照植株的叶片进行涂染处理。

(2)转基因植株的PCR鉴定

分别取转基因再生植株和阴性对照植株的叶片，提取基因组总DNA，采用FBMYB55OE+ROCST5N和F35S3N+RBMYB55OE这2对引物组合进行复合PCR检测。阳性转基因再生植株在2种引物组合的检测下，都能扩出与阳性对照(CK+，工程菌株)一样大小的条带，而阴性对照植株(WT)则无条带(图8)。

5、转基因植株性状的调查

转基因植株在植株的整个生长发育进程中都比对照稍延迟，大概3-5天。虽然生育进程稍晚，但是转基因植株的营养器官却比对照野生型植株大，例如茎秆变粗，叶面积变大，根长、根粗、须根数增加(图9)。转基因植株的生殖器官大小无明显变化，但是分枝数及角果数显著增加，所以产量是增加的(图10)。对植株茎秆解剖发现，转基因植株茎秆维管束变发达，木质部变厚(图11)。植株抗折力分析，表明转基因植株茎秆折抗力显著增加(图12)。最后，取9-12叶期对照和转基因植株倒3或倒4片真叶离体接种核盘菌24h后统计叶片菌斑面积。根据统计结果发现，超量表达BoMYB55的转基因植株的叶片菌斑面积显著减少(图13)。综上所述，可以推测出BoMYB55参与植株的生长发育、抗倒和抗病过程，且都呈正向调控。

6、应用形式的其它说明

1、本发明中的基因和其片段，除了序列表中所列的核苷酸序列以外，也包括来自甘蓝的其它MYB55等位基因的序列，还包括来自于甘蓝的其它亚种、生态型或品种的MYB55基因序列，尽管它们与序列表中所列的核苷酸序列可能有小的差异。

2、本发明中的基因和其片段，除了序列表中所列的核苷酸序列以外，也包括与它们在连续80bp及以上有98.00％以上一致性的任意核苷酸序列。

3、本发明中所构建的超量表达载体中，除了像优先实施例中所举的转化pFGC5941M-BoMYB55ox以外，转化其它任意一个载体也可获得相似的效果。

4、本发明中的基因和其片段，除了像优先实施例中所举的用于甘蓝型油菜以外，还可以应用于其它物种。

5、本发明中的基因和其片段，除了像优先实施例中所举的采用正义超量表达技术改善植物生长发育、增产和抗病等性状，还可以采用反义、RNA干扰、CRES-T等技术，来抑制MYB55基因的表达，进而影响植物的生长发育、减产、倒伏和感病等性状。

6、本发明中的基因和其片段，除了像优先实施例中所举的采用pFGC5941M进行载体构建以外，还以采用其它载体来进行载体构建；本发明中的载体构建物，除了像优先实施例中所举的采用根癌农杆菌LBA4404介导的改良叶盘法进行转化以外，也可以采用其它方法进行植物转化。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 西南大学

<120> 超量表达甘蓝MYB55在甘蓝型油菜分子育种中的应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atcttctcac ttcaaactct ctctatc 27

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aagaaataaa tgtcattgat ccagcaagaa tag 33

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctcggtttaa ttgaattgga taactca 27

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cttccatggt taatccccaa ttc 23

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gatttctgcc cagtgctctg aa 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tctgccaagc ccgttccctt 20

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccatgggaag acattcatgc tgttac 26

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tctagattaa atatggccat atgcatgttg c 31

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggaagttcat ttcatttgga gag 23

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gctcaggttt tttacaacgt gcac 24

<210> 11

<211> 1411

<212> DNA

<213> 甘蓝(Brassica oleracea)

