CN109943587B - PfFAD2基因和PfFAD3基因在大宗油料作物提高种子α-亚麻酸含量中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了PfFAD2基因和PfFAD3基因在大宗油料作物提高种子α‑亚麻酸含量中的应用，PfFAD2基因和PfFAD3基因通过LP4‑2A序列串联到同一个开放读码框(ORF)中，形成融合蛋白基因PfFAD2‑LP4‑2A‑PfFAD3。采用种子特异启动子驱动，构建植物表达载体，将其转入植物(比如，甘蓝型油菜)以后，转基因种子中ALA含量大幅提高，表明利用LP4‑2A技术融合双价表达紫苏PfFAD2和PfFAD3，可以创制高产ALA的转基因植物新资源材料，可用于工业提取ALA，或直接用于生产富含ALA的保健型食用油。

Description

PfFAD2基因和PfFAD3基因在大宗油料作物提高种子α-亚麻酸 含量中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及PfFAD2基因和PfFAD3基因在大宗油料作物提高种子α-亚麻酸含量中的应用。

背景技术

多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated Fatty Acids，PUFA)是在碳原子之间含有两个以上双键的不饱和脂肪酸，其代谢途径是以亚油酸(LA；C18:2Δ^9,12,n-6)为初始底物，在一系列脂肪酸脱饱和酶(脂肪酸脱氢酶)和脂肪酸延伸酶的催化下，生成γ-亚麻酸(GLA；C18:3Δ^6,9,12,n-6)、α-亚麻酸(α-linolenic acid,ALA；C18:3Δ^9,12,15,n-3)、十八碳四烯酸(SDA/OTA,C18:4Δ^6,9,12,15,n-3)、双高γ-亚麻酸(DHLG)、花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(EPA,n-3)、二十二碳五烯酸(DPA)、二十二碳六烯酸(DHA,n-3)等长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFAs)或超长链多不饱和脂肪酸(VLC-PUFAs)。

PUFA能促进生长发育，调节人体的脂质代谢，还能治疗和预防心脑血管疾病，同时具有免疫调节、抗癌、延缓衰老等重要的生理功能，对人类健康起到非常重要的作用。Ω3(n-3)系列脂肪酸对人体具有重要生理功能，其中ALA是合成n-3PUFA(SDA、EPA、DHA等)的前体。EPA是一类重要的多聚不饱和脂肪酸化学信使物，在免疫和炎症反应上起至关重要的作用。DPA是生成DHA的中间产物，对冠心病具有潜在的抑制作用。DHA是大脑和视网膜正常发育和发挥其正常功能所必需的，对智力和视力发挥着至关重要的作用。Ω6(n-6)系列脂肪酸对人体也具有重要生理功能，其中GLA、ARA除作为结构脂类外，还可进一步合成前列腺素(PG)而起重要的生理作用。

脂肪酸脱饱和酶2(FAD2)和脂肪酸脱饱和酶3(FAD3)是PUFA生物合成途径经最基础的两步限速酶，FAD2能够催化油酸(OA)形成亚油酸(LA)，FAD3能够催化亚油酸(LA)形成α亚麻酸(ALA)。

人体自身缺乏FAD2和FAD3基因和相应的酶，不能合成LA和ALA，因此LA和ALA是人体的必须性脂肪酸，只能通过饮食摄取。理论上人体只需要通过食物等途径摄入足够的LA和ALA，就可以利用人体自身的D6D等酶系统将它们分别合成为GLA、PG和EPA、DHA等高级脂肪酸。

现代人体营养学研究表明，人体每天摄入的Ω6/Ω3(即n6/n3)型脂肪酸比例维持在3.5/1的比例时最合理，否则会影响人体健康。但现实的情况是，现代人群的食谱结构普遍导致每天摄入的ALA不足，使这一比例远远高于3.5/1。正常人体需要摄取ALA约1.5g/天，目前人群ALA摄入量不能满足世界卫生组织(WHO)推荐量(1.25g/天)的一半，表明人类普遍缺乏ALA。鉴于此，WHO和联合国粮农组织(FAO)曾于1993年发表联合声明，决定在世界范围内专项推广ALA。因此，及时补充ALA对确保人体正常代谢和生理功能具有重要作用。

由于ALA含量与生物耐冷性呈正相关，而与耐热性呈负相关，因此长期适应于夏季高温季节开花结籽的植物，其种子发育时FAD3的功能很弱，种子贮存性油脂中ALA含量非常低甚至不含有。正因为如此，在大宗油料作物中，棕榈油、花生油、棉籽油、葵籽油即属于此类，仅凉季开花结籽的菜籽油、晚熟大豆油的ALA含量相对还算不低，橄榄油居于两类之间。由于ALA含有三个烯键，常规条件下贮存时易被氧化变质，而且油脂ALA含量与种子含油量之间似乎存在一定负相关，因此传统油菜和大豆育种采用了降低ALA的策略来延长籽油在常规条件下的贮存稳定性，但这却降低了油的营养保健价值，也加剧了当今世界性常规食谱中ALA不足、Ω6/Ω3比值过高的问题。

虽然ALA广泛存在于多种植物的种子油中，但大宗油料作物并不是富含ALA的，富含ALA的植物主要是一些小宗油料作物和有待开发的资源植物。目前已知ALA占种子油30％以上的植物有几十种以上，其中唇形科植物紫苏(Perilla frutescens,2n＝40)的籽油中ALA含量为50％-65％，位居已知油料作物中ALA含量的前茅。紫苏原产于东亚，单年生草本，为我国传统的药食两用植物，韩国、日本等许多亚洲国家有种植传统，美国、加拿大也开始种植，是世界性的小宗油料作物和药用植物。

由于富含ALA的小宗油料作物的种植面积普遍很小，且产量低，因此导致这些植物油本身及从其提取的ALA均价格昂贵，远远无法满足世界性ALA的需求量。受产量低、适应范围窄的限制，通过世界性大规模扩大小宗油料作物的种植面积来提升ALA产量的策略不太可行，而相对可行的一条途径是利用代谢工程将小宗油料作物中合成ALA的关键基因导入到大宗油料作物中，创制富含甚至高产ALA的大宗油料作物，除可以用来缓解大众食用油中ALA不足的问题，更可以用高产ALA的转基因植物种子来工业化提取ALA，满足日益扩大的特殊脂肪酸及保健品市场的需求。

大宗油料作物有多种，其中甘蓝型油菜(简称油菜，Brassica napus L.，2n＝38，AACC)为我国五大油料作物之首，经济性状好，产量高，含油量高，抗逆性强，是重要的食用油和蛋白质饲料来源，也是重要的工业原料。通过导入外源优势FAD2和FAD3基因，创高产ALA的新型油菜，其籽油可直接用于工业提取ALA或生产富含ALA的营养品，也可与缺乏ALA的棕榈油、花生油、棉籽油、葵籽油等调和后提高它们Ω3脂肪酸的丰度，降低Ω6/Ω3比值。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种紫苏脂肪酸脱饱和酶2基因和紫苏脂肪酸脱饱和酶3基因在大宗油料作物提高种子α-亚麻酸含量中的应用；本发明的目的之二在于提供一种提高大宗油料作物种子α-亚麻酸含量中的重组表达载体；本发明的目的之三在于提供一种获得高产α-亚麻酸的大宗油料作物的方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、紫苏脂肪酸脱饱和酶2基因和紫苏脂肪酸脱饱和酶3基因在大宗油料作物提高种子α-亚麻酸含量中的应用，所述紫苏脂肪酸脱饱和酶2基因编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.35所示，或如SEQ ID NO.35所示氨基酸序列取代、缺失或添加至少一个氨基酸，且来源于紫苏具脂肪酸脱饱和酶2活性的氨基酸序列；所述紫苏脂肪酸脱饱和酶3基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.37所示，或如SEQ ID NO.37所示氨基酸序列取代、缺失或添加至少一个氨基酸，且来源于紫苏具脂肪酸脱饱和酶3活性的氨基酸序列。

优选的，所述紫苏脂肪酸脱饱和酶2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示，或如SEQID NO.34所示核苷酸序列经取代、缺失或添加至少一个核苷酸，且来源于紫苏的编码脂肪酸脱饱和酶2活性的核苷酸序列；所述紫苏脂肪酸脱饱和酶3基因的核苷酸序列如SEQIDNO.36所示，或如SEQ ID NO.36所示核苷酸序列经取代、缺失或添加至少一个核苷酸，且来源于紫苏的编码脂肪酸脱饱和酶3活性的核苷酸序列。

更优选的，所述大宗油料作物为甘蓝型油菜。

2、一种提高大宗油料作物种子α-亚麻酸含量中的重组表达载体，其特征在于：所述重组载体含有紫苏脂肪酸脱饱和酶2基因和紫苏脂肪酸脱饱和酶3基因，所述紫苏脂肪酸脱饱和酶2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示，或如SEQ ID NO.34所示核苷酸序列经取代、缺失或添加至少一个核苷酸，且来源于紫苏的编码脂肪酸脱饱和酶2活性的核苷酸序列；所述紫苏脂肪酸脱饱和酶3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示，或如SEQ ID NO.36所示核苷酸序列经取代、缺失或添加至少一个核苷酸，且来源于紫苏的编码脂肪酸脱饱和酶3活性的核苷酸序列。

优选的，所述重组表达载体同时含有PfFAD2基因编码区、连接肽-内含肽LP4-2A编码区、PfFAD3基因编码区，三者串联形成一个融合蛋白基因PfFAD2-LP4-2A-PfFAD3，所述连接肽-内含肽LP4-2A编码区基因序列如SEQ ID No.27所示。

