CN110452912B

CN110452912B - 棉花长纤维高表达基因GhLFHE3及其转基因棉花制备方法和应用

Info

Publication number: CN110452912B
Application number: CN201910788905.2A
Authority: CN
Inventors: 罗明; 徐梦贝; 牛琪; 锁晓栋; 徐俊; 何昇阳
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2019-08-26
Filing date: 2019-08-26
Publication date: 2021-02-09
Anticipated expiration: 2039-08-26
Also published as: CN110452912A

Abstract

本发明公开了棉花长纤维高表达基因GhLFHE3及其转基因棉花制备方法和应用，GhLFHE3基因的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明在棉花中超量表达的GhLFHE3基因不仅可以促进转基因棉花纤维伸长，还能有效的降低转基因棉花对铝毒害的耐受性提高转基因棉花纤维品质。

Description

棉花长纤维高表达基因GhLFHE3及其转基因棉花制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及棉花长纤维高表达基因GhLFHE3及其转基因棉花制备方法和应用。

背景技术

棉花是世界上主要的纤维作物之一。棉花纤维细胞是棉花胚珠外珠被表皮细胞经分化突起和极性伸长而成的单细胞。其生长发育过程分为四个既明显区分又有所重叠的时期：纤维细胞起始期、纤维细胞伸长期、次生壁增厚期和脱水成熟期。每个时期都有各自的特点，但相邻发育时期又有所重叠。纤维发育的每个时期对纤维的产量和/或品质都有影响，纤维的分化起始决定了单粒胚珠中纤维的数量，纤维细胞伸长速率和持续时间主要决定了纤维的长度，同时也影响纤维产量；次生壁沉积的方式和持续时间主要决定了成熟纤维的强度和次生壁厚度。纤维伸长期是(初生壁合成期)从开花当天开始，可以持续到开花后25天(25DPA)，主要进行细胞极性伸长和初生细胞壁的合成，这时期的纤维伸长速率和持续时间决定纤维的最终长度，陆地棉纤维长径比可达1000-3000。但迄今为止，我们对调控纤维伸长的有效基因仍知之甚少。

棉花ligonlintless-1(li-1)突变体是棉花栽培种TM-1的一个自然突变体，该突变体具有极短的纤维，而纤维细胞的分化和起始与野生型没有明显差异，因此li-1突变体是研究纤维细胞伸长的良好材料。利用2-DE和本地化EST数据库支持的MS/MS技术，zhao等人在li-1和TM-1的12DPA纤维细胞中发现81个差异表达的蛋白质，而在6DPA纤维中没有发现明显的差异表达蛋白(ZhaoPM，WangLL，HanLB，WangJ，YaoY，WangHY，DuXM，LuoYM，XiaGX(2010)ProteomicidentificationofdifferentiallyexpressedproteinsintheLigonlintlessmutantofup landcotton(GossypiumhirsutumL.).J.ProteomeRes9:1076-1087)。但是2-DE技术难以检测低丰度蛋白质，因此可能漏检对纤维伸长有重要调控作用的蛋白。Liu等人通过转录组分析证实，有577个转录本在6DPA的li-1和TM-1纤维中差异表达，而在0DPA胚珠和3DPA纤维中仅有少许基因的差异表达(LiuK，SunJ，YaoLY，YuanYL(2012)TranscriptomeanalysisrevealscriticalgenesandkeypathwaysforearlycottonfiberelongationinLigonlintless-1mutant.Genomics100:42-50)。这些结果说明突变体的纤维变短是与纤维伸长期相关基因的表达变化有密切关系。

鞘脂(sphingolipids)是含有长链鞘样碱基骨架的一类结构复杂的脂类分子，它广泛存在于真核生物中。动物、植物和真菌细胞中约有300-400个不同种类的鞘脂分子(Hannun and Luberto，2000)。鞘脂不仅是生物膜结构的重要成分，也是重要的生物活性分子。鞘脂是生物膜上脂筏的主要组成成分，而脂筏是生物膜的重要部位和性质调控中心。不同种类的鞘脂存在于不同组织中，甚至是同一组织的不同细胞类型中。

鞘脂在动物和真菌中的功能较为清楚，但鞘脂在植物生长发育中的功能还远未清楚，仅认为植物鞘脂在细胞信号、膜稳定性、生物和非生物胁迫响应和细胞程序性凋亡中具有重要作用。研究报道：鞘氨醇-1-磷酸参与拟南芥保卫细胞中干旱诱导的信号转导，且与脱落酸引起的细胞膨胀的还原有关；鞘氨醇-1-磷酸可以调节拟南芥保卫细胞膨压，促使Ca2+介导的保卫细胞关闭，同时抑制质膜内部K+通道和慢性阴离子通道的活动(Tonnettietal.，1999；NgandHetherington，2001a；Sylvieetal.，2005)。低浓度的鞘氨醇刺激细胞生长，高浓度的鞘氨醇则对细胞有毒害作用(LynchandDunn，2004)。鞘脂分子通过增强植物质膜和液泡膜的稳定性来促进植物对各种逆境(干旱、重金属、低温)的忍耐或适应(Dunnetal.，2004)。在干旱胁迫时，鸭跖草表皮细胞内鞘氨醇-1-磷酸浓度增加，从而增强Ca2+的流动性，改变保卫细胞膨压，进而促使保卫细胞关闭，以缓解干旱逆境对植物的伤害(Ngetal.，2001b)。这些研究初步揭示了鞘脂在植物生长发育中具有重要作用，但是鞘脂是否能促进植物细胞伸长还没有任何报道。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一个在长纤维(相对于突变体的超短纤维)生长的快速伸长期高表达的基因GhLFHE3(Long Fiber High Expression 3)及其应用，即在利用基因工程促进棉花纤维伸长，提高棉花纤维长度，增加纤维品质和产量方面的应用，以及在提高棉花抗逆性方面的应用。

本发明通过下述技术方案实现：

棉花长纤维高表达基因GhLFHE3及其转基因棉花制备方法和应用，GhLFHE3基因的cDNA核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

