CN111004807A

CN111004807A - 一种棉花纤维特异表达基因GhFSE1及其应用

Info

Publication number: CN111004807A
Application number: CN201911203879.9A
Authority: CN
Inventors: 罗明; 锁晓栋; 牛琪; 包朝亚; 何昇阳; 徐凡; 肖月华
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2019-11-29
Filing date: 2019-11-29
Publication date: 2020-04-14

Abstract

本发明提供了一个新的棉花纤维特异表达基因GhFSE1及其应用，所述GhFSE1基因的cDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明将所述棉花纤维特异表达基因GhFSE1构建植物表达载体，将所述植物表达载体转化宿主，进一步转化棉花，获得转基因棉花。本发明提供的棉花纤维特异表达基因GhFSE1具有促进棉花纤维伸长的作用，能用于提高纤维品质和棉花产量。

Description

一种棉花纤维特异表达基因GhFSE1及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种棉花纤维特异表达基因GhFSE1及其编码的蛋白质和应用。

背景技术

棉花是世界上主要的纤维作物之一。棉花纤维细胞是棉花胚珠外珠被表皮细胞经分化突起和极性伸长而成的单细胞。其生长发育过程分为四个既明显区分又有所重叠的时期：纤维细胞起始期、纤维细胞伸长期、次生壁增厚期和脱水成熟期。每个时期都有各自的特点，但相邻发育时期又有所重叠。纤维发育的每个时期对纤维的产量和/或品质都有影响，纤维的分化起始决定了单粒胚珠中纤维的数量，纤维细胞伸长速率和持续时间主要决定了纤维的长度，同时也影响纤维产量。次生壁沉积的方式和持续时间主要决定了成熟纤维的强度和次生壁厚度。纤维伸长期是(初生壁合成期)从开花当天开始，可以持续到开花后25天(25DPA)，主要进行细胞极性伸长和初生细胞壁的合成，这时期的纤维伸长速率和持续时间决定纤维的最终长度，陆地棉纤维长径比可达1000～3000。但迄今为止，我们对调控纤维伸长的有效基因仍知之甚少。鞘脂(sphingolipids)是含有长链鞘样碱基骨架的一类结构复杂的脂类分子，它广泛存在于真核生物中。动物、植物和真菌细胞中约有300～400个不同种类的鞘脂分子(Hannun YA,Luberto C(2000).Ceramide inthe eukaryotic stressresponse.Trends Cell Biol 10,73-80.)。鞘脂不仅是生物膜结构的重要成分，也是重要的生物活性分子。鞘脂是生物膜上脂筏的主要组成成分，而脂筏是生物膜的重要部位和性质调控中心。不同种类的鞘脂存在于不同组织中，甚至是同一组织的不同细胞类型中。哺乳动物中主要是鞘磷脂以及中性和酸性的糖脂(Lester RL,Dickson RC(1993).Sphingolipids with inositolphosphate-containing head groups.Adv Lip Res 26,253-274.)，真菌和植物组织中主要是葡萄糖神经酰胺(Sakaki T,

U，Warnecke DC,Fahl A,Knogge WH,Heinz E(2001).Sterol glycosides and cerebrosidesaccumulate in Pi chia pas tori s,Rhynchosporium sec alis and other fungiunder normal conditions or under heat shock and ethanol stress.Yeast 18,679-695；Lynch DV,Dunn TM(2004).An introduction to plant sphingolipids and areview of recent advances in understanding their metabolism and function.NewPhytol 161,677-702.)。

鞘脂在动物和真菌中的功能较为清楚，但鞘脂在植物生长发育中的功能还远未清楚，仅认为植物鞘脂在细胞信号、膜稳定性、生物和非生物胁迫响应和细胞程序性凋亡中具有重要作用。研究报道：鞘氨醇-1-磷酸参与拟南芥保卫细胞中干旱诱导的信号转导，且与脱落酸引起的细胞膨胀的还原有关；鞘氨醇-1-磷酸可以调节拟南芥保卫细胞膨压，促使Ca²⁺介导的保卫细胞关闭，同时抑制质膜内部K⁺通道和慢性阴离子通道的活动(Ng CK,Hethe rington AM(2001).Sphingolipid-mediated signaling in plants.Ann Bot 88,957-965；Sylvie C,He rve LS,Lynch DV,Simon G,Sar ah M(2005).Assmann andsarahspiegel.Arabidopsis sphingosine kinase and the effects ofphytosphingosine-1-phosphate on stomatal aperture.Plant Physi ol 137,724-737.)。低浓度的鞘氨醇刺激细胞生长，高浓度的鞘氨醇则对细胞有毒害作用(Lynch DV,Dunn TM(2004).An introduction to plant sphingolipids and a review of recentadvances in understanding their metabolism and function.New Phytol 161,677-702.)。鞘脂分子通过增强植物质膜和液泡膜的稳定性来促进植物对各种逆境(干旱、重金属、低温)的忍耐或适应(Dunn TM,Lynch DV,Michaels on LV,Napie r JA(2004).A post-genomic approach to understanding sphingolipid metabolism in Arabidopsisthaliana.Ann Bot 93,483-497.)。在干旱胁迫时，鸭跖草(Commelina communis)表皮细胞内鞘氨醇-1-磷酸浓度增加，从而增强Ca²⁺的流动性，改变保卫细胞膨压，进而促使保卫细胞关闭，以缓解干旱逆境对植物的伤害(Ng CK,Carr K,McAinsh MR,Powell B,Hetherington AM(2001).Drought-induced guard cell signal transduction involvessphingosine-1-phosphate.Nature 410,596-599.)。这些研究初步揭示了鞘脂在植物生长发育中具有重要作用，但是鞘脂是否能促进植物细胞伸长还没有任何报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能促进棉花纤维伸长的棉花纤维特异表达基因GhFSE1(Long Fiber High Expression 2)及其编码的蛋白和应用。

本发明提供了一种棉花纤维特异表达基因GhFSE1，所述GhFSE1的cDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

优选的，所述GhFSE1的gDNA核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明提供了上述棉花纤维特异表达基因GhFSE1编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明还提供了上述棉花纤维特异表达基因GhFSE1的扩增引物对，其中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示

本发明提供了一种表达载体，所述表达载体含有上述棉花纤维特异表达基因GhFSE1和启动子，所述启动子包括增强型、组成型、组织特异性和诱导型中的任意一种或多种。

优选的，所述表达载体的T-DNA区段内有三套表达元件，第一套由启动子控制GhFSE1基因正向序列，终止子为NOS终止子；第二套由组成型启动子35S控制筛选基因正向序列，终止子为NOS终止子；第三套由组成型启动子35S控制报告基因正向序列，终止子为NOS终止子。

更优选的，所述表达载体的T-DNA区段内有3套表达元件，第一套由组成型启动子35S控制GhFSE1基因正向序列，终止子为NOS终止子；第二套由组成型启动子35S控制NPTII基因正向序列，终止子为NOS终止子；第三套由组成型启动子35S控制GUS基因正向序列，终止子为NOS终止子。