优选的，所述重组载体由以下方法制备：以SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29为引物，紫苏C2品种基因组为模板，扩增获得融合基因上游片段PfFAD2-LP4-2A；以SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.31为引物，紫苏C2品种基因组为模板，扩增获得融合基因下游片段2A-PfFAD3，将获得的PfFAD2-LP4-2A和2A-PfFAD3连接pGEM-T载体，分别获得pGEM-T-PfFAD2-LP4-2A质粒和pGEM-T-2A-PfFAD3质粒，经测序验证无误后，分别用XbaI+HindIII、HindIII+XmaI酶切pGEM-T-PfFAD2-LP4-2A质粒合pGEM-T-2A-PfFAD3质粒，电泳后分别回收1206bp的PfFAD2-LP4-2A目的片段和1218bp的2A-PfFAD3目的片段，然后同时连接经XbaI+XmaI双酶切的pC2301M1NPB质粒，得到重组表达载体，命名为pC2301M1NPB-PfFAD2-LP4-2A-PfFAD3。

优选的，所述述重组载体由SEQ ID NO.39所示序列连入pC2301M1NPB质粒XbaI与XmaI酶切位点而得。

3、一种获得高产α-亚麻酸的大宗油料作物的方法，具体是在大宗油料作物过量表达紫苏脂肪酸脱饱和酶2基因和脂肪酸脱饱和酶3基因，所述紫苏脂肪酸脱饱和酶2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示，或如SEQ ID NO.34所示核苷酸序列经取代、缺失或添加至少一个核苷酸，且来源于紫苏的编码脂肪酸脱饱和酶2活性的核苷酸序列；所述紫苏脂肪酸脱饱和酶3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示，或如SEQ ID NO.36所示核苷酸序列经取代、缺失或添加至少一个核苷酸，且来源于紫苏的编码脂肪酸脱饱和酶3活性的核苷酸序列。

优选的，所述在大宗油料作物过量表达紫苏脂肪酸脱饱和酶2基因和脂肪酸脱饱和酶基因的方法是，构建含有权利要求4～7任一项所述的重组表达载体，转化根癌农杆菌LBA4404，检测获得含pC2301M1NPB-PfFAD2-LP4-2A-PfFAD3的LBA4404工程菌株，然后用含pC2301M1NPB-PfFAD2-LP4-2A-PfFAD3的LBA4404工程菌株转化大宗油料作物，筛选转基因植物即获得高产α-亚麻酸的大宗油料作物。

优选的，所述大宗油料作物为甘蓝型油菜。

本发明的有益效果在于：本发明提供了PfFAD2基因和PfFAD3基因的全长cDNA序列和gDNA序列、编码蛋白序列和结构特征、进化关系、表达的器官组织特异性等，并确认了PfFAD2编码有脂肪酸脱饱和酶2活性，PfFAD3编码有脂肪酸脱饱和酶3活性，并鉴定出了PfFAD2的优势等位基因PfFAD2a和PfFAD3的优势等位基因PfFAD3b，设计了植物偏爱密码子的连接肽-内含肽人工序列LP4-2A，以它为接头将PfFAD2a与PfFAD3b的编码区重组为融合蛋白基因PfFAD2-LP4-2A-PfFAD3，正义转化油菜后能够大幅度提高种子中ALA的含量，证明融合蛋白基因PfFAD2-LP4-2A-PfFAD3在植物ALA性状的分子育种方面具有很好的应用前景，可用于创制高产ALA的大宗油料作物，其转基因植物可应用于工业提取ALA，或用于生产富含ALA的营养品，或与缺乏ALA的棕榈油、花生油、棉籽油、葵籽油等调和后提高它们Ω3脂肪酸的丰度，降低Ω6/Ω3比值。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为PfFAD2基因和PfFAD3基因克隆结果(A为PfFAD2基因cDNA末端和全长扩增的琼脂糖凝胶电泳图，B为PfFAD3基因cDNA末端和全长扩增的琼脂糖凝胶电泳图。M：Marker；5P：5’-RACE初扩；5N：5’-RACE巢扩；3P：3’-RACE初扩；3N：3’-RACE巢扩；FC：全长cDNA扩增；FG：全长gDNA扩增)。

图2为PfFAD2基因和PfFAD3基因的全场cDNA序列及其编码的氨基酸序列(A：PfFAD2a的全长cDNA序列及其编码的氨基酸序列，B：PfFAD2b的全长cDNA序列及其编码的氨基酸序列；C：PfFAD3a的全长cDNA及其编码的氨基酸序列；D：PfFAD3b的全长cDNA及其编码的氨基酸序列。起始密码子ATG、终止密码子TAG用粗体加下划线表示，转录起始位点和poly(A)加尾位点用斜体加下划线标记。5’UTR中的嘧啶串和嘌呤串、3’UTR中的疑似poly(A)加尾信号加下划波浪线)。

图3为PfFAD2基因和PfFAD3基因系统进化树(A为PfFAD2a/PfFAD2b蛋白与双、单子叶植物FAD2蛋白的系统树，B为PfFAD3a/PfFAD3b蛋白与双子叶植物FAD3、FAD7、FAD8的系统树；Arabidopsis thaliana拟南芥，Arachis hypogaea花生，Borago officinalis玻璃苣，Brachypodium distachyon二穗短柄草，Brassica rapa白菜，Glycine max大豆，Gossypiumhirsutum陆地棉，Helianthus annuus向日葵，Linum grandiflorum大花亚麻，Nicotianatabacum烟草，Olea europaea橄榄，Populus trichocarpa毛果杨，Ricinus communis蓖麻，Sesamum indicum芝麻，Vitis vinifera葡萄，Zea mays玉米)。

图4为PfFAD2和PfFAD3在紫苏各器官中转录表达的荧光定量PCR检测结果(A：PfFAD2；B：PfFAD3)。

图5本发明生物合成途径，载体构建及转基因效果图(A为从硬脂酸到ALA的生物合成途径，B为植物表达载体构建示意图，C为转基因优株(C23、N23)和对照(NT)种子脂肪酸组分的GC峰图)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

本发明实施例采用的植物材料：紫苏(Perilla frutescens)品种C2的种子由西南大学张兴翠副研究员提供，甘蓝型油菜(Brassica napus)品种中双10号的商业推广种子由中国农业科学院油料作物研究所张学昆研究员惠赠，两种作物的种植均为常规试验条件。

本发明实施例采用的试剂及试剂盒：SMARTer^TM RACE cDNA Amplification Kit为美国Clontech公司产品；PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(PerfectReal Time)、DNALigation Kit、pMD19-T、Taq DNA聚合酶、DNase I(RNase-free)及buffer、RNase Inhibitor、DL-2000及λ-HindIII DNA Marker购自大连宝生物(TaKaRa)生物工程有限公司；定量PCR试剂FastStart Essential DNA Green Master为瑞士Roche公司产品；pGEM-T Easy为美国Promega公司产品A；胶回收试剂盒、小量法质粒抽提试剂盒、DL-2000plus、Easy-Taq酶、dNTPs等试剂购自北京全式金(Transgen)生物技术有限公司；限制性内切酶购自立陶宛ThermoScientific Fermentas公司；MS(Murashige&Skoog medium,including vitamins)培养基为荷兰Duchefa公司产品；X-Gluc(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronic acid)、利福平(Rif)、链霉素(Str)、卡那霉素(Kan)、氨苄青霉素(Amp)、琼脂糖、Tris、CTAB、Tris饱和酚(pH＝8.0)、Tryptone、Yeast Extract、X-gal、IPTG、Basta等其它生化与分子生物学试剂购自上海生工生物工程技术服务有限公司；植物激素购自上海稼丰园艺用品等公司。

本发明实施例采用的主要仪器：Veriti^TM多重控温PCR仪购自美国AppliedBiosystems公司；CFX96荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司；气相色谱仪(GasChromatography，GC)为日本岛津GC-7A型；以及分子生物学和基因工程的其它仪器设备。

本发明实施例DNA合成和测序由上海立菲、南京金斯瑞、上海生工等公司商业完成。

实施例1、紫苏脂肪酸脱饱和酶2(PfFAD2)基因和脂肪酸脱饱和酶3(PfFAD3)基因的克隆

(1)紫苏基因组总DNA和总RNA的提取

取紫苏C2品种植株的嫩叶，采用十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)法提取基因组总DNA，采用1.0％琼脂糖凝胶电泳法和分光光度法评价核酸样品的质量和浓度。结果显示，提取的紫苏基因组总DNA的完整性好，平均分子量略大于λ-HindIII DNA Marker的23kb条带，RNA消化完全，分光光度法检测其纯度也较高，可用于PCR扩增。

同时，以紫苏C2品种的根(Ro)、茎(St)、叶(Le)、蕾(Bu)、花(Fl)、中期种子(MS)、后期种子(LS)为材料，分别采用小量植物组织RNA抽提试剂盒提取总RNA，用DNase I去除总RNA中含有的DNA杂质，电泳检测总RNA的质量，紫外分光光度计测定总RNA的浓度和纯度。电泳检测表明获得的总RNA特征条带清晰，无明显RNA降解和DNA污染，分光光度法检测评价的质量也较好，能够满足后述实验的要求，然后储存于-80℃冰箱备用。

(2)紫苏种子RACE总cDNA第一链的获得

取紫苏各器官的总RNA各1μg混合，采用SMARTer^TM RACE cDNA Amplification Kit按照其说明书操作，分别得到5'-RACE-Ready cDNA和3'-RACE-Ready cDNA第一链备用。