<400> 11

atcttctcac ttcaaactct ctctatctct ctctcacctc atcttaagat ttctctgaaa 60

gctgacttca aagccttttc taaagcaaac aagccgatcc ttctctaatt gatattttat 120

ttatatatat atatatatat aatttaaaag atgggaagac attcatgctg ttacaaacag 180

aagctgagga aaggactttg gtctcctgaa gaagacgaga agcttcttag gtacatcact 240

aagtacggcc atggctgctg gagctctgtc cctaaacaag ctggtttgca gagatgtgga 300

aagagctgta gattaagatg gataaactat ctaagaccag atttgaagcg aggagcattt 360

tcacaggatg aagaaaacct tattattgaa cttcatgccg ttcttggcaa caggtggtct 420

cagattgctg cacagcttcc tggtagaacc gacaatgaaa tcaaaaatct atggaactct 480

tccttaaaga agaaactgag gttgagagga attgatccgg ttacacacaa gctcttagcc 540

gaaattgaaa ccggtacaga tgacaatacc acaccggttg agaagtgtca aacgacctac 600

ctcattgaga cagaaggctc ctctagtacc accactggca gtactaacca caacaacagc 660

aacaccgatc atctttatac cggaaatttt ggtttccaac ggttaagtct tgagactggt 720

tcaagaatac aaaccggaat ctggattccc caaaccggga gaaatcatca tgttgatacc 780

gtacctagtg cagtggtgct acccggttca atgttctcat ctggcttaac cgattcaaca 840

accggttaca gatcatccaa tctcggttta actgaattgg ataactcttt ctcgaccggg 900

ccaatgatta cagagcagca ccttcaagag agtaactaca acaattcgac attctttgga 960

actgggaatc ttagttgggg attaaccatg gaagaaaatc aatttacaat atcgaataat 1020

tcgttacaga atcactcaaa ctcgtcgttg tatagtgaaa tcaaatccga gaccaatttt 1080

ttcggtacgg aggctgcaaa tattggtatg tggccatgta accagcttca gcctcagcaa 1140

catgcatatg gccatattta aaaacttctt gtatattata aggtgtgtgg atcttctttt 1200

tcttcttcaa gttatttttc tttattccaa atatcgagtt ttatttataa tggtttgtga 1260

ctttgtgtat ataaagtttg tgttatattc atttaattta agggtgttgt tcttacattt 1320

tcttttattt gatgtacttt gtgaagcata gttttctgga ttttgagatt ttgtttgtgt 1380

attcttgctg gatcaatgac atttatttct t 1411

<210> 12

<211> 1606

<212> DNA

<213> 甘蓝(Brassica oleracea)

<400> 12

atcttctcac ttcaaactct ctctatctct ctctcacctc atcttaagat ttctctgaaa 60

gctgacttca aagccttttc taaagcaaac aagccgatcc ttctctaatt gatattttat 120

ttatatatat atatatatat aatttaaaag atgggaagac attcatgctg ttacaaacag 180

aagctgagga aaggactttg gtctcctgaa gaagacgaga agcttcttag gtacatcact 240

aagtacggcc atggctgctg gagctctgtc cctaaacaag ctggtaattt aatttctctt 300

tgctttcatc caattattat tttgttgtgc ttgattaata ctccttccta attcttgaat 360

tatcattttt ttattaattc ttttttaggt ttgcagagat gtggaaagag ctgtagatta 420

agatggataa actatctaag accagatttg aagcgaggag cattttcaca ggatgaagaa 480

aaccttatta ttgaacttca tgccgttctt ggcaacaggt aaagaacccc gtgctgtttc 540

tgctgatcct tatgaggcat gtaagtgtat ttatatatgt aacccatgtt gctttggtct 600

tggtttaggt ggtctcagat tgctgcacag cttcctggta gaaccgacaa tgaaatcaaa 660

aatctatgga actcttcctt aaagaagaaa ctgaggttga gaggaattga tccggttaca 720

cacaagctct tagccgaaat tgaaaccggt acagatgaca ataccacacc ggttgagaag 780

tgtcaaacga cctacctcat tgagacagaa ggctcctcta gtaccaccac tggcagtact 840

aaccacaaca acagcaacac cgatcatctt tataccggaa attttggttt ccaacggtta 900

agtcttgaga ctggttcaag aatacaaacc ggaatctgga ttccccaaac cgggagaaat 960

catcatgttg ataccgtacc tagtgcagtg gtgctacccg gttcaatgtt ctcatctggc 1020

ttaaccgatt caacaaccgg ttacagatca tccaatctcg gtttaactga attggataac 1080

tctttctcga ccgggccaat gattacagag cagcaccttc aagagagtaa ctacaacaat 1140

tcgacattct ttggaactgg gaatcttagt tggggattaa ccatggaaga aaatcaattt 1200

acaatatcga ataattcgtt acagaatcac tcaaactcgt cgttgtatag tgaaatcaaa 1260

tccgagacca attttttcgg tacggaggct gcaaatattg gtatgtggcc atgtaaccag 1320

cttcagcctc agcaacatgc atatggccat atttaaaaac ttcttgtata ttataaggtg 1380

tgtggatctt ctttttcttc ttcaagttat ttttctttat tccaaatatc gagttttatt 1440

tataatggtt tgtgactttg tgtatataaa gtttgtgtta tattcattta atttaagggt 1500

gttgttctta cattttcttt tatttgatgt actttgtgaa gcatagtttt ctggattttg 1560

agattttgtt tgtgtattct tgctggatca atgacattta tttctt 1606

<210> 13

<211> 336

<212> PRT

<213> 甘蓝(Brassica oleracea)