本发明提供了一种转化体，所述转化体由上述表达载体转化宿主获得。

本发明提供了上述棉花纤维特异表达基因GhFSE1、蛋白质、表达载体或转化体在提高棉花纤维质品质和/或增加棉花纤维产量中的应用。

本发明也提供一种提高棉花纤维品质和/或增加棉花纤维产量的方法，通过在目标棉花植株中超量表达上述棉花纤维特异表达基因GhFSE1，而促进棉花纤维伸长，用于提高纤维品质和棉花产量。

上述提高棉花纤维品质和/或增加棉花纤维产量的方法可以通过制备含有棉花纤维特异表达基因GhFSE1的转基因棉花而实现，具体的制备方法，包含如下步骤：

1)将棉花纤维特异表达基因GhFSE1与启动子连接，导入植物表达载体，构建得到重组载体；

2)用所述重组载体转化宿主，获得转化体；

3)用所述转化体转化棉花，获得转基因棉花。

有益效果：本发明提供了一种棉花纤维特异表达基因GhFSE1，所述GhFSE1的cDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明将所述棉花纤维特异表达基因GhFSE1构建植物表达载体，将所述植物表达载体转化宿主，进一步转化棉花，获得转基因棉花。实验证明：本发明提供的棉花纤维特异表达基因GhFSE1具有促进棉花纤维伸长的作用，能用于提高纤维品质和棉花产量。

附图说明

图1为GhFSE1基因在棉花不同组织器官的表达情况；其中O-8代表开花后8天的胚珠；F-8代表开花后8天的纤维细胞。

图2为GhFSE1蛋白质与其他物种相关蛋白质的同源性比较结果；其中，AtTSC10A代表拟南芥(Arabidopsis thaliana)3-酮基二氢鞘氨醇还原酶A(At3g06060)；AtTSCI0B代表拟南芥(Arabidopsis thaliana)3-酮基二氢鞘氨醇还原酶B(At5g19200)；TcKDSR代表可可(Theobroma cacao)3-酮基二氢鞘氨醇还原酶(XP_007031800)；KDSR保守结构域是3-酮基二氢鞘氨醇还原酶氨基酸序列中的保守氨基酸序列；催化三联体氨基酸是3-酮基二氢鞘氨醇还原酶具有催化活性的保守氨基酸残基。

图3为GhFSE1基因在TM-1和超短纤维突变体li-1纤维和胚珠中的表达情况；其中F-10DPA(TM-1)代表陆地棉野生型棉花(TM-1)开花后10天的纤维；F-10DPA(li-1)代表li-1突变体开花后10天的纤维；O-10DPA(TM-1)代表野生型棉花(TM-1)开花后10天的胚珠；O-10DPA(li-1)代表li-1突变体开花后10天的胚珠；FO-0DPA(TM-1)代表野生型棉花(TM-1)开花当天的胚珠和纤维细胞；FO-0DPA(li-1)代表li-1突变体开花当天的胚珠和纤维细胞。

图4为GhFSE1基因在纤维细胞和胚珠不同发育时期的表达水平；其中FO-0DPA～FO-4DPA分别指开花当天至开花后4天的胚珠纤维；F-6DPA～F-18DPA:分别指开花后6天至16天的纤维细胞；O-6DPA～O-18DPA分别指开花后6天至18天的胚珠；

图5为含GhFSE1基因的植物表达载体的结构图；其中35S代表CaMV35S启动子；GhFSE1代表GhFSE1基因cDNA；term代表终止子；LB代表T-DNA左边界；RB代表T-DNA右边界；

图6为植物表达载体pCambia-35S-GhFSE1-NOS结构图；其中GRP-GusPlus-His6代表GUSPlus报告基因，该基因在N端融合了GRP信号肽，在C端融合了His6序列标签；NPTII代表新霉素磷酸转移酶基因，具有卡拉霉素抗性；term代表Nos终止子；CaMV 35S代表来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；LB代表T-DNA左边界；RB代表T-DNA右边界；植物表达载体为实施例3所述改造的pCambia载体；

图7为反义抑制GhFSE1基因植物表达载体pCambia-35S-antisenseGhFSE1-NOS结构图；其中GRP-GusPlus-His6代表GUSPlus报告基因，该基因在N端融合了GRP信号肽，在C端融合了His6序列标签；NPTII代表新霉素磷酸转移酶基因，具有卡拉霉素抗性；term代表Nos终止子；CaMV 35S代表来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；LB代表T-DNA左边界；RB代表T-DNA右边界；植物表达载体为实施例3所述改造的pCambia载体；

图8为转基因棉花的鉴定结果；其中，图8-A为转基因棉花的组织化学鉴定结果，Control代表非转基因棉花(野生型)，作对照；OE-1和OE-2分别代表超量表达GhFSE1转基因棉花1#和2#；SE-1和SE-2分别代表抑制GhFSE1表达的转基因棉花1#和2#；图8-B为超量表达GhFSE1转基因棉花的扩增验证结果，M组为DNA marker；P组以pCambia-35S-GhFSE1-NOS质粒为PCR扩增模板，作阳性对照；N组为非转基因棉花(野生型)，作阴性对照；W组以水为PCR扩增模板，作空白对照；OE1～OE4代表超量表达GhFSE1的转基因棉花的不同株系；图8-C为反义抑制GhFSE1转基因棉花的扩增验证结果，M组为DNAmarker；P组以pCambia-35S-antisenseGhFSE1-NOS质粒为PCR扩增模板，作阳性对照；N组为非转基因棉花(野生型)，作阴性对照；W组以水为PCR扩增模板，作空白对照；SE1和SE2分别代表反义抑制GhFSE1表达的转基因棉花不同株系。

图9为转基因棉花中GhFSE1基因的表达分析结果；其中，Control代表非转基因棉花(野生型)；OE1和OE2分别代表超量表达GhFSE1转基因棉花1#和2#。SE1和SE2分别代表反义抑制GhFSE1转基因棉花1#和2#；

图10为超量表达和抑制GhFSE1基因表达的转基因棉花纤维长度的变化情况；其中，Control代表非转基因棉花(野生型)；OE1代表超量表达GhFSE1转基因棉花1#株系。SE1代表反义抑制GhFSE1转基因棉花1#株系。

图11为超量表达和抑制GhFSE1基因表达的转基因棉花纤维长度统计结果；其中，Control代表非转基因棉花(野生型)；OE1和OE2分别代表超量表达GhFSE1转基因棉花1#和2#；SE1和SE2分别代表反义抑制GhFSE1转基因棉花1#和2#；“**”表示与WT组差异极显著(P＜0.01)，用t测验计算显著性差异；