(3)PfFAD2基因和PfFAD3基因5’-cDNA末端和3’-cDNA末端的RACE扩增

PfFAD2基因的5’-RACE：通过Vector NTI Advance 9.0/11.51对GenBank中的芝麻(Sesamum indicum)、琉璃苣(Borago officinalis)、橄榄(Olea europaea)、大花亚麻(Linum grandiflora)、葡萄(Vitis vinifera)、大豆(Glycine max)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)等植物的FAD2基因进行多重比对，根据保守点设计简并引物，设计了克隆PfFAD2基因5’-cDNA末端的各2个反向引物RPD125-1和RPD125-2，其引物序列如表1所示。然后以5'-RACE-ReadycDNA 1μL为模板，用引物组合UPM+RPD125-1进行PfFAD2基因的5’-RACE第一次PCR扩增。PCR反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，28个循环；72℃延伸10min。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果显示第一次PCR扩增后获得很弱的smear。取第一次PCR扩增产物0.1μL为模板，用引物组合NUP+RPD125-2对PfFAD2进行5’-RACE巢式PCR扩增，PCR反应程序同第一次PCR扩增，但退火温度为65度，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果显示(图1)，扩增获得一条约450bp明显的条带，伴随一些smear，与根据其它植物FAD2基因序列长度相近。回收扩增产物，经TA克隆后转化大肠杆菌。然后通过PCR筛选阳性克隆子，克隆子之间呈现插入片段长度的多态性，每种长度均选取克隆子送样测序。测序结果除去试剂盒接头序列后，发现5’-cDNA均来自同一条基因，克隆子间序列高度一致，在极少数碱基处存在单核苷酸多态性(SNP,应当来自于杂合等位基因间的差异性)。5’-cDNA末端净长有439、431、386、314bp这几种，长度多态性是由于转录起始位点的早与迟引起的。

PfFAD3基因的5’-RACE：方法同前，引物序列见表1。引物组合LUPM+RPD155-1的5’-RACE初次扩增只产生很弱的smear，没有明显的条带。引物组合NUP+RPD155-2的巢扩在约400bp和750bp处产生了两条明显的条带，伴随一些smear(图1)，胶回收、TA克隆、细菌转化后，PCR阳性克隆子之间呈现插入片段长度的多态性，每种长度均选取克隆子送样测序。测序结果除去试剂盒接头序列后，BLAST分析后发现400bp左右克隆子全部为目标基因，5’-cDNA末端净长有388、382、378、360bp这几种，长度多态性是由于不同mRNA分子的转录起始位点的早与迟引起的。

PfFAD2基因的3’-RACE：如上法分析植物FAD2基因保守区序列后，设计2个正向引物：FPD123-1、FPD123-2，其引物序列如表1所示。以3'-RACE-Ready cDNA 1μL为模板，用引物组合FPD123-1+UPM进行PfFAD2基因的3’-RACE第一次PCR扩增，反应程序同5'-RACE一扩，但退火温度为55度，电泳显示没有明显条带。取第一次PCR扩增产物0.1μL为模板，用引物组合FPD123-2+NUP进行PfFAD2的3’-RACE的巢式PCR扩增，PCR反应程序同第一次PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果显示，电泳获得1条约480bp的亮带，与根据其它植物FAD2基因序列预测的长度相近(图1)。将扩增产物进行胶回收，TA克隆后转化大肠杆菌，然后对插入片段进行PCR检测。结果表明，获得的单斑克隆子存在插入长度的多态性，每种长度均选取克隆子送样测序。测序结果除去试剂盒接头序列后，发现3’-cDNA均来自同一条基因，克隆子间序列高度一致，在少数碱基处存在杂合等位基因引起的SNP。3’-cDNA末端净长度(不计poly A)有488、487、486、449bp这几种，长度多态性是由于不同mRNA分子的poly A加尾位点的早与迟引起的。

PfFAD3基因的3’-RACE。方法同前，引物序列见表1。引物组合FPD153-1+UPM的初次扩增没有明显的条带，仅有一些smear。引物组合FPD153-2+NUP的巢扩在约480bp处产生了一条特异的亮带(图1)，胶回收、TA克隆、细菌转化后，PCR阳性克隆子之间呈现插入片段长度的多态性，每种长度均选取克隆子送样测序。测序结果除去试剂盒接头序列后，3’-cDNA末端净长(不计poly A)有447、437、434、430、423、419、403、401bp，长度多态性是由于不同mRNA分子的poly(A)加尾位点的早与迟引起的。

(4)PfFAD2基因和PfFAD3基因全长cDNA和gDNA的克隆

根据PfFAD2基因5’-RACE、3’-RACE的测序结果，设计了PfFAD2全长cDNA和gDNA的扩增的引物组合FPfFAD2+RPfFAD2，其引物序列如表1所示。以3'-RACE-Ready cDNA1μL为模板，用引物组合FPfFAD2+RPfFAD2进行扩增，PCR反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果显示(图1)，扩增获得了1条约1.5kb的特异条带。将扩增产物进行胶回收，经TA克隆后转化大肠杆菌，阳性克隆子进行测序。结果表明，PfFAD2的全长cDNA为1526bp，存在SNP的杂合等位基因PfFAD2a/PfFAD2b(图2)。将模板替换为紫苏基因组总DNA 1μL，用引物组合FPfFAD2+RPfFAD2进行PCR扩增，扩增产物回收，经TA克隆后，进行测序。结果显示，扩增得到的PfFAD2基因的gDNA条带约为4000bp，测序后的准确序列PfFAD2a为3956bp，PfFAD2b为3959bp，与全长cDNA进行比对后表明，FPfFAD2在5’UTR有中有一个内含子。

根据PfFAD3基因5’-RACE、3’-RACE的测序结果，设计了PfFAD3全长cDNA和gDNA的扩增的引物组合FPfFAD3+RPfFAD3a和FPfFAD3+RPfFAD3b，其引物序列如表1所示。3’-RACE总cDNA为模板，分别扩增PfFAD3a、PfFAD3b的全长cDNA，电泳显示均得到了预期大小一致的特异条带。胶回收、TA克隆和测序后，比对分析表明，PfFAD3a为1445bp，PfFAD3b为1435bp，二者为高度同源但存在SNP差异的一对杂合等位基因。只是将模板替换为紫苏基因组总DNA，其它参数不变，引物组合FPfFAD3+RPfFAD3a和FPfFAD3+RPfFAD3b均扩增得到了约2.8kb的特异条带，回收、TA克隆和测序后，PfFAD3a为2824bp，PfFAD3b为2844bp，与全长cDNA比对后显示它们均有7个内含子。

表1、紫苏脂肪酸脱饱和酶2(PfFAD2)和脂肪酸脱饱和酶3(PfFAD3)的克隆引物

实施例2、PfFAD2基因和PfFAD3基因的生物信息学分析

序列拼接和比对、开放阅读框ORF的查找和翻译、核酸蛋白分子参数计算、序列比对以及其他的生物信息学分析主要在Vector NTI Advance 9.0/11.51和DNAStar version7.1.0上进行。保守域搜索、基因或蛋白结构预测、BLAST分析主要在以下网站上进行：NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)、Expasy(www.expasy.org)、CBS(http://www.cbs.dtu.dk/services/)、Pfam、SOPMA和GSDS2.0等。在SeaView4.0上用BioNJ法构建蛋白系统树，bootstrap重复次数为1000。

(1)PfFAD2基因和PfFAD3基因的结构和核酸特征

PfFAD2基因如图2(A)所示，紫苏有一对存在SNP的FAD2杂合等位基因：PfFAD2a(SEQ ID NO.34)和PfFAD2b。二者的全长cDNA均为1526bp，开放读码框(ORF)均为1149bp，5’非翻译区(5’UTR)均为112bp，3’UTR均为265bp。PfFAD2a和PfFAD2b的gDNA分别为3956bp和3959bp，分别与对应的cDNA进行两两比对后表明，它们的5’UTR中均含有一个大内含子，长度分别为2430bp和2433bp，边界为标准的GT…AG格式。PfFAD2a和PfFAD2b基因编码区的GC含量均达到54.40％，5’UTR的GC含量略低(51.79％和51.79％)，3’UTR的GC含量分别只有33.58％和33.96％，内含子的GC含量分别低至31.89％和32.02％，符合功能基因的典型特征。二者的5’UTR中同时含有一个19-nt的嘧啶串和一个33-nt的AG重复嘌呤串，而且两者相距很近，也许它们在引导转录或mRNA翻译的过程中扮演一定的调控功能。它们的3’UTR中缺乏标准的poly(A)加尾信号AATAAA，但有3处仅相差一个碱基的疑似poly(A)加尾信号。两两比对表明，PfFAD2a与PfFAD2b之间在全长gDNA、全长cDNA、编码区水平的一致率分别为98.6％、98.7％和98.4％，说明二者高度相似。

PfFAD3基因如图2(B)所示，紫苏有一对存在SNP的FAD3杂合等位基因：PfFAD3a和PfFAD3b(SEQ ID NO.36)。二者的全长cDNA分别为1445bp和1435bp，ORF均为1176bp，分别有1和4个可变性转录起始位点，最长5’UTR均为49bp，分别有4和5个可变性poly A加尾位点，最长3’UTR分别为220bp和210bp，均有一个标准的Poly(A)加尾信号AATAAA。PfFAD3a和PfFAD3b的gDNA分别为2824bp和2844bp，7个内含子的边界均为标准的GT…AG格式。PfFAD3a与PfFAD3b之间在全长gDNA、全长cDNA、编码区水平的一致率分别为93.0％、98.1％和99.1％，说明二者高度相似。