棉花长纤维高表达基因GhLFHE3，GhLFHE3基因的gDNA核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

棉花长纤维高表达基因GhLFHE3，GhLFHE3的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。

棉花长纤维高表达基因GhLFHE3的表达载体，表达载体中包含GhLFHE3基因和启动子序列。

棉花长纤维高表达转化体，转化体由包含GhLFHE3基因和启动子序列的表达载体转化宿主获得。

含有棉花长纤维高表达基因GhLFHE3的转基因棉花的制备方法，包括以下步骤：

(1)将基因GhLFHE3与启动子连接，导入植物表达载体，构建得到重组载体；

(2)用重组载体转化宿主，得到转化体；

(3)用转化体转化棉花，得到转基因棉花。

含有棉花长纤维高表达基因GhLFHE3的转基因棉花的制备方法，步骤(1)中启动子为增强型、组成型、组织特异型、诱导型启动子中的一种或多种。

含有棉花长纤维高表达基因GhLFHE3的转基因棉花的制备方法，步骤(2)中表达载体中包含筛选基因序列、报告基因序列、GUS基因中的一种或多种。

含有棉花长纤维高表达基因GhLFHE3的转基因棉花的制备方法，步骤(1)中启动子为CaMV35S启动子。

SEQIDNO1所示的核苷酸序列为编码棉花GhLFHE3基因的cDNA序列，SEQIDNO2所示的核苷酸序列为GhLFHE3的基因组DNA序列，该基因的基因组序列中无内含子，因此基因组序列与cDNA序列一致。

植物表达载体，其至少含GhLFHE3基因和启动子序列，所述植物表达载体通过将GhLFHE3基因、启动子序列与植物表达载体可操作地连接而构建。为了筛选和表达的需要，还可选地在表达载体中包含筛选基因序列、报告基因序列以及其它的为基因工程操作的需要而插入的各种内切酶位点，筛选基因和报告基因可以从本领域常用的基因序列中选择，可以在所述表达载体中加入在植物中能表达的编码可发生颜色变化的酶或发光化合物的基因，如GUS基因、GFP基因、荧光素酶等；具有抗性的抗生素标记物，如抗庆大霉素标记物、抗卡拉霉素标记物等；抗化学试剂标记基因，如抗除草剂基因等。

用于构建本发明植物表达载体的启动子可以是任意一种启动子，包括增强型、组成型、组织特异型以及诱导型启动子。构建表达载体时，所述启动子可以单独使用，还可以和其它植物启动子结合使用。

进一步的，本发明的植物表达载体具有如图5所示的结构。用于构建本发明植物表达载体的启动子来源于花椰菜花叶病毒的植物组成型启动子CaMV35S。并且，将GhLFHE3基因构建在CaMV35S的下游。用于构建本发明植物表达载体的出发载体可以是任意一种双元农杆菌载体或者可用于微弹轰击的载体。

优选的，在本发明的一种具体实施方案中，将GhLFHE3基因正向插入植物表达载体pCambia-35S-NOS中，用CaMV35S启动子启动表达，构建了含有GhLFHE3基因的植物表达载体pCambia-35S-GhLFHE3-NOS，其具有如图6所示的结构，该表达载体同时包含了报告基因序列，筛选基因序列和用于基因操作的各内切酶位点。

优选的，在本发明的一种具体实施方案中，将GhLFHE3基因反向插入植物表达载体pCambia-35S-NOS中，用CaMV35S启动子启动表达，构建了含有GhLFHE3基因反义序列的植物表达载体pCambia-35S-antisense GhLFHE3-NOS，其具有如图7所示的结构，该表达载体同时包含了报告基因序列，筛选基因序列和用于基因操作的各内切酶位点。

其次，本发明提供一种转化体，通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物或微生物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导或农杆菌介导等常规生物学方法，将含有本发明GhLFHE3基因的表达载体转染棉花而获得转化体。

另外，现有专利CN201811058134.3一种棉花长纤维高表达基因GhLFHE2及其编码的蛋白质和应用中记载的拟南芥葡萄糖神经酰胺合成酶与本发明的拟南芥鞘脂delta8-去饱和酶相比，鞘脂是含有鞘氨醇长链和脂肪酸链的结构复杂的脂质分子，具有丰富的结构多样性，种类数以百计，不同分子类型和占比对植物发育具有重要作用。鞘脂分子由三个主要成分组成：鞘氨醇长链(Long-Chain Base,LCB)，脂肪酸(Fatty Acid,FA)长链和极性头基。FA通过酰胺键与LCB C-2位结合，形成最简单的鞘脂——神经酰胺(Ceramide,Cer)。神经酰胺既是鞘脂的基本单位，也是更复杂鞘脂的前体。鞘脂结构的复杂性产生于构成它的三个主要成分的多样性。根据不同的来源，神经酰胺的基本结构可以通过不同的C链长度、甲基分支、羟基的插入和不饱和度来改变。因此鞘脂合成途径中不同的合成酶对调控植物体中不同的鞘脂分子的含量具有重要作用。delta8去饱和酶(delta8 Desaturases,delta8DES)催化二氢神经酰胺中碱基长链的第8位去饱和，从而增加该类分子的含量和占比。GhLFHE2是葡萄糖神经酰胺合成酶，其作用是催化神经酰胺合成葡萄糖基神经酰胺，因此它既可以催化LCB上C-4位不饱和的神经酰胺，也可以催化LCB上C-8位不饱和的神经酰胺，以及其他多种变化的神经酰胺分子。delta8去饱和酶和葡萄糖神经酰胺合成酶虽然都是鞘脂合成途径中不同步骤的酶，但他们的活性变化不是对单一终产物含量的影响，而是产生不同分子结构的鞘脂，改变某类分子的含量和占比，从而影响植物的发育进程。因此GhLFHE2和GhLFHE3在植物发育中的功能，特别是在纤维细胞发育中的功能不能相互推演。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

