CN109837290B - ShFAD2基因家族和ShFAD3基因家族在创制高产ALA的转基因植物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了ShFAD2基因家族和ShFAD3基因家族在创制高产ALA的转基因植物中的应用，ShFAD2基因家族包括ShFAD2‑1和ShFAD2‑2，ShFAD3基因家族包括ShFAD3‑1和ShFAD3‑2，利用LP4‑2A序列将ShFAD2基因家族和ShFAD3基因家族串联到同一个表达框中，形成融合蛋白基因ShFAD2‑LP4‑2A‑ShFAD3，通过种子特异启动子驱动构建植物表达载体，将其转入植物获得的转基因种子中ALA含量大幅提高，表明超量表达ShFAD2基因家族和ShFAD3基因家族可以创制高产ALA的转基因植物新材料，可用于工业提取ALA，或直接用于生产富含ALA的保健型食用油。

Description

ShFAD2基因家族和ShFAD3基因家族在创制高产ALA的转基因 植物中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及奇亚ShFAD2基因家族和ShFAD3基因家族在制备高产α-亚麻酸的植物中的应用。

背景技术

多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated Fatty Acids，PUFA)是在碳原子之间含有两个以上双键的不饱和脂肪酸，其代谢途径是以亚油酸(LA；C18:2Δ^9,12，n-6)为初始底物，在一系列脂肪酸脱饱和酶(脂肪酸脱氢酶)和脂肪酸延伸酶的催化下，生成γ-亚麻酸(GLA；C18:3Δ^6,9,12,n-6)、α-亚麻酸(α-linolenic acid,ALA；C18:3Δ^9,12,15,n-3)、十八碳四烯酸(SDA/OTA,C18:4Δ^6,9,12,15,n-3)、双高γ-亚麻酸(DHLG)、花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(EPA,n-3)、二十二碳五烯酸(DPA)、二十二碳六烯酸(DHA,n-3)等长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFAs)或超长链多不饱和脂肪酸(VLC-PUFAs)。

PUFA能促进生长发育，调节人体的脂质代谢，还能治疗和预防心脑血管疾病，同时具有免疫调节、抗癌、延缓衰老等重要的生理功能，对人类健康起到非常重要的作用。Ω3(n-3)系列脂肪酸对人体具有重要生理功能，其中ALA是合成n-3 PUFA(SDA、EPA、DHA等)的前体。EPA是一类重要的多聚不饱和脂肪酸化学信使物，在免疫和炎症反应上起至关重要的作用。DPA是生成DHA的中间产物，对冠心病具有潜在的抑制作用。DHA是大脑和视网膜正常发育和发挥其正常功能所必需的，对智力和视力发挥着至关重要的作用。Ω6(n-6)系列脂肪酸对人体也具有重要生理功能，其中GLA、ARA除作为结构脂类外，还可进一步合成前列腺素(PG)而起重要的生理作用。

脂肪酸脱饱和酶2(FAD2)和脂肪酸脱饱和酶3(FAD3)是PUFA生物合成途径经最基础的两步限速酶，FAD2能够催化油酸(OA)形成亚油酸(LA)，FAD3能够催化亚油酸(LA)形成α亚麻酸(ALA)。

人体自身缺乏FAD2和FAD3基因和相应的酶，不能合成LA和ALA，因此LA和ALA是人体的必须性脂肪酸，只能通过饮食摄取。理论上人体只需要通过食物等途径摄入足够的LA和ALA，就可以利用人体自身的D6D等酶系统将它们分别合成为GLA、PG和EPA、DHA等高级脂肪酸。

现代人体营养学研究表明，人体每天摄入的Ω6/Ω3(即n6/n3)型脂肪酸比例维持在3.5/1的比例时最合理，否则会影响人体健康。但现实的情况是，现代人群的食谱结构普遍导致每天摄入的ALA不足，使这一比例远远高于3.5/1。正常人体需要摄取ALA约1.5g/天，目前人群ALA摄入量不能满足世界卫生组织(WHO)推荐量(1.25g/天)的一半，表明人类普遍缺乏ALA。鉴于此，WHO和联合国粮农组织(FAO)曾于1993年发表联合声明，决定在世界范围内专项推广ALA。因此，及时补充ALA对确保人体正常代谢和生理功能具有重要作用。

由于ALA含量与生物耐冷性呈正相关，而与耐热性呈负相关，因此长期适应于夏季高温季节开花结籽的植物，其种子发育时FAD3的功能很弱，种子贮存性油脂中ALA含量非常低甚至不含有。正因为如此，在大宗油料作物中，棕榈油、花生油、棉籽油、葵籽油即属于此类，仅凉季开花结籽的菜籽油、晚熟大豆油的ALA含量相对还算不低，橄榄油居于两类之间。由于ALA含有三个烯键，常规条件下贮存时易被氧化变质，而且油脂ALA含量与种子含油量之间似乎存在一定负相关，因此传统油菜和大豆育种采用了降低ALA的策略来延长籽油在常规条件下的贮存稳定性，但这却降低了油的营养保健价值，也加剧了当今世界性常规食谱中ALA不足、Ω6/Ω3比值过高的问题。

虽然ALA广泛存在于多种植物的种子油中，但大宗油料作物并不是富含ALA的，富含ALA的植物主要是一些小宗油料作物和有待开发的资源植物。目前已知ALA占种子油30％以上的植物有几十种以上，其中唇形科植物奇亚(Salvia hispanica,2n＝12)的籽油中ALA含量为55％-70％，是已知油料作物中ALA含量之冠。奇亚原产于墨西哥中部高原，单年生草本，为古阿兹特克王国五大作物中最神圣的一种，新大陆被发现以后的数百年间奇亚的种植随着印第安文明的衰落而衰落，但三十年前被再发现而复活为“新作物”，并且随着世界性保健食品的热潮而在中南美洲大规模种植，并向北美、澳洲、南亚、非洲、南欧扩展种植，很快成为世界性的小宗油料作物。

由于富含ALA的小宗油料作物的种植面积普遍很小，且产量低，因此导致这些植物油本身及从其提取的ALA均价格昂贵，远远无法满足世界性ALA的需求量。受产量低、适应范围窄的限制，通过世界性大规模扩大小宗油料作物的种植面积来提升ALA产量的策略不太可行，而相对可行的一条途径是利用代谢工程将小宗油料作物中合成ALA的关键基因导入到大宗油料作物中，创制富含甚至高产ALA的大宗油料作物，除可以用来缓解大众食用油中ALA不足的问题，更可以用高产ALA的转基因植物种子来工业化提取ALA，满足日益扩大的特殊脂肪酸及保健品市场的需求。

大宗油料作物有多种，其中甘蓝型油菜(简称油菜，Brassica napus L.，2n＝38，AACC)为我国五大油料作物之首，经济性状好，产量高，含油量高，抗逆性强，是重要的食用油和蛋白质饲料来源，也是重要的工业原料。通过导入外源优势FAD2和FAD3基因，创高产ALA的新型油菜，其籽油可直接用于工业提取ALA或生产富含ALA的营养品，也可与缺乏ALA的棕榈油、花生油、棉籽油、葵籽油等调和后提高它们Ω3脂肪酸的丰度，降低Ω6/Ω3比值。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供奇亚脂肪酸脱饱和酶2基因家族和奇亚脂肪酸脱饱和酶3基因家族在制备高产α-亚麻酸的植物中的应用；本发明的目的之二在于提供一种提高植物种子α-亚麻酸含量中的重组表达载体；本发明的目的之三在于提供一种获得高产α-亚麻酸的植物的方法；本发明的目的之四在于提供所述重组表达载体在提高植物α-亚麻酸中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、奇亚脂肪酸脱饱和酶2基因家族和奇亚脂肪酸脱饱和酶3基因家族在制备高产α-亚麻酸的植物中的应用，所述奇亚脂肪酸脱饱和酶2基因家族包括ShFAD2-1和ShFAD2-2，所述奇亚脂肪酸脱饱和酶3基因家族包括ShFAD3-1和ShFAD3-2；所述ShFAD2-1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列取代、缺失或添加至少一个氨基酸，且来源于奇亚具脂肪酸脱饱和酶2活性的氨基酸序列；所述ShFAD2-2氨基酸序列如SEQID NO.4所示，或如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列取代、缺失或添加至少一个氨基酸，且来源于奇亚具脂肪酸脱饱和酶2活性的氨基酸序列；所述ShFAD3-1的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，或如SEQ ID NO.6所示氨基酸序列取代、缺失或添加至少一个氨基酸，且来源于奇亚具脂肪酸脱饱和酶3活性的氨基酸序列；所述ShFAD3-2的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，或如SEQ ID NO.8所示氨基酸序列取代、缺失或添加至少一个氨基酸，且来源于奇亚具脂肪酸脱饱和酶3活性的氨基酸序列。