(2)PfFAD2蛋白和PfFAD3蛋白的结构特征

推导的PfFAD2a((SEQ ID NO.35))和PfFAD2b蛋白间仅在第260位残基发生了V₂₆₀→I₂₆₀的相似性氨基酸取代，其它完全相同，因此理论上预测二者的结构和功能应当没有区别。PfFAD2a/PfFAD2b蛋白含有382个氨基酸残基，分子量为43.66/43.68kD，等电点均为8.65，碱性和酸性氨基酸的频率均分别为9.42％和8.12％。NCBI保守域搜索表明PfFAD2a/PfFAD2b包含一个PLN02505保守域和FA_desaturase保守域。SignalP 4.1预测表明PfFAD2a/PfFAD2b不包含信号肽，而TargetP1.1预测它定位在除叶绿体、线粒体、分泌蛋白以外的其它位置。TMHMM2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测表明，PfFAD2a/PfFAD2b存在6个强的跨膜域。NetPhos2.0预测PfFAD2/PfFAD2b有22个潜在的磷酸化位点(11个S、1个T、10个Y)。SOPMA软件预测，PfFAD2a/PfFAD2b的二级结构主要为α-螺旋(44.24％)和随机卷曲(39.79％)，还有少量延伸链(11.78％)和β-转角(4.19％)。PfFAD2a/PfFAD2b包含三个组氨酸基序，该基序存在于所有膜结合FAD蛋白，包含八个铁离子结合位点，它们对维持脱饱和酶的活性至关重要。此外，PfFAD2a/PfFAD2b同芝麻SiFAD2-1和拟南芥AtFAD2氨基酸序列一样，C端均含有内质网保留基序(-YNNKL)。

推导的PfFAD3a和PfFAD3b(SEQ ID NO.37)蛋白均包含391aa，仅有1个氨基酸差异(S66N)，被认为是一对杂合等位基因之间的差异，理论分子量分别为44.90和44.93kDa，预测等电点均为8.93。SMART和Pfam数据库搜索表明，PfFAD3a/PfFAD3b均存在保守域DUF3474(Pfam:PF11960)和FA_desturase(PF00487；PfFAD8b除外)。存在于细菌和真核生物中的功能未知保守域DUF3474总与FA_desaturase伴随发生。与拟南芥ω-3FAD家族蛋白相同，PfFAD3a/PfFAD3b均包含3个组氨酸基序HDCGH、HRTHH和HVI(V)HH，它们在维持FAD活性和形成氧激活和氢消除所需的二铁配基部分活性中心扮演重要角色。与拟南芥AtFAD3不同，PfFAD3a/PfFAD3b不存在C端ER滞留信号-KSKIN，估计已进化成为另一种ER滞留信号序列。NetPhos2.0预测表明，PfFAD3a/PfFAD3b均存在19个潜在的磷酸化位点。SOPMA软件预测，PfFAD3a/PfFAD3b的二级结构主要为α-螺旋(39.13/40.66％)和随机卷曲(42.46/39.13％)，还有少量延伸链(13.81/14.32％)和β-转角(4.60/5.88％)。

(3)PfFAD2基因和PfFAD3基因的同源性分析

BLASTn和BLASTp分析表明，PfFAD2与多种其它植物FAD2基因在核酸和蛋白水平有高同源性。Vector NTI Advance 9.0/11.5上的两两比对表明，PfFAD2a与PfFAD2b为极为相似的等位基因。植物FAD2分为三个亚组：看家型(或组成型)FAD2、种子型FAD2(图3，A)。如图所示，PfFAD2a先与芝麻SiFAD2-1、油橄榄FAD2-2聚为一支，属于看家型(组成型)FAD2。这也证实了紫苏与芝麻、油橄榄的亲缘关系较近，因为同属唇形目。

BLASTn和BLASTp分析表明，PfFAD3与多种其它植物FAD3基因在核酸和蛋白水平有高同源性，也与植物FAD7和FAD8有较高的同源性。Vector NTI Advance 9.0/11.5上的两两比对表明(图3，B)，PfFAD3a/PfFAD3b与AtFAD3的一致率为66.1％/66.4％。蛋白系统树上，PfFAD3a/PfFAD3b首先与唇形目芝麻的FAD3聚在一起，然后是油橄榄和向日葵的FAD3，然后再与其它双子叶植物FAD3聚在一起，而与双子叶植物的FAD7和FAD8相对较远。

实施例3、PfFAD2基因和PfFAD3基因表达器官特异性的荧光定量PCR检测

紫苏的根(Ro)、茎(St)、叶(Le)、蕾(Bu)、花(Fl)、中期种子(MS)、后期种子(LS)的总RNA，用RNase-free DNase I按其说明书处理以消除DNA污染。取每个器官的总RNA各1μg混匀，采用PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser进行去gDNA和反转录，获得总cDNA第一链用于基因表达检测。荧光定量PCR检测在CFX96型定量PCR仪上进行，试剂盒为FastStart Essential DNA Green Master(Roche)，以引物组合F25SRT+R25SRT为内标进行扩增，PfFAD2基因和PfFAD3基因的定量PCR引物组合分别为FPfFAD2q+RPfFAD2q和FPfFAD3q+RPfFAD3q，引物序列见表2所示。参照说明书，10μL反应体系包含：2.5μLcDNA(稀释40倍)、正向引物和反向引物(均为10μM)各0.5μL、5μL Master Mix、1.5μL ddH₂O。采用两步法进行扩增，循环参数如下：95℃10min；95℃15s，62℃30s，42个循环；最后添加溶解曲线。每个样品均为三个独立的重复。数据通过CFX Manager 3.1(Bio-Rad,USA)软件采用2^-ΔΔCT方法进行分析。

荧光定量RT-PCR检测结果如图4所示，PfFAD2在各器官均有表达，主要在生殖器官中表达，后期种子是其表达最丰的器官，花中表达也显著，在营养器官中的表达水平较低，根是其表达最低的器官。PfFAD3主要在后期种子中表达，约为根的4000倍，种子以外的器官中表达均较低。

表2、PfFAD2基因和PfFAD3基因荧光定量PCR引物

实施例4、PfFAD2基因和PfFAD3基因编码蛋白活性的酵母表达检测

根据PfFAD2基因和PfFAD3基因的编码区序列，分别设计酵母表达引物FPfD12Y+RPfD12Y和FPfFAD3Y+RPfFAD3Y，引物序列如表3所示。用引物组合FPfD12Y+RPfD12Y和FPfFAD3Y+RPfFAD3Y分别扩增PfFAD2基因和PfFAD3基因的1149bp和1176bp编码区序列，然后与pGEM-T easy进行TA克隆，分别得pGEM-T-PfFAD2Y和pGEM-T-PfFAD3Y，经测序证明序列没有突变后，进行下一步酵母载体构建。

表3、PfFAD2基因和PfFAD3基因酵母表达引物

用限制性内切酶BamHI和XbaI完全双酶切质粒pYES2.0、pGEM-T-PfFAD2aY、pGEM-T-PfFAD2bY，回收pYES2.0的线性骨架载体、目的基因片段PfFAD2aY和PfFAD2bY，然后用T₄DNA连接酶将载体骨架分别与2个目的基因片段进行连接，转化大肠杆菌，分别获得对应的酵母表达载体pYES2-PfFAD2aY、pYES2-PfFAD2bY，采用Invitrogen公司的方法，进行酿酒酵母菌株INVScl的感受态制备和转化，经选择培养基SD-Ura筛选，分别获得转化子菌液，再分别进行PCR检测，获得表达菌株。使用LiAc-半乳糖诱导方法对携带重组质粒pYES2-PfFAD2aY、pYES2-PfFAD2bY、对照质粒pYES2.0的酵母表达菌株进行诱导，添加OA底物后进行培养，然后收集三种菌株的菌体进行甲酯化，用气相色谱仪对脂肪酸组分和含量进行分析。酿酒酵母由于缺乏内源FAD2活性，所以不能合成LA。转pYES2.0的对照酵母没有检测到LA，而转重组质粒的酵母均比对照多出LA组份。采用面积归一化法计算结果(表4)，转PfFAD2a酵母中LA占总脂肪酸的12.87％，转PfFAD2b酵母中LA占总FA的11.63％。证明紫苏PfFAD2a、PfFAD2b两个等位基因均编码有功能的Δ12FAD，即催化OA形成LA，且两个等位基因的活性相似，PfFAD2a的酶活性略有优势。

PfFAD3a、PfFAD3b的ORF分别被插入到pYES2.0中启动子PGAL1之后，然后转化酵母。转基因酵母FA组分的GC检测表明，转空载体的酵母没有出现ALA峰，而转pYES2-PfFAD3aY、pYES2-PfFAD3bY的酵母均出现了ALA新峰，对应的在总脂肪酸中ALA含量(％)分别为2.42±0.44％、2.68±0.05％，LA到ALA的转化比率(％)分别为8.84±1.69％、10.61±0.55％(表4)。这表明PfFAD3a、PfFAD3b均编码一个有功能的LA Δ15FAD，即催化LA形成ALA，且两个等位基因的活性相似，PfFAD3b的酶活性略有优势。

表4、pYES2.0、pYES2-PfFAD2和pYES2-PfFAD3转化酵母的脂肪酸组份(％)