具体实施方式

本发明提供了一种能促进棉花纤维伸长的棉花纤维特异表达基因GhFSE1及其编码的蛋白质和应用。

在本发明中，所述GhFSE1基因与拟南芥3-酮基二氢鞘氨醇还原酶基因具有较高的同源性，不仅在纤维细胞快速伸长期优势表达，而且在超短纤维突变体li-1的短纤维细胞中表达降低。在本发明中，所述GhFSE1基因的cDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，长度987bp。所述GhFSE1的gDNA核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，长度1325bp。在本发明中，所述GhFSE1基因具有促进棉花纤维伸长的作用，能用于提高纤维品质和产量。

本发明提供了上述棉花纤维特异表达基因GhFSE1编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。所述GhFSE1编码的蛋白质在棉花纤维细胞的快速伸长期表达增多，具有促进棉花纤维细胞伸长的作用。

本发明还提供了上述棉花纤维特异表达基因GhFSE1的扩增引物对，其中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。以SEQID No.1所示核苷酸序列的cDNA链为模板，利用本发明提供的引物对能实现对模板的PCR扩增。在本发明中，所述PCR扩增优选采用20μL的反应体系，所述反应体系优选包括10μL的MIX缓冲液(包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs和MgCl₂)，5'-端和3'-端表达引物各1μL(5μmol/L)，10DPA纤维细胞的cDNA1μL和双蒸水7μL。所述PCR的扩增程序优选为：94℃预变性3min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，30s，预设循环数为30。

本发明提供了一种植物表达载体，所述植物表达载体含有上述棉花纤维特异表达基因GhFSE1和启动子。在本发明中，所述启动子优选包括增强型、组成型、组织特异性和诱导型中的一种或多种。在本发明中，所述表达载体优选具有如图5所示的结构：T-DNA区段内有三套表达元件，第一套由启动子控制GhFSE1基因正向序列，终止子为NOS终止子；第二套由组成型启动子35S控制筛选基因正向序列，终止子为NOS终止子，为转基因植物细胞提供可供筛选的抗性；第三套由组成型启动子35S控制报告基因正向序列，终止子为NOS终止子，为转基因植物材料提供相对更方便的检测方法。进一步优选的，所述表达载体具有如图6所示的结构：T-DNA区段内有3套表达元件，第一套由组成型启动子35S控制GhFSE1基因正向序列，终止子为NOS终止子；第二套由组成型启动子35S控制NPTII基因正向序列，终止子为NOS终止子，为转基因植物细胞提供卡拉霉素抗性；第三套由组成型启动子35S控制GUS基因正向序列，终止子为NOS终止子。

在本发明的实施例中，所述表达载体通过如下步骤构建得到：

②10DPA纤维细胞cDNA中扩增获得GhFSE1基因的cDNA序列；

②对所述cDNA序列进行测序，确定该序列长度为987bp，包含一个长987bp的开放阅读框，明确该序列在克隆载体pEASY-GhFSE1上的方向；

③用DNA限制性内切酶酶切pEASY-GhFSE1载体，回收外源片段，同时酶切改造的pCambia植物表达载体，回收载体片段，将回收的外源片段和载体片段连接，分别构建成超量表达GhFSE1基因和反义抑制GhFSE1基因的植物表达载体pC-GhFSE1和pC-AGhFSE1。

本发明提供了一种转化体，所述转化体由上述表达载体转化宿主获得。在本发明中，所述宿主优选为大肠杆菌或农杆菌。本发明对所述转化体的制备方法不作特别限定，本领域常规操作即可。

本发明还提供了上述棉花纤维特异表达基因GhFSE1、蛋白质、表达载体或转化体在提高棉花纤维质品质和/或增加棉花纤维产量中的应用。在本发明中，所述应用优选包括将所述棉花纤维特异表达基因GhFSE1导入植物体进行表达。

本发明提供了一种含有棉花纤维特异表达基因GhFSE1的转基因棉花的制备方法，包含如下步骤：

2)用所述重组载体转化宿主，获得转化体；

3)用所述转化体转化棉花，获得转基因棉花。

本发明对所述步骤(1)中连接、构建的方法不作特别限定，按照本发明所公开的启动子类型和基因连接顺序，依据本领域常规技术手段将各结构连接到一起即可。本发明对所述步骤(2)或步骤(3)中转化的具体操作不做特别限定，本领域常规用于转化宿主或植物体的操作步骤均可。

下面结合实施例对本发明提供的一种棉花纤维特异表达基因GhFSE1及其编码的蛋白质和应用进行详细的说明，但以下说明并不对本发明进行限定，任何对本发明的变形和改变，只要不脱离本发明的构思，均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。

本发明实例中的试剂药品未做具体说明的均为普通市售，材料方法未做具体说明的均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell,2001)。

在本发明的下述实例中，所用的棉花实验材料为冀棉14(Gossypiumhirsutumcv.Jimian14)，来源于河北农业大学，冀棉14是1988年通过河北省农作物品种审定，在上世纪90年代生产上广泛种植的棉花栽培品种。所用超短纤维突变体(ligonlintless-1,li-1)材料来源于中国农业科学院棉花研究所，其野生型是TM-1(Gossypiumhirsutum cv.TM-1)，从每次播种的li-1突变体种子中分离出来，由于li-1突变体的突变基因纯合致死，因此每次能收获的突变体种子都是杂合型，部分种子所含胚是野生型，li-1突变体种子播种后，一部分长成野生型棉花(TM-1)，一部分为li-1突变体。

其他材料没有特别说明的均为商业购买。

实施例1

GhFSE1基因表达分析和基因序列的克隆

(1)棉花RNA的提取

棉花各种样品总RNA提取使用“EASYspin植物RNA快速提取试剂盒”(北京艾德莱生物科技有限公司)，取新鲜样品材料100mg，在液氮中研磨后转入1.5mL离心管中，加入1mLRLT和100μL PLANTaid，剧烈摇晃振荡15s，13000rmp离心10min；取上清，加入1/2体积的无水乙醇，混匀后转入到吸附柱RA中，13000rpm离心2min，弃流出液；在吸附柱RA中加入700μL去蛋白液RW1，室温放置1min，13000rpm离心30s，弃流出液；加入500μL漂洗液RW(用前按要求加入无水乙醇)，13000rpm离心30s，弃流出液，然后重复1遍；将吸附柱RA放回空收集管中，13000rpm离心2min，除尽漂洗液；取出吸附柱RA，放入一个无RNA酶离心管中，加入50μL无RNA酶水，室温放置1min，12000rpm离心1min。用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量。

(2)cDNA合成

提取棉花各种样品总RNA，用试剂盒(Fermentas)合成cDNA一链。具体方法为：取约10μg总RNA到DEPC-处理的扩增管中，加入1μL 2.5μmol/L Oligo-dT，加DEPC处理的水至终体积12μL，70℃水浴5min使RNA变性后，立即冰浴3min。然后向扩增管中依次加入4μL 5×reaction buffer，2μL 10mmol/L dNTPs，1μL RNase inhibitor(20U)，37℃处理5min。加入1μL AMV Rtase(5U)后，保温程序为42℃，60min；70℃，5min；5℃，5min。程序结束后，一链产物于-20℃冻存。