优选的，所述ShFAD2-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列取代、缺失或添加至少一个核苷酸，且来源于奇亚具脂肪酸脱饱和酶2活性的核苷酸序列；所述ShFAD2-2核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，或如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列取代、缺失或添加至少一个核苷酸，且来源于奇亚具脂肪酸脱饱和酶2活性的核苷酸序列；所述ShFAD3-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，或如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列取代、缺失或添加至少一个核苷酸，且来源于奇亚具脂肪酸脱饱和酶3活性的核苷酸序列；所述ShFAD3-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，或如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列取代、缺失或添加至少一个核苷酸，且来源于奇亚具脂肪酸脱饱和酶3活性的核苷酸序列。

优选的，所述植物为大宗油料作物，更优选的，所述大宗油料作物为甘蓝型油菜。

2、一种提高植物种子α-亚麻酸含量中的重组表达载体，所述重组载体含有奇亚脂肪酸脱饱和酶2家族基因和奇亚脂肪酸脱饱和酶3家族基因，所述奇亚脂肪酸脱饱和酶2基因家族包括ShFAD2-1和ShFAD2-2，所述奇亚脂肪酸脱饱和酶3基因家族包括ShFAD3-1和ShFAD3-2；所述ShFAD2-1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列取代、缺失或添加至少一个氨基酸，且来源于奇亚具脂肪酸脱饱和酶2活性的氨基酸序列；所述ShFAD2-2氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列取代、缺失或添加至少一个氨基酸，且来源于奇亚具脂肪酸脱饱和酶2活性的氨基酸序列；所述ShFAD3-1的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，或如SEQ ID NO.6所示氨基酸序列取代、缺失或添加至少一个氨基酸，且来源于奇亚具脂肪酸脱饱和酶3活性的氨基酸序列；所述ShFAD3-2的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，或如SEQ ID NO.8所示氨基酸序列取代、缺失或添加至少一个氨基酸，且来源于奇亚具脂肪酸脱饱和酶3活性的氨基酸序列。

优选的，所述重组载体同时含有ShFAD2家族任一基因编码区、连接肽-内含肽LP4-2A编码区、ShFAD3家族任一基因编码区，三者串联形成一个融合蛋白基因ShFAD2-LP4-2A-ShFAD3，所述连接肽-内含肽LP4-2A编码区序列如SEQ ID NO.9所示。

优选的，所述重组载体由以下方法制备：所述述重组载体的优选实施例(但不限于优选实施例)由SEQ ID NO.11所示序列连入pC2301M1NPB质粒XbaI与XmaI酶切位点而得。

所述pC2301M1NPB载体由以下方法制备：用HindIII和EcoRI切下pBI121上的GUS基因表达盒后插入pCAMBIA2301载体的酶切位点HindIII与EcoRI之间，然后用SacI和XmaI切去GUS基因后用带有SacI和XmaI粘性末端的序列连接，得pC2301M1载体，然后在pC2301M1载体HindIII酶切位点处连入由MAS启动子驱动Bar基因表达、MAS终止子终止表达的Bar基因表达盒，得pC2301M1B载体；最后将pC2301M1B载体上的CaMV35S启动子用种子特异启动子NapA替换即得pC2301M1NPB载体。

3、一种获得高产α-亚麻酸的植物的方法，具体是在植物中过量表达奇亚脂肪酸脱饱和酶2家族基因和奇亚脂肪酸脱饱和酶3家族基因，所述奇亚脂肪酸脱饱和酶2基因家族包括ShFAD2-1和ShFAD2-2，所述奇亚脂肪酸脱饱和酶3基因家族包括ShFAD3-1和ShFAD3-2；所述ShFAD2-1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列取代、缺失或添加至少一个氨基酸，且来源于奇亚具脂肪酸脱饱和酶2活性的氨基酸序列；所述ShFAD2-2氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列取代、缺失或添加至少一个氨基酸，且来源于奇亚具脂肪酸脱饱和酶2活性的氨基酸序列；所述ShFAD3-1的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，或如SEQ ID NO.6所示氨基酸序列取代、缺失或添加至少一个氨基酸，且来源于奇亚具脂肪酸脱饱和酶3活性的氨基酸序列；所述ShFAD3-2的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，或如SEQ ID NO.8所示氨基酸序列取代、缺失或添加至少一个氨基酸，且来源于奇亚具脂肪酸脱饱和酶3活性的氨基酸序列。

优选的，所述在植物中过量表达奇亚脂肪酸脱饱和酶2家族基因和奇亚脂肪酸脱饱和酶家族基因的方法是，构建含有权利要求4～6任一项所述的重组表达载体，优选实施例(但不限于优选实施例)是转化根癌农杆菌LBA4404，检测获得含重组表达载体的LBA4404工程菌株，然后用含含重组表达载体的LBA4404工程菌株转化植物，筛选转基因植物即获得高产α-亚麻酸的植物。

优选的，所述植物为大宗油料作物；更优选的，所述大宗油料作物为甘蓝型油菜。

4、所述重组表达载体在提高植物α-亚麻酸中的应用。

所述植物为大宗油料作物；更优选的，所述大宗油料作物为甘蓝型油菜。

本发明的有益效果在于：本发明提供了ShFAD2基因家族和ShFAD3基因家族的全长cDNA序列和gDNA序列、编码蛋白序列和结构特征、进化关系、表达的器官组织特异性等，并确认了ShFAD2-1、ShFAD2-2编码有脂肪酸脱饱和酶2活性，ShFAD3-1、ShFAD3-2编码有脂肪酸脱饱和酶3活性，并鉴定出了ShFAD2家族的优势基因ShFAD2-2和ShFAD3家族的优势基因ShFAD3-2。设计了植物偏爱密码子的连接肽-内含肽人工序列LP4-2A，优选实施例中(但不限于优选实施例)以它为接头将ShFAD2-2与ShFAD3-2的编码区重组为融合蛋白基因ShFAD2-2-LP4-2A-ShFAD3-2，正义转化油菜后能够大幅度提高种子中ALA的含量。本发明证明了融合蛋白基因ShFAD2-LP4-2A-ShFAD3在植物ALA性状的分子育种方面具有很好的应用前景，可用于创制高产ALA的大宗油料作物，其转基因植物可应用于工业提取ALA，或用于生产富含ALA的营养品，或与缺乏ALA的棕榈油、花生油、棉籽油、葵籽油等调和后提高它们Ω3脂肪酸的丰度，降低Ω6/Ω3比值。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为ShFAD2和ShFAD3基因家族cDNA末端和全长扩增的琼脂糖凝胶电泳图(A为ShFAD2基因家族，B为ShFAD3基因家族；M：Marker；5P：5’-RACE初扩；5N：5’-RACE巢扩；3P：3’-RACE初扩；3N：3’-RACE巢扩；FC：全长cDNA扩增；FG：全长gDNA扩增)。

图2为ShFAD2和ShFAD3基因家族全长cDNA序列及其编码的氨基酸序列(A：ShFAD2-1；B：ShFAD2-2；C：ShFAD3-1；D：ShFAD3-2；起始密码子ATG、终止密码子TAG用粗体加下划线表示，转录起始位点和poly A加尾位点用斜体加下划线标记。5’UTR中的嘧啶串、3’UTR中的疑似poly A加尾信号加下划波浪线)。