实施例5、利用LP4-2A技术融合双价表达紫苏PfFAD2和PfFAD3大幅提高菜籽油的ALA含量

(1)改造pCAMBIA2301载体获得新型植物表达平台载体pC2301M1NPB

pCAMBIA2301、pBI121、pFGC5941均为广泛应用的商业化植物表达载体，本课题组此前已利用它们创建了种子特异启动子P_NAP驱动的植物表达平台载体pC2301M1NPB，构建流程详见文献【Fu C,Chai YR,Ma LJ,et al.Evening primrose(Oenothera biennis)Δ6fatty aciddesaturase gene family:cloning,characterization,and engineered GLAand SDA production ina staple oil crop.Mol Breeding,2017,37:83.https:// doi.org/10.1007/s11032-017-0682-0】，本发明利用该平台载体来装载目标基因和进行植物转化。

(2)融合蛋白基因PfFAD2-LP-2A-PfFAD3植物表达载体的构建和工程菌株的获得

设计如SEQ ID NO.27所示、基于芸薹属偏爱密码子的连接肽-内含肽序列LP4-2A(84bp)，其起始27bp编码凤仙花(Impatiens balsamina L.)种子抗菌肽前体蛋白的LP4连接肽N端9个氨基酸，随后的57bp编码口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)2A内含肽C端19个氨基酸(SEQ ID NO.38)。由于该片段很短，因此实际构建重组DNA方案时，将其拆分成两段后分别融入待融合的上游基因的反向引物和下游基因的正向引物中。

表5、植物表达载体构建与检测所用的引物

前面的酵母表达表明，紫苏C2品种中PfFAD2a、PfFAD3b相比PfFAD2b、PfFAD3a为优势等位基因，所以以紫苏C2品种PfFAD2a、PfFAD3b全长cDNA克隆子菌液为模板，采用引物组合FPfFAD2O+R2ALP4PfFAD2(序列见表5)扩增融合基因上游片段PfFAD2-LP4-2A，采用引物F2APfFAD3+RPfFAD3(序列见表5)扩增目融合基因下游片段2A-PfFAD3，分别连接pGEM-T获得pGEM-T-PfFAD2-LP4-2A和pGEM-T-2A-PfFAD3质粒。其中，LP4是来自凤仙花的连接肽序列，2A来自口蹄疫病毒的内含肽序列。含有经测序验证无误的pGEM-T-PfFAD2-LP4-2A、pGEM-T-2A-PfFAD3和pC2301M1NPB重组子的单克隆子经培养到对数晚期后，采用质粒DNA提取试剂盒提取质粒。取pGEM-T-PfFAD2-LP4-2A质粒、pGEM-T-2A-PfFAD3质粒和pC2301M1NPB质粒，分别进行XbaI+HindIII、HindIII+XmaI和XbaI+XmaI双酶切至完全，电泳后分别回收1206bp的PfFAD2-LP4-2A目的片段、1218bp的2A-PfFAD3目的片段、16614bp开环的pC2301M1NPB骨架，采用T₄DNA连接酶将三者于16℃连接12h，得到重组质粒pC2301M1NPB-PfFAD2-LP4-2A-PfFAD3(简称pCN-PfFAD2-PfFAD3)，转化DH5α，采用引物组合FNAP+RNOS5N、FPfFAD2O+RPfFAD3对克隆子进行菌液检测，分别扩增得到符合理论预期的3.6kb、2.4kb特异条带，表明双阳性克隆子含有正确的重组质粒。抽提该阳性克隆子的质粒，利用液氮冷激法转化根癌农杆菌LBA4404，经多元PCR检测后得到pC2301M1NPB-PfFAD2-LP4-2A-PfFAD3的工程菌株，其中融合蛋白基因PfFAD2-LP4-2A-PfFAD3的核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.40所示。

(3)农杆菌介导融合蛋白基因PfFAD2-LP4-2A-PfFAD3转化甘蓝型油菜及检测

所有组织培养操作均在标准的植物组织培养条件下进行，超净工作台、培养间、驯化间的洁净级别分别为100级、10000级和100000级，相应试剂、材料、器皿均按规程进行无菌处理。甘蓝型油菜典型品种中双10号的种子用体积分数为75％的乙醇表面消毒1min后用无菌水冲洗3次，然后用质量分数为5％的次氯酸钠浸泡20min，用无菌水冲洗干净后接种于MS固体培养基[MS粉4.41g/L+Phytagel 2.6g/L+蔗糖30.0g/L，pH5.8；不加Phytagel即为液体培养基]中，于25℃、2000Lux光照、16h/d光周期培养(后面的组培间培养条件除特别注明者外，均与此相同)。切取苗龄8d左右甘蓝型油菜品种中双10号无菌苗的下胚轴切成长0.5～1.0cm的小段，接种到预培培养基MSp[MS培养基+1.0mg/L 6-苄基氨基嘌呤(6-BA)+1.0mg/L 2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)]预培养3d。

取-80℃保存的根癌农杆菌工程菌株(含有质粒pC2301M1NPB-PfFAD2-LP4-2A-PfFAD3)在加有100mg/L Kan+20mg/L Str+40mg/L Rif的LB液体培养基中于28℃、250r/min振荡培养1～2d，使农杆菌生长至对数期，转接培养一次。然后在5000rpm条件下室温离心10min，收集菌体，菌体用浸染培养基MSm[MS液体培养基+1.0mg/L 2,4-D+1.0mg/L 6-BA+100μmol/L AS(乙酰丁香酮)]调节细菌浓度至OD₆₀₀约0.5左右，即为浸染液。

将预培养后的下胚轴段浸入浸染液中5-10min，间歇性轻轻摇荡，然后将下胚轴段在灭菌纸上吸干多余菌液，接种到共培培养基MSc[MS固体培养基+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L萘乙酸(NAA)]中，23.5℃暗培养48h。用杀菌液体培养基MSk[MS液体培养基+1.0mg/L 2,4-D+1.0mg/L 6-BA+500mg/L Cef]浸泡洗涤外植体3×10min，用灭菌纸吸干表面液体，转接到诱导筛选培养基MSi[MS固体培养基+1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L 2,4-D+500mg/L Cef(头孢噻肟钠)+12.5mg/L Basta+6mg/L AgNO₃]培养，约2周继代1次，至长出肉眼可见的抗性愈伤，再转接到分化培养基MSd[MS固体培养基+4.0mg/L 6-BA+2.0mg/L玉米素(ZT)+5.0mg/LAgNO₃+500mg/L Cef+12.5mg/L Basta]中培养14d以上，诱导愈伤组织分化出小芽，再转接到茎分化培养基MSs(MS固体培养基+3.0mg/L 6-BA+2.0mg/L ZT+500mg/L Cef+12.5mg/LBasta)培养至长出小茎，再转接到长茎培养基MSe(MS固体培养基+0.05mg/L6-BA+500mg/LCef+12.5mg/L Basta)中培养至长出无根小苗，再转接到生根培养基MSr[MS固体培养基+2mg/L萘乙酸(NAA)]培养至长出发达根系，生根后的小苗经驯化后，移栽到含有灭菌珍珠岩、蛭石、草炭土混合物(质量比为1:1:1)的盆钵中，按温室盆栽进行管理。

最终，pC2301M1NPB-PfFAD2-LP4-2A-PfFAD3转化甘蓝型油菜中双10号后，获得一批再生植株；对再生植株叶片滴加200mg/L Basta溶液检测抗性，切取再生植株的叶块进行GUS组织化学染色，并提取再生植株的叶片基因组总DNA分别采用引物组合FNAP+RPfFAD3进行PCR检测，结果表明获得10株三重阳性的转基因植株。提取转基因植株开花后30d的种子，提取总RNA，如前面的方法进行去gDNA、反转录及目标基因PfFAD2和PfFAD3表达水平进行qRT-PCR检测，结果表明这10株转基因植株中外源转基因均显著表达。

对转基因阳性植株进行全面的生物学和农艺学观察，上述转基因植株均未出现明显的副作用，外观生物学和农学性状与非转基因对照植株没有明显差异。采用气相色谱法对转基因油菜成熟种子进行脂肪酸GC分析，发现与非转基因阴性对照植株(NT/CK)相比，T₁代转基因油菜成熟种子的ALA的GC峰高得多，采用面积归一化法计算得知ALA平均占总脂肪酸的20.21％(13.85％-28.97％，植株N23-9最高，表6)，而对照仅为8.08％，转基因为非转基因的2.50(1.71-3.59)倍。

表6非转基因和转PfFAD2-LP4-2A-PfFAD3T₁代油菜种子脂肪酸的组分(占总脂肪酸的％)

对转基因当代植株进行自交繁殖，采用与转基因当代植株一样的叶片滴加Basta抗性检测和GUS染色检测，筛选鉴定出转基因油菜纯合优株系，GC检测表明，T₂代转基因成熟种子总脂肪酸中ALA的平均为19.55％(14.55％-24.16％，最优株系为N23-9-1)，对照仅为7.79％，转基因为非转基因的2.51(1.87-3.10)倍。T₂代转基因株系再自交获得T₃代转基因纯合株系，GC检测表明成熟种子总脂肪酸中ALA的平均为24.23％(19.29％-30.23％，最优株系为N23-9-1-2)，对照仅为8.03％，转基因为非转基因的3.02(2.40-3.76)倍。

以上事实说明，融合蛋白基因PfFAD2-LP4-2A-PfFAD3转化油菜后获得了种子ALA含量提高几倍的转基因植物新材料，可以稳定遗传，且纯合后代株系比当代(杂合)单株的转基因性状更好，达到了代谢工程分子育种的目的。