(3)筛选陆地棉中同源性较高的基因序列

以拟南芥鞘脂合成酶的蛋白质序列搜索陆地棉基因组数据库(https://cottonfgd.org/)。检测到5个与拟南芥3-酮基二氢鞘氨醇还原酶(TSC10)具有一定同源性的基因，其中一个基因编号为Gh_A05G3816。根据该基因序列设计表达引物，检测该基因的表达。

(4)利用实时定量RT-PCR进行差异表达分析

以合成的cDNA一链作为模板，采用实时定量PCR试剂盒(Bio-Rad)进行PCR。表达引物依据GhFSE1的cDNA序列设计，5’端引物为GhFSE1-e1(SEQ ID NO.6)，3’端引物为GhFSE1-e2(SEQ ID NO.7)。在20μL的反应体系中包括10μL MIX缓冲液(包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs和MgCl₂)，5'-端和3'-端表达引物各1μL(5μmol/L)，cDNA1μL，双蒸水7μL。循环参数为94℃预变性3min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，30s，预设循环数为40。用棉花GhHISTONE3基因(GenBank登录号：AF024716)作内标，GhHISTONE3基因的5'-引物是GhHIS-1(SEQ ID NO.8)，3'-引物为GhHIS-2(SEQ ID NO.9)。利用实时定量RT-PCR检测了GHFSE1基因在棉花不同组织器官以及开花后8天的纤维和胚珠中的表达情况。

结果表明该基因在棉花根、茎、叶、花、花粉和开花后8天的胚珠中的表达水平极低，主要在10DPA纤维中高量表达(图1)。这结果说明GhFSE1基因是一个纤维特异表达基因，因此将该基因命名为纤维特异表达基因(Fiber-Specific Expression 1，GhFSE1)。推测该基因在纤维细胞发育中具有重要作用。

(5)扩增片段回收，连接，转化大肠杆菌DH5a

a.电泳：将扩增产物在1.0％(W/V)琼脂糖凝胶中进行电泳分离。

b.回收：使用回收试剂盒：回收步骤按照试剂盒说明书进行，回收片段在琼脂糖凝胶上电泳定量。

c.克隆和测序：回收的片段经琼脂糖凝胶电泳定量。按试剂盒说明书，通过回收片段与克隆载体的连接、连接产物的大肠杆菌转化、阳性菌落的培养和质粒酶切验证，将回收片段克隆到pEASY-Blunt(北京全式金)载体上。序列测定由英骏公司完成。

回收的片段与pEASY-Blunt(北京全式金)载体建立如下连接体系:

10倍T4 DNA连接缓冲液 1μL

载体DNA片段 1μL

外源连接产物DNA片段 1μL

T4 DNA连接酶 1μL

用双蒸水补足体积至10μL的连接体系

载体DNA片段与外源连接产物DNA片段摩尔比为1:3，16℃连接12h。之后将连接产物转化大肠杆菌DH5a。

(6)棉花基因组DNA的提取

棉花基因组DNA提取使用“新型植物基因组DNA快速提取试剂盒”(北京艾德莱生物科技有限公司)。具体方法是取棉花嫩叶材料100mg，在液氮中研磨后转入1.5mL离心管中，加入400μL缓冲液和4μL RNase A(10mg/mL)；涡旋混匀，65℃水浴10min，其中颠倒混匀2～3次；加入130μL缓冲液AP2，充分混匀，冰上放置5min，14000rpm离心10min，取上清；加入1.5倍体积的AP3/E(按试剂盒说明书：在使用前加入50mL无水乙醇)，立即混匀；混匀后加入一个吸附柱AC中，13000rpm离心1min，弃流出液；加入600μL漂洗液WB(按试剂盒说明书：在使用前加入100mL无水乙醇)，12000rpm离心30s，弃流出液；将吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm离心2min除尽漂洗液；取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，加入100μL洗脱缓冲液EB(65～70℃预热)，室温放置3～5min，12000rpm离心1min，-20℃保存备用。

(7)GhFSE1基因序列分析

以陆地棉基因组数据库(https://cottonfgd.org/)中Gh_A05G3816的cDNA序列作为参考序列，在其推测ORF两端设计扩增引物，其中5'引物为GhFSE1-1(SEQ ID NO.4)，3'引物为GhFSE1-2(SEQ ID NO.5)。运用这对引物，以陆地棉冀14的8DPA纤维cDNA为模板，扩增出一条大约1000bp的特异带。测序后发现该扩增特异片段长987bp(SEQ ID NO.1)，包含一个完整的ORF(图2)，长987bp。编码一个328个氨基酸残基的蛋白质(SEQ ID NO.3)，该蛋白质预测的分子量为35.9kD，等电点为8.880。

在NCBI上搜索GhFSE1的同源蛋白，该蛋白与拟南芥中3-酮基二氢鞘氨醇还原酶A(At3g06060)和3-酮基二氢鞘氨醇还原酶B(At5g19200)具有较高的同源性，氨基酸序列的相同性分布为98.44％和87.87％。同时，GhFSE1序列具有3-酮基二氢鞘氨醇还原酶保守结构域，如三个跨膜结构域，位于N-端附近的GXSXGXG基序，其有助于确定辅因子结合结构域或罗斯曼折叠，是KDSR的特殊保守结构域，以及参与催化反应的三个氨基酸(催化三联体氨基酸)。这结果说明GhFSE1基因是棉花中3-酮基二氢鞘氨醇还原酶的同源基因。

同时从陆地棉中克隆了GhFSE1的基因组DNA序列，该序列长1325bp(SEQ IDNO.2)，通过与GhFSE1基因的cDNA序列进行比对和根据GT-AG内含子识别规律分析，结果发现，GhFSE1基因组序列含有3个外显子和2个内含子。

实施例2

GhFSE1基因在棉花植株和纤维发育以及纤维发育突变体中的表达分析

提取陆地棉(Gossypium hirsutum L.)各组织和器官的总RNA，并合成cDNA一链。用实时定量RT-PCR检测GhFSE1基因在不同组织和器官中的表达情况。表达引物依据GhFSE1的cDNA序列设计，5’端引物为GhFSE1-e1(SEQ ID NO.6)，3’端引物为GhFSE1-e2(SEQ IDNO.7)。在20μL的反应体系中包括10μL MIX缓冲液(包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs和MgCl₂)，5'-端和3'-端表达引物各1μL(5μmol/L)，cDNA 1μL，双蒸水7μL。循环参数为94℃预变性3min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，30s，预设循环数为40。用棉花GhHISTONE3基因(GenBank登录号：AF024716)作内标，GhHISTONE3基因的5'-引物是GhHIS-1(SEQ ID NO.8)，3'-引物为GhHIS-2(SEQ ID NO.9)。