图3为ShFAD2和ShFAD3的蛋白系统树(A为ShFAD2-1/ShFAD2-2蛋白与双、单子叶植物FAD2蛋白的系统树，B为ShFAD3-1/ShFAD3-2蛋白与双子叶植物FAD3、FAD7、FAD8蛋白的系统树；Arabidopsis thaliana拟南芥，Arachis hypogaea花生，Borago officinalis玻璃苣，Brachypodium distachyon二穗短柄草，Brassica rapa白菜，Glycine max大豆，Gossypium hirsutum陆地棉，Helianthus annuus向日葵，Linum grandiflorum大花亚麻，Nicotiana tabacum烟草，Olea europaea橄榄，Populus trichocarpa毛果杨，Ricinuscommunis蓖麻，Sesamumindicum芝麻，Vitis vinifera葡萄，Zea mays玉米)。

图4为ShFAD2家族和ShFAD3家族在奇亚各器官中转录表达的荧光定量PCR检测结果(A：ShFAD2-1；B：ShFAD3-2；C：ShFAD3-1；D：ShFAD3-2)。

图5为植物表达载体构建示意图和油菜种子脂肪酸组分的GC峰图(A：植物表达载体构建示意图(ShFAD2家族2个成员基因与ShFAD3家族2个成员基因之间共可形成4种双价组合方式)，B：融合双价基因ShFAD2-2-LP4-2A-ShFAD3-2转化油菜后的优株S22-3与对照(NT)种子脂肪酸组分的GC峰图)。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明实施例采用的植物材料：奇亚(Salvia hispanica)的种子为商业购买的澳洲栽培型，甘蓝型油菜(Brassica napus)品种中双10号的商业推广种子由中国农业科学院油料作物研究所张学昆研究员惠赠，两种作物的种植均为常规试验条件。

本发明实施例DNA合成和测序由上海立菲、南京金斯瑞、上海生工等公司商业完成。

实施例1、奇亚脂肪酸脱饱和酶2(ShFAD2)家族和脂肪酸脱饱和酶3(ShFAD3)家族的克隆

(1)奇亚基因组总DNA和总RNA的提取

取奇亚植株的嫩叶，采用十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)法提取基因组总DNA，采用1.0％琼脂糖凝胶电泳法和分光光度法评价核酸样品的质量和浓度。结果显示，提取的奇亚基因组总DNA的完整性好，平均分子量略大于λ-HindIII DNA Marker的23kb条带，RNA消化完全，分光光度法检测其纯度也较高，可用于PCR扩增。

同时，以奇亚的根(Ro)、茎(St)、叶(Le)、蕾(Bu)、花(Fl)、早期种子(ES)、中期种子(MS)、后期种子(LS)为材料，分别采用小量植物组织RNA抽提试剂盒提取总RNA，用DNase I去除总RNA中含有的DNA杂质，电泳检测总RNA的质量，紫外分光光度计测定总RNA的浓度和纯度。电泳检测表明获得的总RNA特征条带清晰，无明显RNA降解和DNA污染，分光光度法检测评价的质量也较好，能够满足后述实验的要求，然后储存于-80℃冰箱备用。

(2)奇亚种子RACE总cDNA第一链的获得

取奇亚各器官的总RNA各1μg混合，采用SMARTer^TMRACE cDNA Amplification Kit按照其说明书操作，分别得到5'-RACE-Ready cDNA和3'-RACE-Ready cDNA第一链备用。

(3)ShFAD2家族和ShFAD3家族5’-cDNA末端和3’-cDNA末端的RACE扩增

ShFAD2家族的5’-RACE：通过Vector NTI Advance9.0/11.51对GenBank中的芝麻(Sesamumindicum)、琉璃苣(Borago officinalis)、橄榄(Olea europaea)、大花亚麻(Linum grandiflora)、葡萄(Vitis vinifera)、大豆(Glycine max)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)等植物的FAD2基因进行多重比对，根据保守点设计简并引物，设计了克隆ShFAD2基因家族5’-cDNA末端的2个反向引物RPD125-1和RPD125-2，其引物序列如表1所示。然后以5'-RACE-Ready cDNA 1μL为模板，用引物组合UPM+RPD125-1进行ShFAD2家族的5’-RACE第一次PCR扩增。PCR反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，28个循环；72℃延伸10min。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果显示第一次PCR扩增后获得很弱的smear。取第一次PCR扩增产物0.1μL为模板，用引物组合NUP+RPD125-2对ShFAD2家族进行5’-RACE巢式PCR扩增，PCR反应程序同第一次PCR扩增，但退火温度为65度，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。由图1可以看出，扩增获得一条约500bp的特异条带，与根据其它植物FAD2基因序列长度相近。回收扩增产物，经TA克隆后转化大肠杆菌。然后通过PCR筛选阳性克隆子，克隆子之间呈现插入片段长度的多态性，每种长度均选取克隆子送样测序。测序结果除去试剂盒接头序列后，发现5’-cDNA均来自同源性高但又差异显著的2条基因(分别命名为ShFAD2-1和ShFAD2-2)，ShFAD2-1的5’-cDNA末端净长度为468bp、421bp，ShFAD2-2的5’-cDNA末端净长度为456bp、408bp、403bp、401bp，且短片段包含在长片段内，基因内的5’-cDNA长度多态性是由于不同mRNA分子的转录起始位点的早与迟引起的。

ShFAD3家族的5’-RACE：方法同前，引物序列见表1。引物组合LUPM+RPD155-1的5’-RACE初次扩增只产生很弱的smear，没有明显的条带。引物组合NUP+RPD155-2的巢扩在500bp左右产生特异条带(图1)，胶回收、TA克隆、细菌转化后，PCR阳性克隆子之间呈现插入片段长度的多态性，每种长度均选取克隆子送样测序。测序结果除去试剂盒接头序列后，发现5’-cDNA均来自同源性高但又差异显著的2条基因(分别命名为ShFAD3-1和ShFAD3-2)，ShFAD3-1的5’-cDNA末端净长有513、507bp，ShFAD3-2的5’-cDNA末端净长有574、505、503、501bp，基因内的5’-cDNA长度多态性是由于不同mRNA分子的转录起始位点的早与迟引起的。

ShFAD2家族的3’-RACE。如上法分析植物FAD2基因保守区序列后，设计2个正向引物：FPD123-1、FPD123-2，其引物序列如表1所示。以3'-RACE-Ready cDNA 1μL为模板，用引物组合FPD123-1+UPM进行ShFAD2家族的3’-RACE第一次PCR扩增，反应程序同5'-RACE一扩，但退火温度为55℃，电泳显示没有明显条带。取第一次PCR扩增产物0.1μL为模板，用引物组合FPD123-2+NUP进行ShFAD2家族的3’-RACE的巢式PCR扩增，PCR反应程序同第一次PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果显示，电泳获得1条约480bp的亮带，与根据其它植物FAD2基因序列预测的长度相近(图1)。将扩增产物进行胶回收，TA克隆后转化大肠杆菌，然后对插入片段进行PCR检测。结果表明，获得的单斑克隆子间存在插入长度的多态性，每种长度均选取克隆子送样测序。测序结果除去试剂盒接头序列后，发现3’-cDNA也是来自2条基因，ShFAD2-1的3’-cDNA末端净长度574bp、548bp、497bp、493bp、473bp、471bp、453bp、448bp、136bp这9种(不计poly A，下同)，ShFAD2-2的3’-cDNA末端净长度为469bp、451bp、450bp、447bp这4种，基因内的3’-cDNA末端长度多态性是由于不同mRNA分子的poly A加尾位点的早与迟引起的。

ShFAD3家族的3’-RACE：方法同前，引物序列见表1。引物组合FPD153-1+UPM的初次扩增没有明显的条带，仅有一些smear。引物组合FPD153-2+NUP的巢扩在约520bp处产生了一条特异的亮带(图1)，胶回收、TA克隆、细菌转化后，PCR阳性克隆子之间呈现插入片段长度的多态性，每种长度均选取克隆子送样测序。测序结果除去试剂盒接头序列后，发现3’-cDNA也是来自2条基因，ShFAD3-1的3’-cDNA末端净长有386、391、417、441、477、500、502、510bp，ShFAD3-2的3’-cDNA末端净长有445、442bp，基因内的3’-cDNA末端的长度多态性是由于不同mRNA分子的poly A加尾位点的早与迟引起的。