特别申明，应用形式上的如下改变也都必然属于本发明的精神和范围所覆盖：

1、本发明中的基因和其片段，除了SEQ ID No.1、SEQ ID No.3以外，也包括来自于紫苏的其它PfFAD2、PfFAD3等位基因序列，包括来自于紫苏的其它亚种、生态型、品种、杂交种的PfFAD2、PfFAD3基因序列，也包括来自于紫苏属的近缘物种中与本发明的PfFAD2、PfFAD3序列高度相似的基因序列(ORF全编码区水平一致率大于97％)，尽管它们与SEQIDNo.1、SEQ ID No.3可能有小的差异。

2、本发明中的基因和其片段，也包括与SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7在连续80bp及以上有98.00％以上一致性的任意核苷酸序列。

3、本发明中的基因和其片段，也包括编码蛋白与SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQIDNo.6、SEQ ID No.8有100％一致率的人工合成核苷酸序列。

4、本发明中的基因和其片段，除了象优先实施例中所举的用于紫苏、甘蓝型油菜以外，还可以应用于其它物种。

5、本发明中的PfFAD2、PfFAD3基因和其片段，除了象优先实施例中所举的融合蛋白正义转化进行超量表达和异源表达外，还可以采用反义RNA、RNA干扰、基因组编辑(ZFN、TALEN、CRISPR-Cas)等技术，来介导紫苏属植物内源PfFAD2、PfFAD3基因或基因家族的沉默，阻止LA和ALA的合成，创造种子高油酸含量的紫苏属植物。

6、本发明中的基因和其片段，除了优选实施例中所举的采用pC2301M1NPB进行植物表达载体构建以外，还可以采用其它载体来进行植物表达载体构建；本发明中的载体构建物，除了象优先实施例中所举的采用根癌农杆菌菌株LBA4404介导的改良叶盘法进行遗传转化以外，也可以采用其它方法进行植物遗传转化。

7、本发明应用实例所取得的效应参数值仅指采用实例中的品种作为外植体进行转基因操作的结果，如果采用其它品种(如超高油酸或超高亚油酸品种)作为外植体进行转基因操作，会取得更优的操作效果参数值。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 西南大学

<120> PfFAD2基因和PfFAD3基因在大宗油料作物提高种子α-亚麻酸含量中的应用

<160> 40

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctaatacgac tcactatagg gc 22

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aagcagtggt atcaacgcag agt 23

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcgctgaagg crtggtgrcc rcaytcrtg 29

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tggtggccgc attcgtgggc natgaccca 29

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgggtcathg cccaygartg yggyca 26

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

catcacngac acncacgtgg cncaccatct gttytc 36

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tctagaaccg caccaacctc actcttcctt 30

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cccgggggag aaaaggcttt gctttgacct c 31

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcaacatgnc catggttctg gtggtg 26

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

caatcatgnc caagaacaaa gagagccca 29

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggvactcatg tgatacatca tctcttccc 29

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

catcatctct tcccdcagat cccaca 26

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gttctaactg aaactcgcta gtttattg 28

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

agaggtcaac aaaataaccc acaaaaac 28

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

caaaggtcaa caaaataacc aaaaataag 29

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gatttctgcc cagtgctctg aa 22

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tctgccaagc ccgttccctt 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gagcgggacg aggtgtttgt 20

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gacaccatac acacagagaa ccca 24

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cccacattac cacttagtgg ag 22

<210> 22

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ggcaatcaag agtccatcac taaatc 26

<210> 23

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ggatccaaaa aaatgtctgc tggagggcga a 31

<210> 24

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tctagactaa agcttgttat tgtaccagaa c 31

<210> 25

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ggatccaaaa aaatgtctgt ttcttccggt 30

<210> 26

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

tctagactaa atctttttgg aaggaaagag c 31

<210> 27

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

tctaacgctg ctgatgaagt tgctacactt cttaactttg atcttcttaa gcttgctggt 60

gatgttgaat ctaaccctgg tcct 84

<210> 28

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

tctagaatgg gtgctggagg gcgaa 25

<210> 29

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

aagcttaaga agatcaaagt taagaagtgt agcaacttca tcagcagcgt tagaaagctt 60

gttattgtac cagaacacac c 81

<210> 30

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

aagcttgctg gtgatgttga atctaaccct ggtcctatgg ccgtttcttc cggtgc 56

<210> 31

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

cccgggctaa atctttttgg aaggaaagag ctc 33

<210> 32

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

actgcagcat cggtgattga ttcctttaaa gac 33

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

tgccaaatgt ttgaacgatc ggg 23

<210> 34

<211> 1526

<212> DNA

<213> 紫苏(Perilla frutescens)

<400> 34

accgcaccaa cctcactctt ccttcctttc tctcactaca aacacaggag agagagagag 60

agagagagag agagagagcg accgccttat tctcctctca ggtcgctgaa caatgggtgc 120

tggagggcga atgtccgtgc ctccggaggg taagaaggca aaatccgttg tcgaacgagt 180

tccattcacg aagcctccat tcacgcttgg tgagataaag aaagccattc caccccattg 240

cttcaagcga tccattcctc gttccttttc ctatgtccta tacgacctcg tcattgcctc 300

tctgttttac tacgtcgcca caaactattt ccatcaactc ccttaccctc tctcctacgt 360

agcctggcct ctttatatga tatgccaagg ttgcattcta actggtgttt gggtcatagc 420

ccatgaatgt ggccaccatg ccttcagtga ctaccaatgg ctggacgaca ccgtcggcct 480

agtcctccac tcgtttctcc tcgtccccta cttctcttgg aagtacagtc accgccgcca 540

ccactccaac actggttccc tcgagcggga cgaggtgttt gtacccaagg tcaagtcggc 600

actcggctcg tctgccaagt acctaaacaa cccacccggt agaatcctca ctctcatagt 660

ccagttcacc ctcggctggc ctttgtatct catgttcaat gtctccggaa ggccctacga 720

ccggttcgca tgccacttcg accctaagag cccgatttac tctgaccgcg agcgcgctca 780

gatcttcctc tcggatgtgg gcattctcgc catgctctac gggctgtacc gtttgaccct 840

tgctaaaggg ctcgcctggg ttctctgtgt gtatggtgtc ccgttgctcg tggtgaacgg 900

gttcctcgtc ttgatcacgt acttacagca cacccacgcc tccctcccgc attatgactc 960

gtcggagtgg gactggctgc ggggcgctct gtccacggtc gacagagatt acggcgttct 1020

caacaccgtc ttccataaca taacagacac ccatgtcgcg caccatttgt tctcgaccat 1080

gccgcactac cacgctatgg aagcgacgaa ggcgatcaaa ccaatcctag gcgagtacta 1140

ccagttcgac gggaccccgg tggctaaggc cgtgtggaga gaagcgaagg agtgtgtcta 1200

cgtcgagccc gatgaaggtg acaagaacaa aggtgtgttc tggtacaata acaagcttta 1260

gattatggga taaatatgca ggaaatgcag ttttctgggc tgttgttgta gatggttaaa 1320

ttatgctttc gttgtggtta acgataatct aggttgtgtc tttgtttaag ttaaggtaag 1380

aagtcttggt tcatgtgggt tgaataaggc ttagttagaa ctgtgttggg ttctaaaaag 1440

tcttggttaa ttttggatga ataagacttt gtaagaacta tttatgtttt ttttttttgt 1500

tgaggtcaaa gcaaagcctt ttctcc 1526

<210> 35

<211> 382

<212> PRT

<213> 紫苏(Perilla frutescens)

<400> 35

Met Gly Ala Gly Gly Arg Met Ser Val Pro Pro Glu Gly Lys Lys Ala

1 5 10 15

Lys Ser Val Val Glu Arg Val Pro Phe Thr Lys Pro Pro Phe Thr Leu

20 25 30

Gly Glu Ile Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Lys Arg Ser Ile

35 40 45

Pro Arg Ser Phe Ser Tyr Val Leu Tyr Asp Leu Val Ile Ala Ser Leu

50 55 60

Phe Tyr Tyr Val Ala Thr Asn Tyr Phe His Gln Leu Pro Tyr Pro Leu

65 70 75 80

Ser Tyr Val Ala Trp Pro Leu Tyr Met Ile Cys Gln Gly Cys Ile Leu

85 90 95

Thr Gly Val Trp Val Ile Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe Ser

100 105 110

Asp Tyr Gln Trp Leu Asp Asp Thr Val Gly Leu Val Leu His Ser Phe

115 120 125

Leu Leu Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Tyr Ser His Arg Arg His His

130 135 140

Ser Asn Thr Gly Ser Leu Glu Arg Asp Glu Val Phe Val Pro Lys Val

145 150 155 160

Lys Ser Ala Leu Gly Ser Ser Ala Lys Tyr Leu Asn Asn Pro Pro Gly

165 170 175

Arg Ile Leu Thr Leu Ile Val Gln Phe Thr Leu Gly Trp Pro Leu Tyr

180 185 190

Leu Met Phe Asn Val Ser Gly Arg Pro Tyr Asp Arg Phe Ala Cys His

195 200 205

Phe Asp Pro Lys Ser Pro Ile Tyr Ser Asp Arg Glu Arg Ala Gln Ile

210 215 220

Phe Leu Ser Asp Val Gly Ile Leu Ala Met Leu Tyr Gly Leu Tyr Arg

225 230 235 240

Leu Thr Leu Ala Lys Gly Leu Ala Trp Val Leu Cys Val Tyr Gly Val

245 250 255

Pro Leu Leu Val Val Asn Gly Phe Leu Val Leu Ile Thr Tyr Leu Gln

260 265 270

His Thr His Ala Ser Leu Pro His Tyr Asp Ser Ser Glu Trp Asp Trp

275 280 285

Leu Arg Gly Ala Leu Ser Thr Val Asp Arg Asp Tyr Gly Val Leu Asn

290 295 300

Thr Val Phe His Asn Ile Thr Asp Thr His Val Ala His His Leu Phe

305 310 315 320

Ser Thr Met Pro His Tyr His Ala Met Glu Ala Thr Lys Ala Ile Lys

325 330 335

Pro Ile Leu Gly Glu Tyr Tyr Gln Phe Asp Gly Thr Pro Val Ala Lys

340 345 350

Ala Val Trp Arg Glu Ala Lys Glu Cys Val Tyr Val Glu Pro Asp Glu

355 360 365

Gly Asp Lys Asn Lys Gly Val Phe Trp Tyr Asn Asn Lys Leu

370 375 380

<210> 36

<211> 1435

<212> DNA

<213> 紫苏(Perilla frutescens)