检测结果表明，GhFSE1在棉花8DPA纤维中具有很高的表达水平，而在8DPA胚珠、根、茎、叶、花和花粉中的表达水平极低，几乎不表达(图1)。说明该基因是一个纤维细胞特异表达基因，与纤维细胞发育具有密切关系。

进一步检测了该基因在纤维发育突变体(li-1)纤维中的表达变化。li-1突变体是一个超短纤维突变体，在纤维发育早期纤维细胞的伸长停止，导致成熟纤维的长度极短，只有5mm左右，因此是研究纤维发育，特别是纤维伸长的良好材料。GhFSE1基因在开花当天野生型(TM-1)和突变体(li-1)胚珠(含纤维细胞)中，以及开花后10天的胚珠中都表达极低，几乎检测不到表达信号；只在开花后10天的纤维细胞中检测到表达信号，但GhFSE1基因在野生型纤维中的表达水平远远高于突变体纤维相同发育时期的水平(图3)。这些结果不仅进一步说明GhFSE1基因是一个纤维特异表达基因，而且说明该基因与纤维伸长有密切关系，可能在纤维细胞伸长过程中具有重要作用。

进一步检测GhFSE1在棉花胚珠纤维不同发育时期的表达情况。结果表明：该基因在纤维细胞起始期(0DPA～2DPA)表达水平很低，随着纤维细胞的发育，基因的表达水平快速上升，在纤维发育的快速伸长期(8DPA～16DPA)GhFSE1的表达水平很高，表达峰值出现在14DPA纤维中；其后，随着纤维伸长速度降低和次生壁的逐渐形成，该基因的表达水平明显降低。该基因在胚珠中的表达一直处于很低的水平(图4)。说明该基因是一个纤维特异表达基因，在纤维快速伸长期高量表达，进一步证明该基因与纤维细胞伸长有密切关系，对纤维伸长具有重要作用。

实施例3

超量表达和反义抑制GhFSE1基因植物表达载体的构建

pEASY--GhFSE1载体是在克隆GhFSE1基因时构建，其上的GhFSE1片段已测序。植物表达载体为改造的pCambia载体，该载体的HPT II基因用XhoI单酶切后替换为NPT II基因(设计引物从pBI121载体中扩增获得，引物设计两端带XhoI位点)，限制性酶切和测序结果验证了NPT II基因的方向。在pBI121载体中扩增获得CaMV35S启动子和NOS终止子，同时这两个元件两端也引入了相应的酶切位点，这两个元件最后分别导入pCambia的多克隆位点，形成CaMV35S：：MCS：：NOS单元。该植物表达载体含有1套2×CaMV35S启动子控制NPTII基因的植物表达元件、1套CaMV35S启动子控制报告基因GRP-GusPlus-His6的植物表达元件和一套CaMV35S启动子控制目标基因的植物表达元件，可实现Kan和GUS活性的双标记筛选。在多克隆位点(Multiple cloning site，MCS)插入外源基因，可以实现外源基因的超量表达。

为了在转基因植物中超量表达GhFSE1基因，需要将GhFSE1基因正向插入植物表达载体中，并用适当的启动子启动表达。为此根据pEASY-GhFSE1载体上的酶切位点和GhFSE1的插入方向以及改造的pCambia植物表达载体上的多克隆位点和CaMV35S启动子的方向，构建了超量表达GhFSE1基因植物表达载体pCambia-35S-GhFSE1-NOS(简称pC-GhFSE1)(图6)和反义抑制GhFSE1基因的植物表达载体pCambia-35S-antisenseGhFSE1-NOS(简称pC-AGhFSE1)(图7)。具体操作为：用DNA限制性内切酶Hind III和Xho I酶切pEASY-GhFSE1载体，回收外源片段，同时用Hind III和Sal I酶切改造的pCambia植物表达载体，回收载体片段，将回收的外源片段和载体片段连接，构建成超量表达GhFSE1基因植物表达载体pC-GhFSE1。用DNA限制性内切酶Kpn I和Xho I酶切pEASY-GhFSE1载体，回收外源片段，同时用KpnI和Sal I酶切改造的pCambia植物表达载体，回收载体片段，将回收的外源片段和载体片段连接，构建成反义抑制GhFSE1基因植物表达载体pC-AGhFSE1。

实施例4

棉花的遗传转化

用电激法将构建的植物表达载体质粒导入农杆菌LBA4404菌株并进行棉花遗传转化。

参考Bio-RAD MicroPulser用户说明书，将上述载体通过电激转化法导入农杆菌LBA4404菌株。

上述的植物表达载体通过农杆菌介导棉花下胚轴转化方法导入棉花。具体方法如下：

冀棉14种子剥去外壳，用0.1％的升汞(HgCl₂)灭菌10min，用大量无菌水冲洗8次。在125mL三角瓶中加入约35mL无菌水震荡过夜，次日换一次无菌水。当种子长出下胚轴根后，播种于种子萌发培养基上，在28℃，黑暗条件下萌发2-3d，此时种子下胚轴开始进入快速伸长的时期，适宜进行遗传转化。

转化用的含pCambia-35S-GhFSE1-NOS和pCambia-35S-antisenseGhFSE1-NOS植物表达载体的农杆菌菌株在含50mg/L Km和125mg/L Sm的YEB固体培养基上活化。挑取其单菌落，接种于5mL含相同抗生素的YEB液体培养基中，28℃、200rpm震荡培养过夜。培养后的农杆菌菌液按1：20的比例转接到25mL含相同抗生素的YEB液体培养基中，继续培养至OD600值约为0.6～0.8，10,000rpm、1min离心收集菌体，菌体用等体积的共培养基(组成见表1)重悬备用。

转化时，将棉花下胚轴切成1.5～2.0cm的小段，放入三角瓶中用制备好的农杆菌菌液侵染，条件为28℃摇床120rpm侵染30min。然后吸干菌液，将下胚轴段转到共培养基上，28℃暗培养2～3天。

共培养后，下胚段转入到下胚段筛选培养基(组成见表1)，28℃光照培养，约20天继代一次，直到出现大量愈伤组织。愈伤组织连同下胚段转移到胚性愈伤诱导培养基，约15天继代一次，直到出现大量的浅黄色胚性愈伤。胚性愈伤挑到胚性愈伤悬浮培养基中，28℃、120rpm摇床培养一周左右。用减去尖头的1.0mL枪头吸取细沙状的体胚平铺于体胚伸长培养基，20～30天后出现大量的绿色小体胚。挑取生长状态良好的体胚继代培养，待体胚伸长到1～2cm时，将其转移到成苗培养基生根出苗。幼苗生长到3～5cm高时，通过嫁接或者移栽的方式转移到温室花钵中生长。其中，本实验例中所用的培养基如表1所示。