(4)ShFAD2家族和ShFAD3家族全长cDNA和gDNA的克隆

根据ShFAD2家族5’-RACE、3’-RACE的测序结果，设计了ShFAD2家族全长cDNA和gDNA的扩增的引物组合FShFAD2-1+RShFAD2-1和FShFAD2-2+RShFAD2-2，其引物序列如表1所示。以3'-RACE-Ready cDNA 1μL为模板，用引物组合FShFAD2-1+RShFAD2-1和FShFAD2-2+RShFAD2-2分别扩增ShFAD2-1和ShFAD2-2的全长cDNA，PCR反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果显示(图1)，扩增获得了1条约1.5kb的特异条带。将扩增产物进行胶回收，经TA克隆后转化大肠杆菌，阳性克隆子进行测序。结果表明，ShFAD2-1/ShFAD2-2的全长cDNA为1642/1526bp。将模板替换为奇亚基因组总DNA1μL，分别用引物组合FShFAD2-1+RShFAD2-1和FShFAD2-2+RShFAD2-2进行PCR扩增，引物组合FShD12-1+RShD12-1扩出一条约3700bp特异条带(图1)，TA克隆测序表明ShFAD2-1全长gDNA为3769bp。引物组合FShD12-2+RShD12-2多次重复后仍没有明显条带，原因可能是基因组序列长度太长或存在高级结构。利用引物组合FShD12-2+RPD125-2、FLD12+RShD12-2进行分段扩增，分别得到了约3000bp和1500bp的特异条带(图1)，TA克隆测序、拼接表明ShFAD2-2全长gDNA为4226bp。

根据ShFAD3家族5’-RACE、3’-RACE的测序结果，分别设计了ShFAD2-1和ShFAD2-2全长cDNA和gDNA的扩增的引物组合FShFAD3-1+RShFAD3-1和FShFAD3-2+RShFAD3-2，其引物序列如表1所示。以3’-RACE总cDNA为模板，分别扩增ShFAD3-1、ShFAD3-2的全长cDNA，电泳显示均得到了预期大小一致的特异条带。胶回收、TA克隆和测序后，ShFAD3-1为1498bp，ShFAD3-2为1495bp。将模板替换为奇亚基因组总DNA，其它条件不变，引物组合FShFAD3-1+RShFAD3-1和FShFAD3-2+RShFAD3-2分别扩增得到了约3.7kb和2.6kb的特异条带，回收、TA克隆和测序后，ShFAD3-1为3691bp，ShFAD3-2为2563bp，与全长cDNA比对后显示它们均有7个内含子。

表1、奇亚ShFAD2家族和ShFAD3家族的克隆引物

实施例2、ShFAD2家族和ShFAD3家族的生物信息学分析

序列拼接和比对、开放阅读框ORF的查找和翻译、核酸蛋白分子参数计算、序列比对以及其他的生物信息学分析主要在Vector NTI Advance9.0/11.51和DNAStarversion7.1.0上进行。保守域搜索、基因或蛋白结构预测、BLAST分析主要在以下网站上进行：NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)、Expasy(www.expasy.org)、CBS(http://www.cbs.dtu.dk/services/)、Pfam、SOPMA和GSDS2.0等。在SeaView4.0上用BioNJ法构建蛋白系统树，bootstrap重复次数为1000。

(1)ShFAD2家族和ShFAD3家族的结构和核酸特征

奇亚FAD2家族存在两个成员基因：ShFAD2-1和ShFAD2-2。ShFAD2-1最长版本mRNA为1642bp(不计poly A尾巴，下同)(SEQ ID NO.1)，其中A₁、T₄₇为转录起始位点，最长5’UTR(非翻译区)为139bp，C₁₅₀₁、C1516、C₁₅₂₁、T₁₅₄₁、G₁₅₆₂、T₁₅₆₇、T₁₆₁₇、C₁₆₄₂为poly A加尾位点，最长3’UTR为351bp，存在4个仅相差一个碱基的疑似poly A加尾信号A₁₄₆₄ATAAG、A₁₅₃₈ATTAA、A₁₅₄₂ATAAT、A₁₅₉₁TTAAA，ORF为1152bp(图2，A)。它的基因组序列为3769bp，与mRNA两两比对后发现，在5’UTR中存在一个内含子，长度为2127bp，边界为标准的GT…AG格式。另外ShFAD2-1的5’-UTR中还存在三个嘧啶串和一个SSR重复序列[CAC]₆。ShFAD2-1基因编码区的GC含量达到51.13％，5’UTR的GC含量60.43％，3’UTR的GC含量35.33％，内含子的GC含量33.47％，符合功能基因的典型特征。ShFAD2-2最长版本mRNA为1526bp(SEQ ID NO.3)，其中A₁、A₅₀、G₅₅、A₅₇为转录起始位点，最长5’UTR为128bp，T₁₅₀₄、G₁₅₀₇、T₁₅₀₈、G₁₅₂₆为poly A加尾位点，最长3’UTR为246bp，存在2个仅相差一个碱基的疑似poly A加尾信号A₁₄₈₃ATAAG、A₁₄₉₄ATAAC，ORF为1152bp(图2，B)。它的基因组序列为4226bp，与mRNA两两比对后发现，在5’UTR中存在一个内含子，长度为2700bp，边界为标准的GT…AG格式。ShFAD2-2 5’-UTR中还存在一个嘧啶串。ShFAD2-2基因编码区的GC含量达到50.17％，5’UTR的GC含量57.03％，3’UTR的GC含量35.77％，内含子的GC含量34.96％，符合功能基因的典型特征。两两比对表明，ShFAD2-1和ShFAD-2在全长gDNA、全长mRNA、编码区水平上的一致率分别为66.3％、84.7％、89.8％，说明二者之间是有较高同源性但差异显著的基因家族成员。

如图2中C和D所示，奇亚ShFAD3家族有两个成员基因：ShFAD3-1和ShFAD3-2。二者的全长cDNA分别为1498bp和1495bp，如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.7所示；ORF分别为1182bp和1152bp，分别有2和4个可变性转录起始位点，最长5’UTR分别为34bp和125bp，分别有8和2个可变性poly A加尾位点，最长3’UTR分别为282bp和218bp，均有一个标准的Poly A加尾信号AATAAA。ShFAD3-1和ShFAD3-2的gDNA分别为3691bp和2563bp，7个内含子的边界均为标准的GT…AG格式。ShFAD3-1与ShFAD3-2之间在全长gDNA、全长cDNA、编码区水平的一致率分别为55.2％、86.1％和90.4％，说明二者之间是有较高同源性但差异显著的基因家族成员。

(2)ShFAD2家族蛋白和ShFAD3家族蛋白的结构特征

ShFAD2-1蛋白为383个氨基酸(SEQ ID NO.2)，分子量为43.78kD，等电点为8.52，呈碱性，酸性和碱性氨基酸数目分别占8.36％、9.40％。ShFAD2-2蛋白为383个氨基酸(SEQID NO.4)，分子量为43.71kD，等电点为8.36，呈碱性，酸性、碱性氨基酸数目分别占8.09％、8.88％。NCBI保守域搜索表明ShFAD2-1/ShFAD2-2包含一个PLN02505保守域和FA_desaturase保守域。SignalP4.1预测表明ShFAD2-1/ShFAD2-2不包含信号肽，而TargetP1.1预测它定位在除叶绿体、线粒体、分泌蛋白以外的其它位置。TMHMM2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测表明，ShFAD2-1/ShFAD2-2存在6/4个强的跨膜域。NetPhos2.0预测ShFAD2/ShFAD2-2均存在20个潜在的磷酸化位点(ShFAD2-1含有11个S、9个Y，ShFAD2-2含有10个S、10个Y)。SOPMA软件预测，ShFAD2-1/ShFAD2-2的二级结构主要为α-螺旋(35.77/32.64％)和随机卷曲(34.99/33.94％)，还有少量延伸链(21.93/25.85％)和β-转角(7.31/7.57％)。ShFAD2-1/ShFAD2-2包含三个组氨酸基序，该基序存在于所有膜结合FAD蛋白，包含8个铁离子结合位点，它们对维持脱饱和酶的活性至关重要。此外，ShFAD2-1/ShFAD2-2同芝麻SiFAD2-1和拟南芥AtFAD2氨基酸序列一样，C端均含有内质网保留基序(-YNNKL)。