本发明棉花长纤维高表达基因GhLFHE3及其转基因棉花制备方法和应用，本发明在棉花中超量表达的GhLFHE3基因不仅可以促进转基因棉花纤维伸长，相反，在棉花中抑制GhLFHE3基因表达则抑制纤维伸长，还能有效的降低转基因棉花对铝毒害的耐受性，可有效的用于改良棉花纤维品质和抗逆性育种。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

图1：GhLFHE3基因在TM-1和超短纤维突变体li-1纤维和胚珠中的表达。TM-1：陆地棉野生型；li-1：超短纤维突变体；FO-0DPA:开花当天的胚珠纤维；FO-5DPA:开花后5天的胚珠纤维；F-10DPA：开花后10天的纤维细胞；O-10DPA：开花后10天的胚珠。

图2：GhLFHE3蛋白质与其他物种相关蛋白质的同源性比较。

At8DES1：拟南芥(Arabidopsis thaliana)鞘脂delta8去饱和酶1；At8DES2：拟南芥(Arabidopsis thaliana)鞘脂delta8去饱和酶2；Nt8DES：烟草(Nicotiana tabacum)鞘脂delta8去饱和酶；Pt8DES:杨树(Populus tomentosa)鞘脂delta8去饱和酶；Ha8DES：向日葵(Helianthus annuus)鞘脂delta8去饱和酶。单下划线表示细胞色素b5保守结构域，双下划线表示H-box保守结构域，这是去饱和酶特有的保守结构域。

图3：GhLFHE3的系统进化分析。

At8DES1：拟南芥(Arabidopsis thaliana)鞘脂delta8去饱和酶1；At8DES2：拟南芥(Arabidopsis thaliana)鞘脂delta8去饱和酶2；Tc8DES:可可(Theobroma cacao)鞘脂delta8去饱和酶；Cs8DES：甜橙(Citrus sinensis)鞘脂delta8去饱和酶；Pt8DES：杨树(Populus tomentosa)鞘脂delta8去饱和酶；Vv8DES:葡萄(Vitis vinifera)鞘脂delta8去饱和酶；Br8DES：油菜(Brassica rapa)鞘脂delta8去饱和酶；Gm8DES：大豆(Glycine max)鞘脂delta8去饱和酶；Os8DES：水稻(Oryza sativa)鞘脂delta8去饱和酶；Zm8DES：玉米(Zea mays)鞘脂delta8去饱和酶。

图4：GhLFHE3基因的表达分析。其中A：GhLFHE3基因在棉花不同组织和器官中的表达模式。Root:根；Stem:茎；Leaf:叶；Flower：花；0dpa：开花当天的胚珠(包含突起的纤维细胞)；10-O：开花后10天的胚珠(不含纤维细胞)；10-F：开花后10天的纤维；16-F：开花后16天的纤维细胞。其中B：GhLFHE3基因在纤维细胞和胚珠不同发育时期的表达水平。0DPA和4DPA分别代表开花当天和开花后4天的胚珠(含纤维细胞)，6～20-F分别代表开花后6～20天的纤维，6～20-O分别代表开花后6～20天的胚珠。

图5：含GhLFHE3基因的植物表达载体的结构图，其中35S代表CaMV35S启动子；GhLFHE3代表GhLFHE3基因cDNA；term代表终止子；LB代表T-DNA左边界；RB代表T-DNA右边界。

图6：本发明优选的植物表达载体pCambia-35S-GhLFHE3-NOS结构图。其中GRP-GusPlus-His6代表GUSPlus报告基因，该基因在N端融合了GRP信号肽，在C端融合了His6序列标签；NPTII代表新霉素磷酸转移酶基因，具有卡拉霉素抗性；term：Nos终止子；CaMV35S：来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；LB：T-DNA左边界；RB：T-DNA右边界。植物表达载体为改造的pCambia载体(详见实施例三)。

图7：本发明优选的反义抑制GhLFHE3基因植物表达载体pCambia-35S-反义GhLFHE3-NOS结构图。其中GRP-GusPlus-His6代表GUSPlus报告基因，该基因在N端融合了GRP信号肽，在C端融合了His6序列标签；NPTII代表新霉素磷酸转移酶基因，具有卡拉霉素抗性；term：Nos终止子；CaMV 35S：来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；LB：T-DNA左边界；RB：T-DNA右边界。植物表达载体为改造的pCambia载体(详见实施例三)。

图8.超量表达GhLFHE3转基因棉花的鉴定。其中A为转基因棉花的组织化学鉴定；B为转基因棉花的分子生物学鉴定；C是超量表达GhLFHE3转基因棉花的表达分析。WT为野生型；1为超量表达GhLFHE3转基因棉花；M为DNA Marker；+为阳性对照，以pLGN-GhLFHE3植物表达载体质粒为PCR扩增模板；H2O为空白对照，以水为PCR扩增模板；-为阴性对照，以野生型棉花(J14)的基因组DNA为PCR扩增模板。

图9.超量表达GhLFHE3促进棉花纤维伸长。其中，Control代表非转基因棉花(野生型)；S-GhLFHE3代表超量表达GhLFHE3转基因棉花；“**”表示与WT组差异极显著(P＜0.01)，用t测验计算显著性差异。

图10.反义抑制GhLFHE3转基因棉花的鉴定。其中A为转基因棉花的组织化学鉴定；B为转基因棉花的分子生物学鉴定；C反义抑制GhLFHE3转基因棉花的表达分析。WT为野生型；1为反义抑制GhLFHE3转基因棉花；M为DNA Marker；+为阳性对照，以pLGN-反义GhLFHE3植物表达载体质粒为PCR扩增模板；H2O为空白对照，以水为PCR扩增模板；-为阴性对照，以野生型棉花(J14)的基因组DNA为PCR扩增模板。

图11.反义抑制GhLFHE3基因抑制纤维伸长。WT为野生型棉花纤维，A-GhLFHE3为反义抑制GhLFHE3转基因棉花植株，标尺＝1cm。“**”表示与WT组差异极显著(P＜0.01)，用t测验计算显著性差异。