<400> 13

Met Gly Arg His Ser Cys Cys Tyr Lys Gln Lys Leu Arg Lys Gly Leu

1 5 10 15

Trp Ser Pro Glu Glu Asp Glu Lys Leu Leu Arg Tyr Ile Thr Lys Tyr

20 25 30

Gly His Gly Cys Trp Ser Ser Val Pro Lys Gln Ala Gly Leu Gln Arg

35 40 45

Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Ile Asn Tyr Leu Arg Pro Asp

50 55 60

Leu Lys Arg Gly Ala Phe Ser Gln Asp Glu Glu Asn Leu Ile Ile Glu

65 70 75 80

Leu His Ala Val Leu Gly Asn Arg Trp Ser Gln Ile Ala Ala Gln Leu

85 90 95

Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Leu Trp Asn Ser Ser Leu

100 105 110

Lys Lys Lys Leu Arg Leu Arg Gly Ile Asp Pro Val Thr His Lys Leu

115 120 125

Leu Ala Glu Ile Glu Thr Gly Thr Asp Asp Asn Thr Thr Pro Val Glu

130 135 140

Lys Cys Gln Thr Thr Tyr Leu Ile Glu Thr Glu Gly Ser Ser Ser Thr

145 150 155 160

Thr Thr Gly Ser Thr Asn His Asn Asn Ser Asn Thr Asp His Leu Tyr

165 170 175

Thr Gly Asn Phe Gly Phe Gln Arg Leu Ser Leu Glu Thr Gly Ser Arg

180 185 190

Ile Gln Thr Gly Ile Trp Ile Pro Gln Thr Gly Arg Asn His His Val

195 200 205

Asp Thr Val Pro Ser Ala Val Val Leu Pro Gly Ser Met Phe Ser Ser

210 215 220

Gly Leu Thr Asp Ser Thr Thr Gly Tyr Arg Ser Ser Asn Leu Gly Leu

225 230 235 240

Thr Glu Leu Asp Asn Ser Phe Ser Thr Gly Pro Met Ile Thr Glu Gln

245 250 255

His Leu Gln Glu Ser Asn Tyr Asn Asn Ser Thr Phe Phe Gly Thr Gly

260 265 270

Asn Leu Ser Trp Gly Leu Thr Met Glu Glu Asn Gln Phe Thr Ile Ser

275 280 285

Asn Asn Ser Leu Gln Asn His Ser Asn Ser Ser Leu Tyr Ser Glu Ile

290 295 300

Lys Ser Glu Thr Asn Phe Phe Gly Thr Glu Ala Ala Asn Ile Gly Met

305 310 315 320

Trp Pro Cys Asn Gln Leu Gln Pro Gln Gln His Ala Tyr Gly His Ile

325 330 335

Claims (10)

1.超量表达甘蓝MYB55在改善甘蓝型油菜生长发育指标中的应用，其特征在于：所述甘蓝MYB55的氨基酸序列如SEQ ID No.13所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述甘蓝MYB55的全长cDNA序列如SEQ IDNo.11所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述甘蓝MYB55的基因组序列如SEQ IDNo.12所示。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：改善生长发育指标为茎秆变粗，叶面积变大，根变长、根变粗、须根增加、分枝数增加和角果数增加中的至少一种。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述超量表达甘蓝MYB55的方法为将甘蓝MYB55基因构建正义超量表达植物表达载体，然后构建转化体转化甘蓝型油菜，筛选转基因植株即获得超量表达甘蓝MYB55的甘蓝型油菜。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述植物表达载体由SEQ ID NO.11所示的151-1161bp插入pFGC5941M载体的CaMV35S启动子和OCS终止子之间而得。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述转化子为含所述植物表达载体的根癌农杆菌LBA4404。

8.超量表达甘蓝MYB55在提高甘蓝型油菜产量中的应用。

9.超量表达甘蓝MYB55在提高甘蓝型油菜抗倒或/和抵抗菌核病中的应用。

10.一种获得高产、抗倒抗病和生长发育优良的甘蓝型油菜的方法，其特征在于，包括如下步骤：将SEQ ID NO.11所示的151-1161bp插入pFGC5941M载体的CaMV35S启动子和OCS终止子之间获得超量表达甘蓝MYB55的植物表达载体，然后转化农杆菌获得工程菌，将获得的工程菌转化甘蓝型油菜宿主，筛选转基因植株即获得高产、抗倒抗病和生长发育优良的甘蓝型油菜。