推导的ShFAD3-1蛋白包含393aa(SEQ ID NO.6)，分子量为44.87kDa，等电点为7.50。ShFAD3-2蛋白包含383aa(SEQ ID NO.8)，分子量为43.98kDa，等电点为7.53。SMART和Pfam数据库搜索表明，ShFAD3-1/ShFAD3-2均存在保守域DUF3474(Pfam：PF11960)和FA_desturase(PF00487；PfFAD8b除外)。存在于细菌和真核生物中的功能未知保守域DUF3474总与FA_desaturase伴随发生。与拟南芥ω-3 FAD家族蛋白相同，ShFAD3-1/ShFAD3-2均包含3个组氨酸基序HDCGH、HRTHH和HVI(V)HH，它们在维持FAD活性和形成氧激活和氢消除所需的二铁配基部分活性中心扮演重要角色。与拟南芥AtFAD3不同，ShFAD3-1/ShFAD3-2不存在C端ER滞留信号-KSKIN，估计已进化成为另一种ER滞留信号序列。NetPhos2.0预测表明，ShFAD3-1/ShFAD3-2均存在23/21个潜在的磷酸化位点。SOPMA软件预测，ShFAD3-1/ShFAD3-2的二级结构主要为α-螺旋(43.51/42.04％)和随机卷曲(37.40/39.69％)，还有少量延伸链(13.23/13.84％)和β-转角(5.85/4.44％)。

(3)ShFAD2家族和ShFAD3家族的同源性分析

BLASTn和BLASTp分析表明，ShFAD2-1、ShFAD2-2与多种其它植物FAD2基因在核酸和蛋白水平有高同源性。植物FAD2分为看家型(或组成型)和种子型。选取代表性的双、单子叶植物的FAD2蛋白构建了系统树，如图3中A所示，ShFAD2-1、ShFAD2-2先与芝麻SiFAD2-1、油橄榄FAD2-2聚为一支，属于看家型(组成型)FAD2。同时也证实了奇亚与芝麻、油橄榄的亲缘关系较近，因为同属唇形目。

BLASTn和BLASTp分析表明，ShFAD3-1、ShFAD3-2与多种其它植物FAD3基因在核酸和蛋白水平有高同源性，也与植物FAD7和FAD8有较高的同源性。Vector NTI Advance9.0/11.5上的两两比对表明(图3，B)，蛋白水平ShFAD3-1/ShFAD3-2与AtFAD3的一致率为66.1％/66.2％，相似率为75.4％/76.8％。蛋白系统树上，ShFAD3-1、ShFAD3-2首先与唇形目芝麻的FAD3聚在一起，然后是橄榄和向日葵的FAD3，然后再与其它双子叶植物FAD3聚在一起，而与双子叶植物的FAD7和FAD8相对较远。

实施例3、ShFAD2家族和ShFAD3家族表达器官特异性的荧光定量PCR检测

奇亚的根(Ro)、茎(St)、叶(Le)、蕾(Bu)、花(Fl)、早期种子(ES)、中期种子(MS)、后期种子(LS)的总RNA，用RNase-free DNase I按其说明书处理以消除DNA污染。取每个器官的总RNA各1μg混匀，采用PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser进行去gDNA和反转录，获得总cDNA第一链用于基因表达检测。荧光定量PCR检测在CFX96型定量PCR仪上进行，试剂盒为FastStart Essential DNA Green Master(Roche)，以引物组合F25SRT+R25SRT为内标进行扩增，ShFAD2-1、ShFAD2-2基因的定量PCR引物组合分别为FShD12-1q+RShD12-1q、FShD12-2q+RShD12-2q，ShFAD3-1、ShFAD3-2基因的定量PCR引物组合分别为FShFAD3-1q+RShFAD3-1q、FShFAD3-2q+RShFAD3-2q，引物序列见表2所示。参照说明书，10μL反应体系包含：2.5μL cDNA(稀释40倍)、正向引物和反向引物(均为10μM)各0.5μL、5μLMaster Mix、1.5μL ddH₂O。采用两步法进行扩增，循环参数如下：95℃10min；95℃15s，62℃30s，42个循环；最后添加熔解曲线。每个样品均为三个独立的重复。数据通过CFXManager3.1(Bio-Rad,USA)软件采用2^-ΔΔCT方法进行分析。

荧光定量RT-PCR检测结果如图4所示，ShFAD2-1和ShFAD2-2在各个组织器官均表达，ShFAD2-1更接近组成型，但在蕾、花、早期种子中优势表达，ShFAD2-2在花、早期种子中的表达远远高于其它器官。ShFAD2家族的两个成员出现了功能歧化，ShFAD2-2更侧重于花发育和种子储存性脂肪酸的生物合成，而ShFAD2-1在多种生殖和营养器官的FA合成中均扮演重要角色。ShFAD3-1在早期种子中的表达水平最高，其次是茎，在中期种子、花、蕾中也表达，在后期种子、叶、根中表达很弱。ShFAD3-2在早期种子中表达最高，其次是中期种子，在蕾、花、茎中也表达，在后期种子、叶、根中表达很弱。

表2、ShFAD2家族和ShFAD3家族荧光定量PCR引物

实施例4、ShFAD2家族和ShFAD3家族编码蛋白活性的酵母表达检测

由于ShFAD2家族两个成员基因间在起始密码子和终止密码子处高度相似，因此设计一对引物FShD12Y+RShD12Y通用于扩增2个成员基因的酵母表达片段；ShFAD3-1、ShFAD3-2酵母表达片段的引物组合分别为FShFAD3-1Y+RShFAD3-1Y和FShFAD3-2Y+RShFAD3-2Y，引物序列如表3所示。以ShFAD2-1、ShFAD2-2全长cDNA克隆子为模板，分别扩增ShFAD2-1、ShFAD2-2的酵母表达目的片段。以ShFAD3-1、ShFAD3-2全长cDNA克隆子为模板，分别扩增ShFAD3-1、ShFAD3-2的酵母表达目的片段。胶回收后与pGEM-T easy进行TA克隆，分别得pGEM-T-ShFAD2-1Y、pGEM-T-ShFAD2-2Y和pGEM-T-ShFAD3-1Y、pGEM-T-ShFAD3-2Y，经测序证明序列没有突变后，进行下一步酵母表达载体构建。

表3、ShFAD2家族和ShFAD3家族酵母表达引物

用限制性内切酶BamHI和XbaI完全双酶切质粒pYES2.0、pGEM-T-ShFAD2-1Y、pGEM-T-ShFAD2-2Y，回收pYES2.0的线性骨架载体、目的基因片段ShFAD2-1Y和ShFAD2-2Y，然后用T₄ DNA连接酶将载体骨架分别与2个目的基因片段进行连接，转化大肠杆菌，分别获得对应的酵母表达载体pYES2-ShFAD2-1Y、pYES2-ShFAD2-2Y，采用Invitrogen公司的方法，进行酿酒酵母菌株INVScl的感受态制备和转化，经选择培养基SD-Ura筛选，分别获得转化子菌液，再分别进行PCR检测，获得表达菌株。使用LiAc-半乳糖诱导方法对携带重组质粒pYES2-ShFAD2-1Y、pYES2-ShFAD2-2Y、对照质粒pYES2.0的酵母表达菌株进行诱导，添加OA底物后进行培养，然后收集三种菌株的菌体进行甲酯化，用气相色谱仪对脂肪酸组分和含量进行分析。酿酒酵母由于缺乏内源FAD2活性，所以不能合成LA。转pYES2.0的对照酵母没有检测到LA，而转重组质粒的酵母均比对照多出LA组份。采用面积归一化法计算结果(表4)，转ShFAD2-1酵母中LA占总FA的9.25％，转ShFAD2-2酵母中LA占总FA的12.39％，催化转化率分别为15.70％和20.14％。证明奇亚ShFAD2-1、ShFAD2-2两个基因均编码有功能的Δ12 FAD，即催化OA形成LA，但ShFAD2-2的酶活性更高。