图12.抑制GhLFHE3基因表达降低棉花对铝毒害的耐受性。其中A是野生型棉花(WT)和A-GhLFHE3棉花对Al胁迫的响应；B是Al处理后WT和A-GhLFHE3棉花叶片的变化；C是Al处理WT和A-GhLFHE3棉花上下胚轴的变化；D是总根长的统计。WT为野生型，A-GhLFHE3为反义抑制GhLFHE3转基因棉花，Mock(M)为不加Al处理的空白对照组，50μM Al(Al)为用50μMAlCl3处理的实验组。标尺＝10cm。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例1

1、棉花RNA的提取

棉花各种样品总RNA提取使用“EASYspin植物RNA快速提取试剂盒”(北京艾德莱生物科技有限公司)，取新鲜样品材料100mg，在液氮中研磨后转入1.5毫升离心管中，加入1毫升RLT和100微升PLANTaid，剧烈摇晃振荡15秒，13000rmp离心10分钟；取上清，加入1/2体积的无水乙醇，混匀后转入到吸附柱RA中，13000rpm离心2分钟，弃流出液；在吸附柱RA中加入700微升去蛋白液RW1，室温放置1分钟，13000rpm离心30秒，弃流出液；加入500微升漂洗液RW(用前按要求加入无水乙醇)，13000rpm离心30秒，弃流出液，然后重复1遍；将吸附柱RA放回空收集管中，13000rpm离心2分钟，除尽漂洗液；取出吸附柱RA，放入一个无RNA酶离心管中，加入50微升无RNA酶水，室温放置1分钟，12000rpm离心1分钟。用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量。

2、cDNA合成

提取棉花各种样品总RNA，用试剂盒(Fermentas)合成cDNA一链。具体方法为：取约10μg总RNA到DEPC-处理的扩增管中，加入1μL 2.5μmol/L Oligo-dT，加DEPC处理的水至终体积12μL，70℃水浴5min使RNA变性后，立即冰浴3min。然后向扩增管中依次加入4μL 5×reaction buffer，2μL 10mmol/L dNTPs，1μL RNase inhibitor(20U)，37℃处理5min。加入1μL AMV Rtase(5U)后，保温程序为42℃，60min；70℃，5min；5℃，5min。程序结束后，一链产物于-20℃冻存。

3、筛选陆地棉中同源性较高的基因序列

以拟南芥鞘脂delta8-去饱和酶的蛋白质序列搜索陆地棉基因组数据库(https://cottonfgd.org/)。检测到10个与拟南芥鞘脂delta8-去饱和酶具有一定同源性的基因，其中一个基因编号为Gh_D08G2583。根据该基因序列设计表达引物，检测TM-1及其超短纤维突变体纤维发育相同时期的表达差异。该基因在长纤维中的表达水平比短纤维中的表达水平高，因此命名为长纤维高表达基因GhLFHE3(Long Fiber High Expression 3)。

4、利用实时定量RT-PCR进行差异表达分析

以合成的cDNA一链作为模板，采用实时定量PCR试剂盒(Bio-Rad)进行PCR。表达引物依据GhLFHE3的cDNA序列设计，5’端引物为GhLFHE3-e1(SEQ ID NO.6)，3’端引物为GhLFHE3-e2(SEQ ID NO.7)。在20μL的反应体系中包括10μL MIX缓冲液(包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs和MgCl2)，5'-端和3'-端表达引物各1μL(5μmol/L)。循环参数为94℃预变性3min；94℃，30sec，55℃，30sec，72℃，30sec，预设循环数为40。用棉花GhHISTONE3基因(GenBank登录号：AF024716)作内标，GhHISTONE3基因的5'-引物是GhHIS-1(5'-GAAGCCTCATCGATACCGTC-3')，3'-引物为GhHIS-2(5'’-CTACCACTACCATCATGGC-3')。利用实时定量RT-PCR检测了TM-1和li-1突变体开花当天的胚珠纤维(FO-0DPA)、开花后5天的胚珠纤维(FO-5DPA)、开花后10天的纤维细胞(F-10DPA)和开花后10天的胚珠(O-10DPA)中GhLFHE3基因的表达差异。结果表明该基因的表达水平在5DPA胚珠纤维和10DPA纤维中出现显著差异，而在0DPA胚珠纤维和10DPA胚珠中表达水平相似(图1)。由此推测GhLFHE3基因在5DPA胚珠纤维中的表达差异主要也来源于5DPA纤维细胞中的差异表达。这结果说明GhLFHE3基因在长纤维中的表达水平远远高于相同发育时期超短纤维中的表达水平，因此将该基因命名为长纤维高表达基因(Long Fiber High Expression 2，GhLFHE3)。该基因在纤维细胞伸长中具有重要作用。

5、扩增片段回收，连接，转化大肠杆菌DH5a

(1)电泳

将扩增产物在1.0％(W/V)琼脂糖凝胶中进行电泳分离。

(2)回收

使用回收试剂盒：回收步骤按照试剂盒说明书进行，回收片段在琼脂糖凝胶上电泳定量。

(3)克隆和测序

回收的片段经琼脂糖凝胶电泳定量。按试剂盒说明书，通过回收片段与克隆载体的连接、连接产物的大肠杆菌转化、阳性菌落的培养和质粒酶切验证，将回收片段克隆到pGEm-T(上海Sangon)载体上。序列测定由英骏公司完成。

回收的片段与pGEm-T(上海生工)载体建立如下连接体系:

用双蒸水补足体积至10μL的连接体系

载体DNA片段与外源连接产物DNA片段摩尔比为1:3，16℃连接12h。之后将连接产物转化大肠杆菌DH5a。

6、棉花基因组DNA的提取

棉花基因组DNA提取使用“新型植物基因组DNA快速提取试剂盒”(北京艾德莱生物科技有限公司)。具体方法是取棉花嫩叶材料100毫克，在液氮中研磨后转入1.5毫升离心管中，加入400微升缓冲液和4微升RNase A(10mg/mL)；涡旋混匀，65℃水浴10分钟，其中颠倒混匀2-3次；加入130微升缓冲液AP2，充分混匀，冰上放置5分钟，14000rpm离心10分钟，取上清；加入1.5倍体积的AP3/E(已加入无水乙醇)，立即混匀；混匀后加入一个吸附柱AC中，13000rpm离心1分钟，弃流出液；加入600微升漂洗液WB(已加入无水乙醇)，12000rpm离心30秒，弃流出液；将吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm离心2分钟，除尽漂洗液；取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，加入100微升洗脱缓冲液EB(65-70℃预热)，室温放置3-5分钟，12000rpm离心1分钟，-20℃保存备用。

7、GhLFHE3基因序列分析

以陆地棉基因组数据库(https://cottonfgd.org/)中Gh_D08G2583的cDNA序列作为参考序列，在其推测ORF两侧设计扩增引物，其中5'引物为GhLFHE3-1(SEQ ID NO.4),3'引物为GhLFHE3-2(SEQ ID NO.5)。运用这对引物，以陆地棉冀14的12DPA纤维cDNA为模板，扩增出一条大约1500bp的特异带。测序后发现该扩增特异片段长1541bp(SEQ ID NO.1)，包含一个完整的ORF(图2)，长1344bp。编码一个447个氨基酸残基的蛋白质(SEQ ID NO.3)，该蛋白质预测的分子量为51.3kD，等电点为8.297。

在NCBI上搜索GhLFHE3的同源蛋白，该蛋白与可可、杨树、甜橙和葡萄的鞘脂delta8-去饱和酶具有较高的同源性，说明GhLFHE3基因是棉花中鞘脂delta8-去饱和酶基因的同源基因。

系统进化分析结果表明GhLFHE3与可可、杨树、甜橙和葡萄等植物的鞘脂delta8-去饱和酶具有较近的亲缘关系，而与水稻、玉米等单子叶植物的鞘脂delta8-去饱和酶的亲缘关系较远(图3)。

同时从陆地棉中克隆了GhLFHE3的基因组DNA序列，该序列长1541bp(SEQ IDNO.2)，通过与GhLFHE3基因的cDNA序列进行比对分析，结果发现，GhLFHE3基因组序列与cDNA序列完全一致，说明GhLFHE3基因组序列中无内含子。

实施例2

GhLFHE3基因在棉花植株和纤维发育中的表达分析

提取陆地棉(Gossypium hirsutum L.)各组织和器官的总RNA，并合成cDNA一链。用实时定量RT-PCR检测了GhLFHE3基因在不同组织和器官中的表达情况。检测结果表明，GhLFHE3在棉花10DPA纤维中具有很高的表达水平，10DPA胚珠、根、茎、叶和花中的表达水平远远低于纤维中的表达水平(图4A)。说明该基因是一个纤维细胞优势表达基因，与纤维细胞发育具有密切关系。

进一步检测GhLFHE3在棉花胚珠纤维不同发育时期的表达情况。结果表明：该基因在纤维细胞起始期(0DPA)表达水平极低，随着纤维细胞的发育，基因的表达水平快速上升，在纤维发育的快速伸长期(6DPA～12DPA)GhLFHE3的表达水平很高，表达峰值出现在18DPA纤维中；其后，随着纤维伸长速度降低和次生壁的逐渐形成，该基因的表达水平明显降低。该基因在胚珠中的表达一直处于较低的水平(图4B)。说明该基因是一个纤维优势表达基因，在纤维快速伸长期高量表达，进一步证明该基因与纤维细胞伸长有密切关系，对纤维伸长具有重要作用。

实施例3

超量表达和反义抑制GhLFHE3基因植物表达载体的构建

pGEm-GhLFHE3载体是在克隆GhLFHE3基因时构建，其上的GhLFHE3片段已测序。植物表达载体为改造的pCambia载体，该载体的HPT II基因用XhoI单酶切后替换为NPT II基因(设计引物从pBI121载体中扩增获得，引物设计两端带XhoI位点)，限制性酶切和测序结果验证了NPT II基因的方向。在pBI121载体中扩增获得CaMV35S启动子和NOS终止子，同时这两个元件两端也引入了相应的酶切位点，这两个元件最后分别导入pCambia的多克隆位点，形成CaMV35S：：MCS：：NOS单元。该植物表达载体含有1套2×CaMV35S启动子控制NPTII基因的植物表达元件、1套CaMV35S启动子控制报告基因GRP-GusPlus-His6的植物表达元件和一套CaMV35S启动子控制目标基因的植物表达元件，可实现Kan和GUS活性的双标记筛选。在多克隆位点(Multiple cloning site，MCS)插入外源基因，可以实现外源基因的超量表达。

为了在转基因植物中超量表达GhLFHE3基因，需要将GhLFHE3基因正向插入植物表达载体中，并用适当的启动子启动表达。为此根据pGEm-GhLFHE3载体上的酶切位点和GhLFHE3的插入方向以及改造的pCambia植物表达载体上的多克隆位点和CaMV35S启动子的方向，构建了超量表达GhLFHE3基因植物表达载体pCambia-35S-GhLFHE3-NOS(简称S-GhLFHE3)(图6)和反义抑制GhLFHE3基因的植物表达载体pCambia-35S-反义GhLFHE3-NOS(简称A-GhLFHE3)(图7)。

实施例4

棉花的遗传转化

用电激法将构建的植物表达载体质粒导入农杆菌LBA4404菌株并进行棉花遗传转化。

参考Bio-RAD MicroPulser用户说明书,将上述载体通过电激转化法导入农杆菌LBA4404菌株。

上述的植物表达载体通过农杆菌介导棉花下胚轴转化方法导入棉花。具体方法如下：

冀棉14种子剥去外壳，用0.1％的升汞(HgCl2)灭菌10min，用大量无菌水冲洗8次。在125ml三角瓶中加入约35ml无菌水震荡过夜，次日换一次无菌水。当种子长出下胚轴根后，播种于种子萌发培养基上，在28℃，黑暗条件下萌发2-3d，此时种子下胚轴开始进入快速伸长的时期，适宜进行遗传转化。