表1：根癌农杆菌介导的棉花下胚轴遗传转化所用培养基

MS:Murashige&Skoog,1962

B5:Gamborg,1986

实施例5

转基因棉花的验证

(1)组织化学鉴定

由于构建的植物表达载体中具有一套CaMV35S启动子控制报告基因GRP-GusPlus-His6的植物表达元件，因此可以利用组织化学法鉴定是否是转化植株。待转化植株在生根培养基上生根并长到5～8cm时，将幼苗从培养瓶中取出洗净，转入三角瓶上水培炼苗2～3d。同时，取一小块叶片和一小段根进行GUS染色。结果如图8-A所示，野生型叶片GUS染色为阴性，抗性植株叶片GUS染色为阳性，阳性植株直接移栽到营养钵中。

(2)扩增验证

待棉花植株移栽成活并生长到一定大小，取0.5g叶片提取棉花基因组DNA，以CaMV35S启动子的上游引物35S(SEQ ID NO.10)和GhFSE1基因的3'端引物GhFSE1-2(SEQ IDNO.5)扩增超量表达载体的转基因棉花；以CaMV35S启动子的上游引物35S(SEQ ID NO.10)和GhFSE1基因的5'端引物GhFSE1-1(SEQ ID NO.4)扩增反义抑制的转基因棉花。25μL的扩增体系含2.5μL 10倍PCR buffer，2μL 2.5mmol/L dNTPs，1.5μL 25mmol/L MgCl₂，各1μL引物35S和GhFSE1-1或GhFSE1-2(5μmol/L)，1μLTaq DNA聚合酶，1μL基因组DNA(50ng)和15μL双蒸水。扩增程序为：94℃，5min；94℃，30s，56℃，30s，72℃，2.5min，35个循环；72℃延伸10min。用正反植物表达载体质粒作阳性对照，以水作空白，以野生型棉花基因组DNA作阴性对照。结果显示GUS染色阳性的转基因棉花植株都能扩增出一条与阳性对照一致的带，说明植物表达载体的T-DNA区段已经整合到转基因棉花基因组中(图8-B和8-C)。

实施例6

检测GhFSE1基因在转基因棉花中的表达变化

按照实施例1中提取棉花RNA的方法，提取转基因棉花和野生型棉花叶片的总RNA，并合成cDNA一链。用Real-Time PCR方法分析转基因棉花中目的基因的表达，PCR在实时定量PCR仪上进行，在25μL的反应体系中包括12.5μL MIX buffer(包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs和MgCl₂，实时定量RT-PCR试剂盒提供，Bio-Rad)。GhFSE1基因用引物GhFSE1-e1(SEQ ID NO.6)和GhFSE1-e2(SEQ ID NO.7)扩增，内标采用棉花GhHISTONE3(GenBank登录号：AF024716)，引物为GhHIS-1和GhHIS-2。扩增程序为：94℃预变性3min；94℃，30s；56℃，30s；72℃，30s；预设循环数为35。在运行实时定量PCR前，用相同引物和模板在相同的温度变化程序中扩增一次，通过扩增产物的电泳，确保扩增产物是单带。

实时定量RT-PCR分析的结果表明GhFSE1基因在pC-GhFSE1转基因棉花中的表达水平比对照高，相反在pC-AGhFSE1转基因棉花中的表达水平比对照低(图9)。这结果说明已获得超量表达和反义抑制GhFSE1的转基因棉花植株。

实施例7

超量表达GhFSE1基因促进棉花纤维伸长

将T1代转基因棉花和对照同时栽种到试验田，进行正常的生产管理，观察棉花纤维的生长发育和比较成熟纤维的长度。当棉花纤维成熟后，用梳子梳理同时期同部位的棉花纤维，然后再用直尺测量纤维的长度(图10)。结果显示，Pc-GhFSE1纤维的平均长度达到了33.44±1.48mm，而对照的纤维的平均长度为29.03±1.04mm，纤维长度增加了15.19％(图11)；相反，PC-AGhFSE1纤维的平均长度可短至22.90±0.81mm，纤维长度缩短21.12％(图11)。这结果说明GhFSE1基因在纤维细胞伸长过程中具有重要作用，其表达水平与纤维长度有密切关系，提高该基因的表达水平可以增加纤维长度，而抑制该基因的表达水平则抑制纤维伸长。该基因是利用基因工程改良纤维品质的有效基因。

以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

SEQ ID No.1

ATGGTGCTCTTCGGTCTTCTCCTCCTACCAGTCCTCCTTCTCCTCCTCCTCTACTTCATCGTTCGGCCCCGGCCCATTAACATACCTATTAAAAACCGACACGTTTTCATAACAGGCGGTTCAATGGGCATCGGGCTAGCCATAGCCAAACAAGCTGCATCGGAGGGAGCGCGTATTTCCCTCTTGGCTCGTTCCGTTGACCAGCTCCAAAAAGCAAAGGAATCAATCTGTCAAGCCTATGAAGTCGAGGTCTCGATCTTTAGTGCTGATGTTCGTGACTACGATGCCGTTGAGCGTGCGATAAACGAGGCTGGCAGTATCGATGTTCTAGTAGTTAACCATGGGGTGTATTACGTTGAGGAGTTTGAGACCCAAGGACTAGATGTGATGAAGACGATGATAGATGTGAATCTGATGGGAAGCTTCAATGTCATCAAAGCAGCTTTGCCGTTGATGAAGGATAGAAAAGACAAGGGACCAGCCTCCATTGCTCTTATGTCTTCAATGGCCGGCCAGGTGGGTACATATGGTTTTGCGGCTTATTCAGCCACTAAATTTGGGCTAAGAGGATTAGCAGAAGCATTGCAACAAGAAGTTTTGGAGAATAACATCCATCTTTCTTTAATTTTCCCTCCCGTGACTGAAACTCCGGGATTTGAACCAGCAAGGAAAACAATGCCGGAAATCACCAAAATTATATCGAGCACATCTGCGGAAATGAAAGCCGAAGAAGTTGGGAAGATAACAATACAAGGCATTAAATCAGGAAGTTTTAGCATCCCCTGCAAGCGTGATGGGCGAGCACTGGTAATAGCTACAGCTGGTTTATCCCCTCAGAGATGTTTCATCATGGCGTCCCTTGAAGTGGTTTTTGCCGGTCTATTTCGGTTTGTAGCTCTGCTTTTGCAATGGAACTGGTATGGGATTATAGAAAAGAAAAAAATCACAGAAAAAAAAAAAACAGTAACAGCAAGTTTGGTTCACTGA