表4、ShFAD2家族和ShFAD3家族酵母表达的脂肪酸组份(％)

ShFAD3-1、ShFAD3-2的ORF分别被插入到pYES2.0中启动子PGAL1之后，然后转化酵母。转基因酵母FA组分的GC检测表明，转空载体的酵母没有出现ALA峰，而转pYES2-ShFAD3-1Y、pYES2-ShFAD3-2Y的酵母均出现了ALA新峰，对应的在总脂肪酸中ALA含量(％)分别为3.30±0.06％、5.20±0.59％，LA到ALA的转化比率(％)分别为11.60±1.04％、16.91±2.22％(表4)。这表明ShFAD3-1、ShFAD3-2均编码一个有功能的LA Δ15 FAD，即催化LA形成ALA，但ShFAD3-2的酶活性更高。

实施例5、利用LP4-2A技术融合双价表达奇亚ShFAD2和ShFAD3大幅提高菜籽油的ALA含量

(1)改造pCAMBIA2301载体获得新型植物表达平台载体pC2301M1NPB

pCAMBIA2301、pBI121、pFGC5941均为广泛应用的商业化植物表达载体，本课题组此前已利用它们创建了种子特异启动子P_NAP驱动的植物表达平台载体pC2301M1NPB，构建流程详见文献【Fu C,Chai YR,Ma LJ,et al.Evening primrose(Oenothera biennis)Δ6fatty acid desaturase gene family:cloning,characterization,and engineeredGLA and SDA production in a staple oil crop.Mol Breeding,2017,37:83.https://doi.org/10.1007/s11032-017-0682-0】，本发明利用该平台载体来装载目标基因和进行植物转化。

(2)融合蛋白基因ShFAD2-LP-2A-ShFAD3植物表达载体的构建和工程菌株的获得

设计如SEQ ID NO.9所示、基于芸薹属偏爱密码子的连接肽-内含肽序列LP4-2A(84bp)，其起始27bp编码凤仙花(Impatiens balsamina L.)种子抗菌肽前体蛋白的LP4连接肽N端9个氨基酸，随后的57bp编码口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)2A内含肽C端19个氨基酸(SEQ ID NO.10)。由于该片段很短，因此实际构建重组DNA方案时，将其拆分成两段后分别融入待融合的上游基因的反向引物和下游基因的正向引物中。

表5植物表达载体构建与检测所用的引物

如图5中A所示，将ShFAD2-1、ShFAD2-2任意之一的全编码区(含起始密码子，但不含终止密码子)与ShFAD3-1、ShFAD3-2任意之一的全编码区(含或不含起始密码子均可，但含终止密码子)，通过LP4-2A序列而串联到同一个开放读码框(ORF)中，共可产生4种版本的融合蛋白基因ShFAD2-LP4-2A-ShFAD3(即ShFAD2-1-LP4-2A-ShFAD3-1、ShFAD2-1-LP4-2A-ShFAD3-2、ShFAD2-2-LP4-2A-ShFAD3-1、ShFAD2-2-LP4-2A-ShFAD3-2)。前面的酵母表达表明，ShFAD2-2、ShFAD3-2相比ShFAD2-1、ShFAD3-1为酶活性更高的优势基因，因此优选实施例(但不限于优选实施例)构建了融合蛋白基因ShFAD2-2-LP4-2A-ShFAD3-2(SEQ IDNO.11)并转化油菜。

以ShFAD2-2全长cDNA克隆子菌液为模板，采用引物组合FShFAD2O+R2ALP4ShFAD2(序列见表5)扩增融合蛋白基因上游片段ShFAD2-2-LP4-2A；以ShFAD3-2全长cDNA克隆子菌液为模板，采用引物组合F2AShFAD3+RShFAD3-2(序列见表5)扩增目融合蛋白基因下游片段2A-ShFAD3-2，亚克隆方法同前。其中，LP4是来自凤仙花的连接肽序列，2A来自口蹄疫病毒的内含肽序列。含有经测序验证无误的pGEM-T-ShFAD2-2-LP4-2A、pGEM-T-2A-ShFAD3-2和pC2301M1NPB重组子的单克隆子经培养到对数晚期后，采用质粒DNA提取试剂盒提取质粒。取pGEM-T-ShFAD2-2-LP4-2A质粒、pGEM-T-2A-ShFAD3-2质粒和pC2301M1NPB质粒，分别进行XbaI+HindIII、HindIII+XmaI和XbaI+XmaI双酶切至完全，电泳后分别回收1.2kb的ShFAD2-2-LP4-2A目的片段、1.3kb的2A-ShFAD3-2目的片段、14kb开环的pC2301M1NPB骨架，采用T₄DNA连接酶将三者于16℃连接12h，得到重组质粒pC2301M1NPB-ShFAD2-2-LP4-2A-ShFAD3-2(简称pCN-ShFAD2-2-ShFAD3-2)，转化DH5α，采用引物组合FNAP+RNOS5N、FShFAD2O+RShFAD3-2对克隆子进行菌液检测，分别扩增得到符合理论预期的3.6kb、2.4kb特异条带，表明双阳性克隆子含有正确的重组质粒。抽提该阳性克隆子的质粒，利用液氮冷激法转化根癌农杆菌LBA4404，经多元PCR检测后得到pC2301M1NPB-ShFAD2-2-LP4-2A-ShFAD3-2的工程菌株。

(3)农杆菌介导融合蛋白基因ShFAD2-2-LP4-2A-ShFAD3-2转化甘蓝型油菜及检测

所有组织培养操作均在标准的植物组织培养条件下进行，超净工作台、培养间、驯化间的洁净级别分别为100级、10000级和100000级，相应试剂、材料、器皿均按规程进行无菌处理。甘蓝型油菜典型品种中双10号的种子用体积分数为75％的乙醇表面消毒1min后用无菌水冲洗3次，然后用质量分数为5％的次氯酸钠浸泡20min，用无菌水冲洗干净后接种于MS固体培养基[MS粉4.41g/L+Phytagel2.6g/L+蔗糖30.0g/L，pH5.8；不加Phytagel即为液体培养基]中，于25℃、2000 Lux光照、16h/d光周期培养(后面的组培间培养条件除特别注明者外，均与此相同)。切取苗龄8d左右甘蓝型油菜品种中双10号无菌苗的下胚轴切成长0.5～1.0cm的小段，接种到预培培养基MSp[MS培养基+1.0mg/L6-苄基氨基嘌呤(6-BA)+1.0mg/L2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)]预培养3d。

取根癌农杆菌工程菌株(含有质粒pC2301M1NPB-ShFAD2-2-LP4-2A-ShFAD3-2)在加有100mg/L Kan+20mg/L Str+40mg/L Rif的LB液体培养基中于28℃、250r/min振荡培养1～2d，使农杆菌生长至对数期，转接培养一次。然后在5000rpm条件下室温离心10min，收集菌体，菌体用浸染培养基MSm[MS液体培养基+1.0mg/L2,4-D+1.0mg/L6-BA+100μmol/L AS(乙酰丁香酮)]调节细菌浓度至OD₆₀₀约0.5左右，即为浸染液。