转化用的含pCambia-35S-GhLFHE3-NOS和pCambia-35S-反义GhLFHE3-NOS植物表达载体的农杆菌菌株在含50mg/L Km和125mg/L Sm的YEB固体培养基上活化。挑取其单菌落，接种于5ml含相同抗生素的YEB液体培养基中，28℃、200r/min震荡培养过夜。培养后的农杆菌菌液按1：20的比例转接到25ml含相同抗生素的YEB液体培养基中，继续培养至OD600值约为0.6-0.8，10,000r/min、1min离心收集菌体，菌体用等体积的液体共培养基重悬备用。

转化时，将棉花下胚轴切成1.5-2.0cm的小段，放入三角瓶中用制备好的农杆菌菌液侵染，条件为28℃摇床120r/min侵染30min。然后吸干菌液，将下胚轴段转到共培养基上，28℃暗培养2-3天。

共培养后，下胚轴段转入到下胚段筛选培养基，28℃光照培养，约20天继代一次，直到出现大量愈伤组织。愈伤组织连同下胚段转移到胚性愈伤诱导培养基，约15天继代一次，直到出现大量的浅黄色胚性愈伤。胚性愈伤挑到胚性愈伤悬浮培养基中，28℃、120r/min摇床培养一周左右。用减去尖头的1.0mL枪头吸取细沙状的体胚平铺于体胚伸长培养基，20-30天后出现大量的绿色小体胚。挑取生长状态良好的体胚继代培养，待体胚伸长到1-2cm时，将其转移到成苗培养基生根出苗。幼苗生长到3-5cm高时，通过嫁接或者移栽的方式转移到温室花钵中生长。其中，本实验例中所用的培养基如表1所示。

表1:根癌农杆菌介导的棉花下胚轴遗传转化所用培养基

MS:Murashige&Skoog,1962

B5:Gamborg,1986

实施例5

1、组织化学鉴定

由于构建的植物表达载体中具有一套CaMV35S启动子控制报告基因GRP-GusPlus-His6的植物表达元件，因此可以利用组织化学法鉴定是否是转化植株。待转化植株在生根培养基上生根并长到5-8cm时，将幼苗从培养瓶中取出洗净，转入三角瓶上水培炼苗2～3d。同时，取一小块叶片和一小段根进行GUS染色。结果如图8A和图10A所示，野生型叶片GUS染色为阴性，抗性植株叶片GUS染色为阳性，阳性植株直接移栽到营养钵中。

2、扩增验证

待棉花植株移栽成活并生长到一定大小，取0.5g叶片提取棉花基因组DNA，以CaMV35S启动子的上游引物35S(SEQ ID NO.8)和GhLFHE3基因的3'端引物GhLFHE3-2(SEQID NO.5)扩增超量表达转基因棉花；以CaMV35S启动子的上游引物35S(SEQ ID NO.8)和GhLFHE3基因的5'端引物GhLFHE3-1(SEQ ID NO.4)扩增反义抑制的转基因棉花。25μL的扩增体系含2.5μL 10×PCR buffer，2μL 2.5mmol/L dNTPs，1.5μL 25mmol/L MgCl2，各1μL引物GUS-1和GUS-2(5μmol/L)，1U Taq DNA聚合酶，1μL基因组DNA(50ng)。扩增程序为：94℃，5min；94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，2.5min，35个循环；72℃延伸10min。用正反植物表达载体质粒作阳性对照，以水作空白，以野生型棉花基因组DNA作阴性对照。结果显示GUS染色阳性的转基因棉花植株都能扩增出一条与阳性对照一致的带，说明植物表达载体的T-DNA区段已经整合到转基因棉花基因组中(图8B和图10B)。

实施例6

检测GhLFHE3基因在转基因棉花中的表达变化

按照实施例一中提取棉花RNA的方法，提取转基因棉花和野生型棉花叶片的总RNA，并合成cDNA一链。用Real-Time PCR方法分析转基因棉花中目的基因的表达，PCR在实时定量PCR仪上进行，在25μL的反应体系中包括12.5μL MIX buffer(包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs和MgCl2，实时定量RT-PCR试剂盒提供，Bio-Rad)。GhLFHE3基因用引物GhLFHE3-e1(SEQ ID NO.6)和GhLFHE3-e2(SEQ ID NO.7)扩增，内标采用棉花GhHISTONE3(GenBank登录号：AF024716)，引物为GhHIS-1和GhHIS-2。扩增程序为：94℃预变性3min；94℃，30sec；56℃，30sec；72℃，30sec；预设循环数为35。在运行实时定量PCR前，用相同引物和模板在相同的温度变化程序中扩增一次，通过扩增产物的电泳，确保扩增产物是单带。实时定量RT-PCR分析的结果表明GhLFHE3基因在超量表达GhLFHE3植株中的表达水平比对照高(图8C)，相反在抑制该基因转基因棉花中的表达水平比对照低(图10C)。这结果说明已获得超量表达和反义抑制GhLFHE3的转基因棉花植株。

实施例7

1、超量表达GhLFHE3基因促进棉花纤维伸长

转基因棉花和对照同时栽种到试验田，进行正常的生产管理，观察棉花纤维的生长发育和比较成熟纤维的长度。当棉花纤维成熟后，用梳子梳理同时期同部位的棉花纤维，然后再用直尺测量纤维的长度(图9)。结果显示，S-GhLFHE3纤维的平均长度达到了33.30±0.74mm，而对照的纤维的平均长度为29.20±0.42mm，纤维长度增加了14.04％(图8)。

这些结果说明：增加GhLFHE3基因的表达水平促进了棉花纤维的伸长，该基因在棉花纤维细胞发育中具有重要作用，特别是对纤维细胞的伸长，是利用基因工程改良纤维品质的有效基因。