SEQ ID No.2

ATGGTGCTCTTCGGTCTTCTCCTCCTACCAGTCCTCCTTCTCCTCCTCCTCTACTTCATCGTTCGGCCCCGGCCCATTAACATACCTATTAAAAACCGACACGTTTTCATAACAGGCGGTTCAATGGGCATCGGGCTAGCCATAGCCAAACAAGCTGCATCGGAGGGAGCGCGTATTTCCCTCTTGGCTCGTTCCGTTGACCAGCTCCAAAAAGCAAAGGAATCAATCTGTCAAGCCTATGAAGTCGAGGTCTCGATCTTTAGTGCTGATGTTCGTGACTACGATGCCGTTGAGCGTGCGATAAACGAGGCTGGCAGTATCGATGTTCTAGTAGTTAACCATGGGGTGTATTACGTTGAGGAGTTTGAGACCCAAGGACTAGATGTGATGAAGACGATGATAGATGTGAATCTGATGGGAAGCTTCAATGTCATCAAAGCAGCTTTGCCGTTGATGAAGGATAGAAAAGACAAGGGACCAGCCTCCATTGCTCTTATGTCTTCAATGGCCGGCCAGGTTTAGTTGTACCTTAGTTGTTACGTGTTAGGTTTTAATACTAATAATCTTCTCTGTTATTATAATTTTTGCATAAATTCTATCCCCGTTCCATTTTCTTTTTCTAAATTAAAAAAATATATATATAAAAAAATAAATGAGATATTAGCCTTGATTGGTTCTTATAATCATTTGGAAAAATAAAAAATATATATTTGTAGCTATTTTTAGCCATTTTAAGTGGGTTCATATAATAAATATAGGTGGGTACATATGGTTTTGCGGCTTATTCAGCCACTAAATTTGGGCTAAGAGGATTAGCAGAAGCATTGCAACAAGAAGTTTTGGAGAATAACATCCATCTTTCTTTAATTTTCCCTCCCGTGACTGAAACTCCGGGATTTGAACCAGGTTTGAGTTTTTTCTAATATAATTATTTTCTACAAAATAAATCAATTAATTAAAATTTTCATTGCATTAATTAACCATCCACGTGTGATTTTGAAGCAAGGAAAACAATGCCGGAAATCACCAAAATTATATCGAGCACATCTGCGGGAATGAAAGCCGAAGAAGTTGGGAAGATAACAATACAAGGCATTAAATCAGGAAGTTTTAGCATCCCCTGCAAGCTTGATGGGCGAGCACTGGTAATAGCTACAGCTGGTTTATCCCCTCAGAGATGTTTCATCATGGCGTCCCTTGAAGTGGTTTTTGCCGGTCTGTTTCGGTTTGTAGCTCTGCTTTTGCAATGGAACTGGTATGGGATTATAGAAAAGAAAAAAATCACAGAAAAAAAAAAAACAGTAACAGCAAGTTTGGTTCACTGA

SEQ ID No.3

MVLFGLLLLPVLLLLLLYFIVRPRPINIPIKNRHVFITGGSMGIGLAIAKQAASEGARISLLARSVDQLQKAKESICQAYEVEVSIFSADVRDYDAVERAINEAGSIDVLVVNHGVYYVEEFETQGLDVMKTMIDVNLMGSFNVIKAALPLMKDRKDKGPASIALMSSMAGQVGTYGFAAYSATKFGLRGLAEALQQEVLENNIHLSLIFPPVTETPGFEPARKTMPEITKIISSTSAEMKAEEVGKITIQGIKSGSFSIPCKRDGRALVIATAGLSPQRCFIMASLEVVFAGLFRFVALLLQWNWYGIIEKKKITEKKKTVTASLVH

SEQ ID No.4

5’-ATGGTGCTCTTCGGTCTTCT-3’

SEQ ID No.5

5’-TCAGTGAACCAAACTTGCTG-3’

SEQ ID No.6

5’-TAGTGCTGATGTTCGTGACT-3’

SEQ ID No.7

5’-GCTTCTGCTAATCCTCTTAG-3’

SEQ ID No.8

5’-GAAGCCTCAT CGATACCGTC-3’

SEQ ID No.9

5’-CTACCACTAC CATCATGGC-3’

SEQ ID No.10

5’-TCTTGAGCCTACAACCTTAG-3’

SEQUENCE LISTING

<110> 西南大学

<120> 一种棉花纤维特异表达基因GhFSE1及其应用

<130> CQ302-19P122715

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 987

<212> DNA

<213> Gossypium hirsutum L.

<400> 1

atggtgctct tcggtcttct cctcctacca gtcctccttc tcctcctcct ctacttcatc 60

gttcggcccc ggcccattaa catacctatt aaaaaccgac acgttttcat aacaggcggt 120

tcaatgggca tcgggctagc catagccaaa caagctgcat cggagggagc gcgtatttcc 180

ctcttggctc gttccgttga ccagctccaa aaagcaaagg aatcaatctg tcaagcctat 240

gaagtcgagg tctcgatctt tagtgctgat gttcgtgact acgatgccgt tgagcgtgcg 300

ataaacgagg ctggcagtat cgatgttcta gtagttaacc atggggtgta ttacgttgag 360

gagtttgaga cccaaggact agatgtgatg aagacgatga tagatgtgaa tctgatggga 420

agcttcaatg tcatcaaagc agctttgccg ttgatgaagg atagaaaaga caagggacca 480

gcctccattg ctcttatgtc ttcaatggcc ggccaggtgg gtacatatgg ttttgcggct 540

tattcagcca ctaaatttgg gctaagagga ttagcagaag cattgcaaca agaagttttg 600

gagaataaca tccatctttc tttaattttc cctcccgtga ctgaaactcc gggatttgaa 660

ccagcaagga aaacaatgcc ggaaatcacc aaaattatat cgagcacatc tgcggaaatg 720

aaagccgaag aagttgggaa gataacaata caaggcatta aatcaggaag ttttagcatc 780

ccctgcaagc gtgatgggcg agcactggta atagctacag ctggtttatc ccctcagaga 840

tgtttcatca tggcgtccct tgaagtggtt tttgccggtc tatttcggtt tgtagctctg 900

cttttgcaat ggaactggta tgggattata gaaaagaaaa aaatcacaga aaaaaaaaaa 960

acagtaacag caagtttggt tcactga 987

<210> 2

<211> 1325

<212> DNA

<213> Gossypium hirsutum L.