将预培养后的下胚轴段浸入浸染液中5-10min，间歇性轻轻摇荡，然后将下胚轴段在灭菌纸上吸干多余菌液，接种到共培培养基MSc[MS固体培养基+2.0mg/L6-BA+0.5mg/L萘乙酸(NAA)]中，23.5℃暗培养48h。用杀菌液体培养基MSk[MS液体培养基+1.0mg/L2,4-D+1.0mg/L6-BA+500mg/L Cef]浸泡洗涤外植体3×10min，用灭菌纸吸干表面液体，转接到诱导筛选培养基MSi[MS固体培养基+1.0mg/L6-BA+1.0mg/L2,4-D+500mg/L Cef(头孢噻肟钠)+12.5mg/L Basta+6mg/L AgNO₃]培养，约2周继代1次，至长出肉眼可见的抗性愈伤，再转接到分化培养基MSd[MS固体培养基+4.0mg/L6-BA+2.0mg/L玉米素(ZT)+

5.0mg/L AgNO₃+500mg/L Cef+12.5mg/L Basta]中培养14d以上，诱导愈伤组织分化出小芽，再转接到茎分化培养基MSs(MS固体培养基+3.0mg/L6-BA+2.0mg/L ZT+500mg/LCef+12.5mg/L Basta)培养至长出小茎，再转接到长茎培养基MSe(MS固体培养基+0.05mg/L

6-BA+500mg/L Cef+12.5mg/L Basta)中培养至长出无根小苗，再转接到生根培养基MSr

[MS固体培养基+2mg/L萘乙酸(NAA)]培养至长出发达根系，生根后的小苗经驯化后，移栽到含有灭菌珍珠岩、蛭石、草炭土混合物(质量比为1:1:1)的盆钵中，按温室盆栽进行管理。

最终，pC2301M1NPB-ShFAD2-2-LP4-2A-ShFAD3-2转化甘蓝型油菜中双10号后，获得一批再生植株；对再生植株叶片滴加200mg/L Basta溶液检测抗性，切取再生植株的叶块进行GUS组织化学染色，并提取再生植株的叶片基因组总DNA分别采用引物组合FNAP+

RShFAD3-2进行PCR检测，结果表明获得6株三重阳性的转基因植株。提取转基因植株开花后30d的种子，提取总RNA，如前面的方法进行去gDNA、反转录及目标基因ShFAD2-2和ShFAD3-2表达水平进行qRT-PCR检测，结果表明这6株转基因植株中外源转基因均显著表达。

对转基因阳性植株进行全面的生物学和农艺学观察，上述转基因植株均未出现明显的副作用，外观生物学和农学性状与非转基因对照植株没有明显差异。采用气相色谱法对转基因油菜成熟种子进行脂肪酸GC分析，发现与非转基因阴性对照植株(NT/CK)相比，T₁代转基因油菜成熟种子的ALA的GC峰高得多(见图5中B)，采用面积归一化法计算得知ALA平均占总脂肪酸的23.93％(16.08％-31.04％，植株S22-3最高，表6)，而对照仅为7.83％，转基因为非转基因的3.06(2.03-3.91)倍。

对转基因当代植株进行自交繁殖，采用与转基因当代植株一样的叶片滴加Basta抗性检测和GUS染色检测，筛选鉴定出转基因油菜纯合优株系，GC检测表明，T₂代转基因成熟种子总脂肪酸中ALA的平均为28.82％(21.50％-34.63％，最优株系为S22-3-3)，对照仅为7.58％，转基因为非转基因的3.80(2.84-4.57)倍。T₂代转基因株系再自交获得T₃代转基因纯合株系，GC检测表明成熟种子总脂肪酸中ALA的平均为31.61％(23.79％-42.72％，最优株系为S22-3-3-4)，对照仅为8.17％，转基因为非转基因的3.87(2.91-5.23)倍。

表6非转基因和转ShFAD2-2-LP4-2A-ShFAD3-2 T₁代油菜种子脂肪酸的组分(占总脂肪酸的％)

以上事实说明，融合蛋白基因ShFAD2-2-LP4-2A-ShFAD3-2转化油菜后获得了种子ALA含量提高几倍的转基因植物新材料，表明利用LP4-2A技术融合双价表达奇亚ShFAD2和ShFAD3，可以创制高产ALA的稳定遗传的转基因植物新资源材料，且纯合后代株系比当代(杂合)单株的转基因性状更好，达到了代谢工程分子育种的目的。

其它说明

这里特别申明，应用形式上的如下改变也都必然属于本发明的精神和范围所覆盖：

1、本发明中的基因和其片段，除了SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQID No.7以外，也包括来自于奇亚的其它ShFAD2、ShFAD3等位基因序列，包括来自于奇亚的其它亚种、生态型、品种、杂交种的ShFAD2、ShFAD3基因序列，也包括来自于鼠尾草属的近缘物种中与本发明的ShFAD2、ShFAD3序列高度相似的基因序列(ORF全编码区水平一致率大于97％)，尽管它们与SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7可能有小的差异。

2、本发明中的基因和其片段，也包括与SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11在连续80bp及以上有98.00％以上一致性的任意核苷酸序列。

3、本发明中的基因和其片段，也包括编码蛋白与SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10有100％一致率的人工合成核苷酸序列。

4、本发明中的基因和其片段，除了象优先实施例中所举的用于奇亚、甘蓝型油菜以外，还可以应用于其它物种。

5、本发明中的融合蛋白基因重组方案，除了象优先实施例中所举的ShFAD2-2与ShFAD3-2经LP4-2A串联而成为融合蛋白基因ShFAD2-2-LP4-2A-ShFAD3-2，还包括将ShFAD2-1、ShFAD2-2任意之一的全编码区(含起始密码子，但不含终止密码子)与ShFAD3-1、ShFAD3-2任意之一的全编码区(含或不含起始密码子均可，但含终止密码子)，通过LP4-2A序列而串联到同一个开放读码框(ORF)中，共可产生4种版本的融合蛋白基因ShFAD2-LP4-2A-ShFAD3。

6、本发明中的ShFAD2、ShFAD3基因和其片段，除了象优先实施例中所举的双价融合蛋白正义转化进行超量表达和异源表达外，还可以采用单价超量表达和异源表达方式来提高植物的LA或ALA含量，也可以采用反义RNA、RNA干扰、基因组编辑(ZFN、TALEN、CRISPR-Cas)等方法，来介导鼠尾草属植物内源FAD2、FAD3基因或基因家族的沉默，阻止LA和ALA的合成，创造种子高油酸或高亚油酸含量的鼠尾草属植物。

7、本发明中的基因和其片段，除了优选实施例中所举的采用pC2301M1NPB进行植物表达载体构建以外，还可以采用其它载体来进行植物表达载体构建；本发明中的载体构建物，除了象优先实施例中所举的采用根癌农杆菌菌株LBA4404介导的改良叶盘法进行遗传转化以外，也可以采用其它方法进行植物遗传转化。

8、本发明应用实例所取得的效应参数值仅指采用实例中的品种作为外植体进行转基因操作的结果，如果采用其它品种(如超高油酸或超高亚油酸品种)作为外植体进行转基因操作，会取得更优的操作效果参数值。

最后说明的是，以上实施例仅用以举例说明本发明的技术方案，但并非限制于此。尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

序列表

<110> 西南大学

<120> ShFAD2基因家族和ShFAD3基因家族在创制高产ALA的转基因植物中的应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1642

<212> DNA

<213> 奇亚(Salvia hispanica)