<400> 36

gttctaactg aaactcgcta gtttattgat tcaaaccctc cccaaaagaa tggccgtttc 60

ttccggtgcc cgcctctcga agagtggcgc tgatggagag gttttcgacg gccaacaaca 120

atacgaagga atcggaaaac gtgcggccga caaattcgac cccgccgcgc cgccgccgtt 180

caagatcgcc gacatccgag cggccatacc ggcgcattgc tgggtgaaga atccgtggcg 240

ctcattgagc tacgtcgttt gggacgtcgc cgccgtcttc gcgctgctcg ccgccgccgt 300

ttacatcaac agctgggcgt tttggccggt ttactggatt gctcagggaa ccatgttttg 360

ggcccttttc gttcttgggc atgattgtgg gcacgggagt ttttcggaca ataccacgct 420

gaataacgtg gtgggacatg tgcttcactc atcaattctt gtaccgtatc atggatggcg 480

aatcagccat agaactcacc accaaaacca tggacatgtc gagaaggacg agtcgtgggt 540

gccgttgcct gagaatttgt acaagaagtt ggatttttcc accaaattct tgagatacaa 600

aatcccattc cccatgtttg catacccttt atatttgtgg tatagaagtc cgggaaaaac 660

tggatctcac ttcaaccctt acagcgattt gtttaaacca aatgagaggg gtttgatagt 720

gacttcaaca atgtgctggg ctgcaatggg tgttttcctc ctctatgcct ccaccattgt 780

tggtccaaac atgatgttca agctctacgg cgtaccgtat ttgatattcg tgatgtggtt 840

ggacacggta acatacttac accaccacgg ttatgacaag aaactccctt ggtaccgcag 900

caaggaatgg agttatttac gaggaggatt gacgaccgta gatcaagatt atggattttt 960

taataaaatt caccacgata ttggcaccca tgttatacac catctattcc ctcagatccc 1020

acattaccac ttagtggagg cgacaaggga ggcgaaaagg gtgctgggga attactacag 1080

ggagcccaga aaatctgggc cagttccact acacttaatt cctgccttgt tgaaaagtct 1140

tggtagagat cattatgtta gtgataatgg agacatagtt tattatcaaa cagatgatga 1200

gctctttcct tccaaaaaga tttagtgatg gactcttgat tgccaaatta gatttaattt 1260

acagtagtcc tttgtgccac aatattttgt ttaggccagg aaatattgtg tgcacaaatt 1320

aaataactct agtgagtttt ttttggatca agtgtttgtt accttttttt tttttcctgt 1380

gataaatgta atgttcctta aataaactta tttttggtta ttttgttgac ctttg 1435

<210> 37

<211> 391

<212> PRT

<213> 紫苏(Perilla frutescens)

<400> 37

Met Ala Val Ser Ser Gly Ala Arg Leu Ser Lys Ser Gly Ala Asp Gly

1 5 10 15

Glu Val Phe Asp Gly Gln Gln Gln Tyr Glu Gly Ile Gly Lys Arg Ala

20 25 30

Ala Asp Lys Phe Asp Pro Ala Ala Pro Pro Pro Phe Lys Ile Ala Asp

35 40 45

Ile Arg Ala Ala Ile Pro Ala His Cys Trp Val Lys Asn Pro Trp Arg

50 55 60

Ser Leu Ser Tyr Val Val Trp Asp Val Ala Ala Val Phe Ala Leu Leu

65 70 75 80

Ala Ala Ala Val Tyr Ile Asn Ser Trp Ala Phe Trp Pro Val Tyr Trp

85 90 95

Ile Ala Gln Gly Thr Met Phe Trp Ala Leu Phe Val Leu Gly His Asp

100 105 110

Cys Gly His Gly Ser Phe Ser Asp Asn Thr Thr Leu Asn Asn Val Val

115 120 125

Gly His Val Leu His Ser Ser Ile Leu Val Pro Tyr His Gly Trp Arg

130 135 140

Ile Ser His Arg Thr His His Gln Asn His Gly His Val Glu Lys Asp

145 150 155 160

Glu Ser Trp Val Pro Leu Pro Glu Asn Leu Tyr Lys Lys Leu Asp Phe

165 170 175

Ser Thr Lys Phe Leu Arg Tyr Lys Ile Pro Phe Pro Met Phe Ala Tyr

180 185 190

Pro Leu Tyr Leu Trp Tyr Arg Ser Pro Gly Lys Thr Gly Ser His Phe

195 200 205

Asn Pro Tyr Ser Asp Leu Phe Lys Pro Asn Glu Arg Gly Leu Ile Val

210 215 220

Thr Ser Thr Met Cys Trp Ala Ala Met Gly Val Phe Leu Leu Tyr Ala

225 230 235 240

Ser Thr Ile Val Gly Pro Asn Met Met Phe Lys Leu Tyr Gly Val Pro

245 250 255

Tyr Leu Ile Phe Val Met Trp Leu Asp Thr Val Thr Tyr Leu His His

260 265 270

His Gly Tyr Asp Lys Lys Leu Pro Trp Tyr Arg Ser Lys Glu Trp Ser

275 280 285

Tyr Leu Arg Gly Gly Leu Thr Thr Val Asp Gln Asp Tyr Gly Phe Phe

290 295 300

Asn Lys Ile His His Asp Ile Gly Thr His Val Ile His His Leu Phe

305 310 315 320

Pro Gln Ile Pro His Tyr His Leu Val Glu Ala Thr Arg Glu Ala Lys

325 330 335

Arg Val Leu Gly Asn Tyr Tyr Arg Glu Pro Arg Lys Ser Gly Pro Val

340 345 350

Pro Leu His Leu Ile Pro Ala Leu Leu Lys Ser Leu Gly Arg Asp His

355 360 365

Tyr Val Ser Asp Asn Gly Asp Ile Val Tyr Tyr Gln Thr Asp Asp Glu

370 375 380

Leu Phe Pro Ser Lys Lys Ile

385 390

<210> 38

<211> 28

<212> PRT

<213> 紫苏(Perilla frutescens)

<400> 38

Ser Asn Ala Ala Asp Glu Val Ala Thr Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu

1 5 10 15

Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro

20 25

<210> 39

<211> 2406

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence )

<400> 39

atgggtgctg gagggcgaat gtccgtgcct ccggagggta agaaggcaaa atccgttgtc 60

gaacgagttc cattcacgaa gcctccattc acgcttggtg agataaagaa agccattcca 120

ccccattgct tcaagcgatc cattcctcgt tccttttcct atgtcctata cgacctcgtc 180

attgcctctc tgttttacta cgtcgccaca aactatttcc atcaactccc ttaccctctc 240

tcctacgtag cctggcctct ttatatgata tgccaaggtt gcattctaac tggtgtttgg 300

gtcatagccc atgaatgtgg ccaccatgcc ttcagtgact accaatggct ggacgacacc 360

gtcggcctag tcctccactc gtttctcctc gtcccctact tctcttggaa gtacagtcac 420

cgccgccacc actccaacac tggttccctc gagcgggacg aggtgtttgt acccaaggtc 480

aagtcggcac tcggctcgtc tgccaagtac ctaaacaacc cacccggtag aatcctcact 540

ctcatagtcc agttcaccct cggctggcct ttgtatctca tgttcaatgt ctccggaagg 600

ccctacgacc ggttcgcatg ccacttcgac cctaagagcc cgatttactc tgaccgcgag 660

cgcgctcaga tcttcctctc ggatgtgggc attctcgcca tgctctacgg gctgtaccgt 720

ttgacccttg ctaaagggct cgcctgggtt ctctgtgtgt atggtgtccc gttgctcgtg 780

gtgaacgggt tcctcgtctt gatcacgtac ttacagcaca cccacgcctc cctcccgcat 840

tatgactcgt cggagtggga ctggctgcgg ggcgctctgt ccacggtcga cagagattac 900

ggcgttctca acaccgtctt ccataacata acagacaccc atgtcgcgca ccatttgttc 960

tcgaccatgc cgcactacca cgctatggaa gcgacgaagg cgatcaaacc aatcctaggc 1020

gagtactacc agttcgacgg gaccccggtg gctaaggccg tgtggagaga agcgaaggag 1080

tgtgtctacg tcgagcccga tgaaggtgac aagaacaaag gtgtgttctg gtacaataac 1140

aagctttcta acgctgctga tgaagttgct acacttctta actttgatct tcttaagctt 1200

gctggtgatg ttgaatctaa ccctggtcct atggccgttt cttccggtgc ccgcctctcg 1260

aagagtggcg ctgatggaga ggttttcgac ggccaacaac aatacgaagg aatcggaaaa 1320

cgtgcggccg acaaattcga ccccgccgcg ccgccgccgt tcaagatcgc cgacatccga 1380

gcggccatac cggcgcattg ctgggtgaag aatccgtggc gctcattgag ctacgtcgtt 1440

tgggacgtcg ccgccgtctt cgcgctgctc gccgccgccg tttacatcaa cagctgggcg 1500

ttttggccgg tttactggat tgctcaggga accatgtttt gggccctttt cgttcttggg 1560

catgattgtg ggcacgggag tttttcggac aataccacgc tgaataacgt ggtgggacat 1620

gtgcttcact catcaattct tgtaccgtat catggatggc gaatcagcca tagaactcac 1680

caccaaaacc atggacatgt cgagaaggac gagtcgtggg tgccgttgcc tgagaatttg 1740

tacaagaagt tggatttttc caccaaattc ttgagataca aaatcccatt ccccatgttt 1800

gcataccctt tatatttgtg gtatagaagt ccgggaaaaa ctggatctca cttcaaccct 1860

tacagcgatt tgtttaaacc aaatgagagg ggtttgatag tgacttcaac aatgtgctgg 1920

gctgcaatgg gtgttttcct cctctatgcc tccaccattg ttggtccaaa catgatgttc 1980

aagctctacg gcgtaccgta tttgatattc gtgatgtggt tggacacggt aacatactta 2040

caccaccacg gttatgacaa gaaactccct tggtaccgca gcaaggaatg gagttattta 2100

cgaggaggat tgacgaccgt agatcaagat tatggatttt ttaataaaat tcaccacgat 2160

attggcaccc atgttataca ccatctattc cctcagatcc cacattacca cttagtggag 2220

gcgacaaggg aggcgaaaag ggtgctgggg aattactaca gggagcccag aaaatctggg 2280

ccagttccac tacacttaat tcctgccttg ttgaaaagtc ttggtagaga tcattatgtt 2340

agtgataatg gagacatagt ttattatcaa acagatgatg agctctttcc ttccaaaaag 2400

atttag 2406

<210> 40

<211> 801

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence )

<400> 40

Met Gly Ala Gly Gly Arg Met Ser Val Pro Pro Glu Gly Lys Lys Ala

1 5 10 15

Lys Ser Val Val Glu Arg Val Pro Phe Thr Lys Pro Pro Phe Thr Leu

20 25 30

Gly Glu Ile Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Lys Arg Ser Ile

35 40 45

Pro Arg Ser Phe Ser Tyr Val Leu Tyr Asp Leu Val Ile Ala Ser Leu

50 55 60

Phe Tyr Tyr Val Ala Thr Asn Tyr Phe His Gln Leu Pro Tyr Pro Leu

65 70 75 80

Ser Tyr Val Ala Trp Pro Leu Tyr Met Ile Cys Gln Gly Cys Ile Leu

85 90 95

Thr Gly Val Trp Val Ile Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe Ser

100 105 110

Asp Tyr Gln Trp Leu Asp Asp Thr Val Gly Leu Val Leu His Ser Phe

115 120 125

Leu Leu Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Tyr Ser His Arg Arg His His

130 135 140

Ser Asn Thr Gly Ser Leu Glu Arg Asp Glu Val Phe Val Pro Lys Val

145 150 155 160

Lys Ser Ala Leu Gly Ser Ser Ala Lys Tyr Leu Asn Asn Pro Pro Gly

165 170 175

Arg Ile Leu Thr Leu Ile Val Gln Phe Thr Leu Gly Trp Pro Leu Tyr

180 185 190

Leu Met Phe Asn Val Ser Gly Arg Pro Tyr Asp Arg Phe Ala Cys His

195 200 205

Phe Asp Pro Lys Ser Pro Ile Tyr Ser Asp Arg Glu Arg Ala Gln Ile

210 215 220

Phe Leu Ser Asp Val Gly Ile Leu Ala Met Leu Tyr Gly Leu Tyr Arg

225 230 235 240

Leu Thr Leu Ala Lys Gly Leu Ala Trp Val Leu Cys Val Tyr Gly Val

245 250 255

Pro Leu Leu Val Val Asn Gly Phe Leu Val Leu Ile Thr Tyr Leu Gln

260 265 270

His Thr His Ala Ser Leu Pro His Tyr Asp Ser Ser Glu Trp Asp Trp

275 280 285

Leu Arg Gly Ala Leu Ser Thr Val Asp Arg Asp Tyr Gly Val Leu Asn

290 295 300

Thr Val Phe His Asn Ile Thr Asp Thr His Val Ala His His Leu Phe

305 310 315 320

Ser Thr Met Pro His Tyr His Ala Met Glu Ala Thr Lys Ala Ile Lys

325 330 335

Pro Ile Leu Gly Glu Tyr Tyr Gln Phe Asp Gly Thr Pro Val Ala Lys

340 345 350

Ala Val Trp Arg Glu Ala Lys Glu Cys Val Tyr Val Glu Pro Asp Glu

355 360 365

Gly Asp Lys Asn Lys Gly Val Phe Trp Tyr Asn Asn Lys Leu Ser Asn

370 375 380

Ala Ala Asp Glu Val Ala Thr Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu

385 390 395 400

Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Met Ala Val Ser Ser Gly

405 410 415

Ala Arg Leu Ser Lys Ser Gly Ala Asp Gly Glu Val Phe Asp Gly Gln

420 425 430

Gln Gln Tyr Glu Gly Ile Gly Lys Arg Ala Ala Asp Lys Phe Asp Pro

435 440 445

Ala Ala Pro Pro Pro Phe Lys Ile Ala Asp Ile Arg Ala Ala Ile Pro

450 455 460

Ala His Cys Trp Val Lys Asn Pro Trp Arg Ser Leu Ser Tyr Val Val

465 470 475 480

Trp Asp Val Ala Ala Val Phe Ala Leu Leu Ala Ala Ala Val Tyr Ile

485 490 495

Asn Ser Trp Ala Phe Trp Pro Val Tyr Trp Ile Ala Gln Gly Thr Met

500 505 510

Phe Trp Ala Leu Phe Val Leu Gly His Asp Cys Gly His Gly Ser Phe

515 520 525

Ser Asp Asn Thr Thr Leu Asn Asn Val Val Gly His Val Leu His Ser

530 535 540

Ser Ile Leu Val Pro Tyr His Gly Trp Arg Ile Ser His Arg Thr His

545 550 555 560

His Gln Asn His Gly His Val Glu Lys Asp Glu Ser Trp Val Pro Leu

565 570 575

Pro Glu Asn Leu Tyr Lys Lys Leu Asp Phe Ser Thr Lys Phe Leu Arg

580 585 590

Tyr Lys Ile Pro Phe Pro Met Phe Ala Tyr Pro Leu Tyr Leu Trp Tyr

595 600 605

Arg Ser Pro Gly Lys Thr Gly Ser His Phe Asn Pro Tyr Ser Asp Leu

610 615 620

Phe Lys Pro Asn Glu Arg Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Met Cys Trp

625 630 635 640

Ala Ala Met Gly Val Phe Leu Leu Tyr Ala Ser Thr Ile Val Gly Pro

645 650 655

Asn Met Met Phe Lys Leu Tyr Gly Val Pro Tyr Leu Ile Phe Val Met

660 665 670

Trp Leu Asp Thr Val Thr Tyr Leu His His His Gly Tyr Asp Lys Lys

675 680 685

Leu Pro Trp Tyr Arg Ser Lys Glu Trp Ser Tyr Leu Arg Gly Gly Leu

690 695 700

Thr Thr Val Asp Gln Asp Tyr Gly Phe Phe Asn Lys Ile His His Asp

705 710 715 720

Ile Gly Thr His Val Ile His His Leu Phe Pro Gln Ile Pro His Tyr

725 730 735

His Leu Val Glu Ala Thr Arg Glu Ala Lys Arg Val Leu Gly Asn Tyr

740 745 750

Tyr Arg Glu Pro Arg Lys Ser Gly Pro Val Pro Leu His Leu Ile Pro

755 760 765

Ala Leu Leu Lys Ser Leu Gly Arg Asp His Tyr Val Ser Asp Asn Gly

770 775 780

Asp Ile Val Tyr Tyr Gln Thr Asp Asp Glu Leu Phe Pro Ser Lys Lys

785 790 795 800

Ile

Claims (5)

1.过表达PfFAD2基因和过表达PfFAD3基因在大宗油料作物中提高种子α-亚麻酸含量的应用，其特征在于：所述PfFAD2基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.35所示，所述PfFAD3基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.37所示；所述大宗油料作物为甘蓝型油菜。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述PfFAD2基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.34所示；所述PfFAD3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示。

3.一种获得高产α-亚麻酸的大宗油料作物的方法，其特征在于：具体是在大宗油料作物过量表达PfFAD2基因和PfFAD3基因，所述PfFAD2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示；所述PfFAD3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示；所述大宗油料作物为甘蓝型油菜。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述在大宗油料作物过量表达PfFAD2基因和PfFAD3基因的方法是，构建含有PfFAD2基因和PfFAD3基因的重组表达载体pC2301M1NPB-PfFAD2-LP4-2A-PfFAD3，转化根癌农杆菌LBA4404，检测获得含pC2301M1NPB-PfFAD2-LP4-2A-PfFAD3的LBA4404工程菌株，然后用含pC2301M1NPB-PfFAD2-LP4-2A-PfFAD3的LBA4404工程菌株转化大宗油料作物，筛选转基因植物即获得高产α-亚麻酸的大宗油料作物。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述述重组载体由SEQ ID NO.39所示序列连入pC2301M1NPB质粒XbaI与XmaI酶切位点而得。

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