<400> 2

atggtgctct tcggtcttct cctcctacca gtcctccttc tcctcctcct ctacttcatc 60

gttcggcccc ggcccattaa catacctatt aaaaaccgac acgttttcat aacaggcggt 120

tcaatgggca tcgggctagc catagccaaa caagctgcat cggagggagc gcgtatttcc 180

ctcttggctc gttccgttga ccagctccaa aaagcaaagg aatcaatctg tcaagcctat 240

gaagtcgagg tctcgatctt tagtgctgat gttcgtgact acgatgccgt tgagcgtgcg 300

ataaacgagg ctggcagtat cgatgttcta gtagttaacc atggggtgta ttacgttgag 360

gagtttgaga cccaaggact agatgtgatg aagacgatga tagatgtgaa tctgatggga 420

agcttcaatg tcatcaaagc agctttgccg ttgatgaagg atagaaaaga caagggacca 480

gcctccattg ctcttatgtc ttcaatggcc ggccaggttt agttgtacct tagttgttac 540

gtgttaggtt ttaatactaa taatcttctc tgttattata atttttgcat aaattctatc 600

cccgttccat tttctttttc taaattaaaa aaatatatat ataaaaaaat aaatgagata 660

ttagccttga ttggttctta taatcatttg gaaaaataaa aaatatatat ttgtagctat 720

ttttagccat tttaagtggg ttcatataat aaatataggt gggtacatat ggttttgcgg 780

cttattcagc cactaaattt gggctaagag gattagcaga agcattgcaa caagaagttt 840

tggagaataa catccatctt tctttaattt tccctcccgt gactgaaact ccgggatttg 900

aaccaggttt gagttttttc taatataatt attttctaca aaataaatca attaattaaa 960

attttcattg cattaattaa ccatccacgt gtgattttga agcaaggaaa acaatgccgg 1020

aaatcaccaa aattatatcg agcacatctg cgggaatgaa agccgaagaa gttgggaaga 1080

taacaataca aggcattaaa tcaggaagtt ttagcatccc ctgcaagctt gatgggcgag 1140

cactggtaat agctacagct ggtttatccc ctcagagatg tttcatcatg gcgtcccttg 1200

aagtggtttt tgccggtctg tttcggtttg tagctctgct tttgcaatgg aactggtatg 1260

ggattataga aaagaaaaaa atcacagaaa aaaaaaaaac agtaacagca agtttggttc 1320

actga 1325

<210> 3

<211> 328

<212> PRT

<213> Gossypium hirsutum L.

<400> 3

Met Val Leu Phe Gly Leu Leu Leu Leu Pro Val Leu Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Tyr Phe Ile Val Arg Pro Arg Pro Ile Asn Ile Pro Ile Lys Asn

20 25 30

Arg His Val Phe Ile Thr Gly Gly Ser Met Gly Ile Gly Leu Ala Ile

35 40 45

Ala Lys Gln Ala Ala Ser Glu Gly Ala Arg Ile Ser Leu Leu Ala Arg

50 55 60

Ser Val Asp Gln Leu Gln Lys Ala Lys Glu Ser Ile Cys Gln Ala Tyr

65 70 75 80

Glu Val Glu Val Ser Ile Phe Ser Ala Asp Val Arg Asp Tyr Asp Ala

85 90 95

Val Glu Arg Ala Ile Asn Glu Ala Gly Ser Ile Asp Val Leu Val Val

100 105 110

Asn His Gly Val Tyr Tyr Val Glu Glu Phe Glu Thr Gln Gly Leu Asp

115 120 125

Val Met Lys Thr Met Ile Asp Val Asn Leu Met Gly Ser Phe Asn Val

130 135 140

Ile Lys Ala Ala Leu Pro Leu Met Lys Asp Arg Lys Asp Lys Gly Pro

145 150 155 160

Ala Ser Ile Ala Leu Met Ser Ser Met Ala Gly Gln Val Gly Thr Tyr

165 170 175

Gly Phe Ala Ala Tyr Ser Ala Thr Lys Phe Gly Leu Arg Gly Leu Ala

180 185 190

Glu Ala Leu Gln Gln Glu Val Leu Glu Asn Asn Ile His Leu Ser Leu

195 200 205

Ile Phe Pro Pro Val Thr Glu Thr Pro Gly Phe Glu Pro Ala Arg Lys

210 215 220

Thr Met Pro Glu Ile Thr Lys Ile Ile Ser Ser Thr Ser Ala Glu Met

225 230 235 240

Lys Ala Glu Glu Val Gly Lys Ile Thr Ile Gln Gly Ile Lys Ser Gly

245 250 255

Ser Phe Ser Ile Pro Cys Lys Arg Asp Gly Arg Ala Leu Val Ile Ala

260 265 270

Thr Ala Gly Leu Ser Pro Gln Arg Cys Phe Ile Met Ala Ser Leu Glu

275 280 285

Val Val Phe Ala Gly Leu Phe Arg Phe Val Ala Leu Leu Leu Gln Trp

290 295 300

Asn Trp Tyr Gly Ile Ile Glu Lys Lys Lys Ile Thr Glu Lys Lys Lys

305 310 315 320

Thr Val Thr Ala Ser Leu Val His

325

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Synthetic

<400> 4

atggtgctct tcggtcttct 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Synthetic

<400> 5

tcagtgaacc aaacttgctg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Synthetic

<400> 6

tagtgctgat gttcgtgact 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Synthetic

<400> 7

gcttctgcta atcctcttag 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Synthetic

<400> 8

gaagcctcat cgataccgtc 20

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> Synthetic

<400> 9

ctaccactac catcatggc 19

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Synthetic

<400> 10

tcttgagcct acaaccttag 20

Claims

1.一种棉花纤维特异表达基因GhFSE1，所述GhFSE1的cDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的棉花纤维特异表达基因GhFSE1，其特征在于，所述GhFSE1的gDNA核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.一种由权利要求1或2所述的棉花纤维特异表达基因GhFSE1编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求1或2所述棉花纤维特异表达基因GhFSE1和启动子，所述启动子选自增强型、组成型、组织特异性和诱导型中的一种或多种。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体包含T-DNA区段，在所述T-DNA区段内包括三套表达元件，第一套由启动子控制GhFSE1基因正向序列，终止子为NOS终止子；第二套由组成型启动子35S控制筛选基因正向序列，终止子为NOS终止子；第三套由组成型启动子35S控制报告基因正向序列，终止子为NOS终止子。

6.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体包含T-DNA区段，在所述T-DNA区段内包括三套表达元件，第一套由组成型启动子35S控制GhFSE1基因正向序列，终止子为NOS终止子；第二套由组成型启动子35S控制NPTII基因正向序列，终止子为NOS终止子；第三套由组成型启动子35S控制GUS基因正向序列，终止子为NOS终止子。

7.一种转化体，所述转化体由权利要求4～6任一项所述的表达载体转化宿主获得。

8.权利要求1或2所述的棉花纤维特异表达基因GhFSE1、权利要求3所述的蛋白质、权利要求4～6任一项所述的表达载体、权利要求7所述的转化体在提高棉花纤维品质和/或增加棉花纤维产量中的应用。

9.一种提高棉花纤维品质和/或增加棉花纤维产量的方法，其特征在于在目标棉花植株中超量表达权利要求1或2所述的棉花纤维特异表达基因GhFSE1，促进棉花纤维伸长，从而提高目标棉花植株的纤维品质和棉花产量。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述方法包括制备含有棉花纤维特异表达基因GhFSE1的转基因棉花的步骤，所述步骤包括：

2)用所述重组载体转化宿主，获得转化体；

3)用所述转化体转化棉花，获得转基因棉花。