2、抑制GhLFHE3基因表达阻碍棉花纤维伸长

为了确定GhLFHE3基因在棉花纤维发育中的作用，将反义抑制GhLFHE3的转基因棉花和对照同时栽种到试验田，进行正常的生产管理，观测棉花纤维的生长发育和比较成熟纤维的长度。结果显示：A-GhLFHE3纤维的平均长度为24.30mm，而对照的纤维的平均长度为29.20±0.42mm，纤维长度比对照纤维减少16.78％(图8)。这结果进一步说明GhLFHE3基因在纤维细胞伸长过程中具有重要作用，其表达水平与纤维长度有密切关系。

3、抑制GhLFHE3基因表达降低棉花对铝毒害的耐受性

异源表达GhLFHE3基因会增加酵母对铝的耐受性，为了进一步探究反义抑制GhLFHE3转基因棉花对铝胁迫的反应，将反义抑制GhLFHE3转基因棉花进行铝胁迫实验。取适量种子，在滤纸上萌发，待种子长出合适长度的下胚轴进行水培，用50μM的AlCl3处理，20天后观察并统计性状变化。结果显示(图9)对照组A-GhLFHE3棉花与野生型的根无明显差异，而实验组A-GhLFHE3棉花比野生型的根明显减少且变短，另外发现铝处理的A-GhLFHE3棉花叶片变小，且下胚轴和上胚轴分别有不同程度的变短。说明反义抑制该基因使植株对铝胁迫更敏感。

其中，本发明实例中的试剂药品未做具体说明的均为普通市售,材料方法未做具体说明的均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell,2001)。

在本发明的上述实例中，所用的棉花实验材料为冀棉14(Gossypium hirsutumcv.Jimian14)，TM-1(Gossypium hirsutum cv.TM-1)及其超短纤维突变体(ligonlintless-1,li-1)。li-1突变体种子播种后，将分离出其野生型(TM-1)。以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 西南大学

<120> 棉花长纤维高表达基因GhLFHE3及其转基因棉花制备方法和应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1541

<212> DNA

<213> 人工序列(1)

<400> 1

ttccattctc caccacattc aaaccccata aaagaaaacc cccttttttt tctccatttc 60

tcactaaaaa gattatatct ttttgtatat tttttgttag ctttcatttc attggagcat 120

caatggcgga ttcaaagagg tacatttcca aaacagagtt tgaaacccac aaaaaaccag 180

atgatctttg gatctcaatc caaggcaaga tctataatgt aactcaatgg agtcaccacc 240

accctggtgg gccacttcca ttactgaacc tcgccggtca agacgccacc gatgctttca 300

tagcttatca tcccggcata gcttggcaat atctcgacaa gttcttcact ggttattacc 360

ttgaaggtta cttagtctct gatatatccg aagattatag aaagctagct gttgagttct 420

caaagatggg tcttttcgac aagaaaggac acgggacatg tattttactt accatcatag 480

cattgctgtt tttcacttgt gtttatggtg ttttatgttg tgacaaaact tgggttcatc 540

tctgttgtgg tgggttaatg gggtttttat ggatacagag tggttggata gggcatgatt 600

caggacatta cactgtcatg tctaataaaa acctcaacag gttggctcaa cttcttacag 660

ggaattgtct tgctgggatc agcatgggat ggtggaaatg gacacataat gctcaccata 720

ttgcctgtaa cagcttagat tttgatccag accttcaaca catgcctttc ttcacggtat 780

cttcaaagtt ctttaattca atcacatctg cattttacgg tagaaaactg aactttgatt 840

ctcttacaag gcttttagtt agttaccaac attgcacatt ttaccctgtc atgtgctttg 900

ctaggatcaa cctatttgct caatctatca tcttgttgtt gtctaaaaga aaagtcccta 960

acaaaggtca agaaattttt gggatacttg ttttttggac atggtatcca ttactcgtct 1020

ctttcttacc taattggtac gaaagagtaa tgtttgtggt tgtaagtttt gctgtgaccg 1080

gtatccaaca tgttcagttc tgtttgaacc atttctcgtc gagtgtttac gtcggcccgc 1140

cgaacgggaa tgattggttc gagaaacaaa ccgacgggac gcttaatata ttgtgttcgt 1200

cttggatgga ttggttctat ggtgggttgc aattccaagt tgagcatcat ttgttcccga 1260

ggttgcctag gtgccattta cggacaattt caccatttgt taaggagttg tgtaagaaac 1320

acaatttggc ttacaattgt gcttcttttt ggaaagctaa tgcaatgaca attgagacgc 1380

ttaaatcagc tgcattacaa gctagggttc ttaccaatgc tgttccaaag aacttggtgt 1440

gggaagctgt caacacacat gggtgacaac tattttatga atatgcttat tattattatt 1500

attattgcca taaatttttt tgtctgtcat gttgacatcc a 1541

<210> 2

<211> 1541

<212> DNA

<213> 人工序列(2)

<400> 2

ttccattctc caccacattc aaaccccata aaagaaaacc cccttttttt tctccatttc 60

tcactaaaaa gattatatct ttttgtatat tttttgttag ctttcatttc attggagcat 120

caatggcgga ttcaaagagg tacatttcca aaacagagtt tgaaacccac aaaaaaccag 180

atgatctttg gatctcaatc caaggcaaga tctataatgt aactcaatgg agtcaccacc 240

accctggtgg gccacttcca ttactgaacc tcgccggtca agacgccacc gatgctttca 300

tagcttatca tcccggcata gcttggcaat atctcgacaa gttcttcact ggttattacc 360

ttgaaggtta cttagtctct gatatatccg aagattatag aaagctagct gttgagttct 420

caaagatggg tcttttcgac aagaaaggac acgggacatg tattttactt accatcatag 480

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ggttgcctag gtgccattta cggacaattt caccatttgt taaggagttg tgtaagaaac 1320

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gggaagctgt caacacacat gggtgacaac tattttatga atatgcttat tattattatt 1500

attattgcca taaatttttt tgtctgtcat gttgacatcc a 1541

<210> 3

<211> 447

<212> PRT

<213> 氨基酸序列(3)

<400> 3

Met Ala Asp Ser Lys Arg Tyr Ile Ser Lys Thr Glu Phe Glu Thr His

1 5 10 15

Lys Lys Pro Asp Asp Leu Trp Ile Ser Ile Gln Gly Lys Ile Tyr Asn

20 25 30

Val Thr Gln Trp Ser His His His Pro Gly Gly Pro Leu Pro Leu Leu

35 40 45

Asn Leu Ala Gly Gln Asp Ala Thr Asp Ala Phe Ile Ala Tyr His Pro

50 55 60

Gly Ile Ala Trp Gln Tyr Leu Asp Lys Phe Phe Thr Gly Tyr Tyr Leu

65 70 75 80

Glu Gly Tyr Leu Val Ser Asp Ile Ser Glu Asp Tyr Arg Lys Leu Ala

85 90 95

Val Glu Phe Ser Lys Met Gly Leu Phe Asp Lys Lys Gly His Gly Thr

100 105 110

Cys Ile Leu Leu Thr Ile Ile Ala Leu Leu Phe Phe Thr Cys Val Tyr

115 120 125

Gly Val Leu Cys Cys Asp Lys Thr Trp Val His Leu Cys Cys Gly Gly

130 135 140

Leu Met Gly Phe Leu Trp Ile Gln Ser Gly Trp Ile Gly His Asp Ser

145 150 155 160

Gly His Tyr Thr Val Met Ser Asn Lys Asn Leu Asn Arg Leu Ala Gln

165 170 175

Leu Leu Thr Gly Asn Cys Leu Ala Gly Ile Ser Met Gly Trp Trp Lys

180 185 190

Trp Thr His Asn Ala His His Ile Ala Cys Asn Ser Leu Asp Phe Asp

195 200 205

Pro Asp Leu Gln His Met Pro Phe Phe Thr Val Ser Ser Lys Phe Phe

210 215 220

Asn Ser Ile Thr Ser Ala Phe Tyr Gly Arg Lys Leu Asn Phe Asp Ser

225 230 235 240

Leu Thr Arg Leu Leu Val Ser Tyr Gln His Cys Thr Phe Tyr Pro Val

245 250 255

Met Cys Phe Ala Arg Ile Asn Leu Phe Ala Gln Ser Ile Ile Leu Leu

260 265 270

Leu Ser Lys Arg Lys Val Pro Asn Lys Gly Gln Glu Ile Phe Gly Ile

275 280 285

Leu Val Phe Trp Thr Trp Tyr Pro Leu Leu Val Ser Phe Leu Pro Asn

290 295 300

Trp Tyr Glu Arg Val Met Phe Val Val Val Ser Phe Ala Val Thr Gly

305 310 315 320

Ile Gln His Val Gln Phe Cys Leu Asn His Phe Ser Ser Ser Val Tyr

325 330 335

Val Gly Pro Pro Asn Gly Asn Asp Trp Phe Glu Lys Gln Thr Asp Gly

340 345 350

Thr Leu Asn Ile Leu Cys Ser Ser Trp Met Asp Trp Phe Tyr Gly Gly

355 360 365

Leu Gln Phe Gln Val Glu His His Leu Phe Pro Arg Leu Pro Arg Cys

370 375 380

His Leu Arg Thr Ile Ser Pro Phe Val Lys Glu Leu Cys Lys Lys His

385 390 395 400

Asn Leu Ala Tyr Asn Cys Ala Ser Phe Trp Lys Ala Asn Ala Met Thr

405 410 415

Ile Glu Thr Leu Lys Ser Ala Ala Leu Gln Ala Arg Val Leu Thr Asn

420 425 430

Ala Val Pro Lys Asn Leu Val Trp Glu Ala Val Asn Thr His Gly

435 440 445

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(4)

<400> 4

ttccattctc caccacattc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(5)

<400> 5

tggatgtcaa catgacagac 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(6)

<400> 6

catagcttgg caatatctcg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(7)

<400> 7

gacatgacag tgtaatgtcc 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(8)

<400> 8

acgacaggac acaccctctt g 21

Claims

1.棉花长纤维高表达基因GhLFHE3，其特征在于，GhLFHE3基因的cDNA核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的棉花长纤维高表达基因GhLFHE3，其特征在于，GhLFHE3基因的gDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1或2所述的棉花长纤维高表达基因GhLFHE3，其特征在于，GhLFHE3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.棉花长纤维高表达基因GhLFHE3的表达载体，其特征在于，表达载体包括权利要求1-3任一所述的GhLFHE3基因和启动子序列。

5.含有棉花长纤维高表达基因GhLFHE3的转基因棉花的制备方法，包括权利要求1-4任一所述的GhLFHE3基因，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将基因GhLFHE3与启动子连接，导入植物表达载体，构建得到重组载体；

（2）用重组载体转化宿主，得到转化体；

（3）用转化体转化棉花，得到转基因棉花。

6.根据权利要求5所述的含有棉花长纤维高表达基因GhLFHE3的转基因棉花的制备方法，其特征在于，步骤（1）中表达载体的出发载体为双元农杆菌载体或可用于微弹轰击的载体。

7.根据权利要求5所述的含有棉花长纤维高表达基因GhLFHE3的转基因棉花的制备方法，其特征在于，步骤（2）中表达载体中包含筛选基因序列、报告基因序列、GUS基因中的一种或多种。

8.根据权利要求5所述的含有棉花长纤维高表达基因GhLFHE3的转基因棉花的制备方法，其特征在于，步骤（1）中启动子为CaMV35S启动子。

9.权利要求1-3任一所述的基因GhLFHE3、权利要求4所述的表达载体以及权利要求5-8任一所述的制备方法在提高棉花纤维品质和耐铝毒性中的应用。