<400> 1

agtcgcctcg cctctattta taacgctgtg gtgccggcca ctccactcct ctcttctctt 60

caccgcaccc cttcctttct ctcaccacca ccaccaccac cgctcctccg gagagcctcc 120

cgctctaggt cgctgaacaa tgggtgctgg agggcgtatg tctgtacccc ctgccgataa 180

gaaggcaaag tctgacgtca tccaacgagt tccgcacgca aagcctccat ttacacttgg 240

cgagatcaag aaagctattc caccccattg tttcaagcga tctattcctc gttcattttc 300

ctacgtcgtg tatgacctta tcattgcctc tctgttttac tatgtcgcaa caaactacat 360

ccatcagctc ccccagcctc tctcctacct agcctggact ctttatggga tatgccaagg 420

ttgtatccta accggtgttt gggtccttgc ccatgaatgt ggccaccatg ccttcagtga 480

ttaccaatgg ctagatgaca ctgttggtct aatcctgcac tcatttctcc tcgtgccgta 540

cttctcttgg aaatacagcc accgccgcca ccactcaaac accggctcac ttgagcggga 600

cgaggtgttt gtccccaagg tcaagtcagg ggtcagctgg actgccaagt acatgaacaa 660

cccacccggc agagtcatca ccctcatcgt ccagctcact ttaggctggc ctctatacct 720

tatgttcaac gtctccggaa ggccttacga ccgcttcgca tgccactttg acccaaaaag 780

cccgatctac tctgatcggg agcgcgcaca gattttcatc tctgatgcag gcatacttgc 840

tgtcttatat gggctgtacc gtatgtctgt agctaaagga cttgcgtggg ttctgtgtgt 900

ctatggtggc ccactgctcg tggtcaatgg gttcctcgtc ttgatcactt tcttgcagca 960

cacccaccct gccctccccc attatgactc gtcagagtgg gattggctgc gtggcgccct 1020

ggccacagtc gacagagatt atggcattct caacaccatc ttccataaca taacggatac 1080

ccacgttgca caccatctgt tctcgaccat gccgcactac catgcaatgg aggcaacaaa 1140

ggctatcaaa ccaatcctgg gaaagtacta ccagttggac gagactccgg ttttcaaggc 1200

catgtttaga gaggtgaagg aatgcatcta cgttgagccc gatgaaggtg aagagaacaa 1260

aggtgtgttc tggtacaata acaagcttta gagctgtggg gagtgttaat gtaggaaatg 1320

cagtttctgg gctgtgtttg ttgtaggaga atctgctttg ttttatttgg ctgaagtcta 1380

ggttatgttg gttgcttgtc ttagtgagta aggctcagtt agaactgtgg tgttctaaca 1440

agccttggtt catgttggat gggaataaga ccgtgtaaga actatgtgtg ttttgaagtc 1500

caaacttcga cttgtcaaag caaagttttt tttttttaat taataattat agtagtataa 1560

ggaatgtata atagcagtgt actaattttg attaaactct agctcatatt tttgtttact 1620

agttaccggg ctttgttttt tc 1642

<210> 2

<211> 383

<212> PRT

<213> 奇亚(Salvia hispanica)

<400> 2

Met Gly Ala Gly Gly Arg Met Ser Val Pro Pro Ala Asp Lys Lys Ala

1 5 10 15

Lys Ser Asp Val Ile Gln Arg Val Pro His Ala Lys Pro Pro Phe Thr

20 25 30

Leu Gly Glu Ile Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Lys Arg Ser

35 40 45

Ile Pro Arg Ser Phe Ser Tyr Val Val Tyr Asp Leu Ile Ile Ala Ser

50 55 60

Leu Phe Tyr Tyr Val Ala Thr Asn Tyr Ile His Gln Leu Pro Gln Pro

65 70 75 80

Leu Ser Tyr Leu Ala Trp Thr Leu Tyr Gly Ile Cys Gln Gly Cys Ile

85 90 95

Leu Thr Gly Val Trp Val Leu Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe

100 105 110

Ser Asp Tyr Gln Trp Leu Asp Asp Thr Val Gly Leu Ile Leu His Ser

115 120 125

Phe Leu Leu Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Tyr Ser His Arg Arg His

130 135 140

His Ser Asn Thr Gly Ser Leu Glu Arg Asp Glu Val Phe Val Pro Lys

145 150 155 160

Val Lys Ser Gly Val Ser Trp Thr Ala Lys Tyr Met Asn Asn Pro Pro

165 170 175

Gly Arg Val Ile Thr Leu Ile Val Gln Leu Thr Leu Gly Trp Pro Leu

180 185 190

Tyr Leu Met Phe Asn Val Ser Gly Arg Pro Tyr Asp Arg Phe Ala Cys

195 200 205

His Phe Asp Pro Lys Ser Pro Ile Tyr Ser Asp Arg Glu Arg Ala Gln

210 215 220

Ile Phe Ile Ser Asp Ala Gly Ile Leu Ala Val Leu Tyr Gly Leu Tyr

225 230 235 240

Arg Met Ser Val Ala Lys Gly Leu Ala Trp Val Leu Cys Val Tyr Gly

245 250 255

Gly Pro Leu Leu Val Val Asn Gly Phe Leu Val Leu Ile Thr Phe Leu

260 265 270

Gln His Thr His Pro Ala Leu Pro His Tyr Asp Ser Ser Glu Trp Asp

275 280 285

Trp Leu Arg Gly Ala Leu Ala Thr Val Asp Arg Asp Tyr Gly Ile Leu

290 295 300

Asn Thr Ile Phe His Asn Ile Thr Asp Thr His Val Ala His His Leu

305 310 315 320

Phe Ser Thr Met Pro His Tyr His Ala Met Glu Ala Thr Lys Ala Ile

325 330 335

Lys Pro Ile Leu Gly Lys Tyr Tyr Gln Leu Asp Glu Thr Pro Val Phe

340 345 350

Lys Ala Met Phe Arg Glu Val Lys Glu Cys Ile Tyr Val Glu Pro Asp

355 360 365

Glu Gly Glu Glu Asn Lys Gly Val Phe Trp Tyr Asn Asn Lys Leu

370 375 380

<210> 3

<211> 1526

<212> DNA

<213> 奇亚(Salvia hispanica)

<400> 3

actcacgtga gctcgcctct atttataacg ctgtggtgcc ggccacctca ctccgcaccg 60

cacctcttcc cttcccttct cccaaacagg acagacaaac ctcgcctccc tctctaggtc 120

gcttaacaat gggtgctgga gggcgtatgt ccgtaccccc tgcagagaag gcggcaaaat 180

ctgacattgt ccaacgagtt ccgcacacaa agcctccatt tacgctcggt gatatcaaga 240

aagccattcc accccattgt ttcaagcgat ccattcctcg ttcattttcc tatgtcgtat 300

atgaccttgt ctttgcctct ctgttttact atgtcgccac aaactacatc catcagctcc 360

cccacccact ctcctaccct gcctggattc tatatgggat atgtcaaggt tgcatcctaa 420

ctggtgtttg ggtcatcgct catgaatgtg gccaccatgc ctttagtgac taccaatggc 480

ttgacgacac tgtcggccta atcctgcact cattcctcct agtgccgttc ttctcttgga 540

agtacagcca ccgtcgccac cactcaaaca ctggctcact cgagcgggat gaggtgtttg 600

tccccaaggt caagacaggg gtcagctggg ctgccaagta catgaacaac ccacctggca 660

gactcatcac ccttgttgtc cagctcactc taggctggcc tctgtatctt atgttcaacg 720

tttctggaag gccttatgac cggtttgcat gccacttcga cccaaacagc cctatctact 780

ctgatcgtga acgtgctcag atattcatct ctgatgcagg cattcttgcc gtcacctatg 840

gactataccg tctgtctgta gccaaaggac ttgcctgggt tctctgtgtc tatggtggtc 900

cattactcgt ggttaatgga ttccttgtct tgatcacttt cttgcagcac acacaccctt 960

ccctccctca ctacgactca tcagagtggg actggctacg cggggcccta tccacagtcg 1020

acagagatta tggtattctc aacactgtct tccataacat aacggatacc catgttgcac 1080

atcatctgtt ctcgaccatg ccgcactacc atgcaatgga ggcgacaaag gttatcaaac 1140

caatcctggg aaagtactac cagttcgatg ggacgccagt ttttaaggcc atgttcagag 1200

aggtgaagga atgcatctat gtcgagcccg atgaaggcga ggagaacaaa ggtgtgttct 1260

ggtacaataa caagctttag agttgtggaa gcaatgtagg aaatgcagtt tctgggctct 1320

gtttgttgta ggagattctg ctttgtctat ggtttaaact ttaaagtcta ggtttgtgtt 1380

ggttgcttgt gcgttccaaa aaggtctttg ttttcatgtc agttgagtta gacttattag 1440

aactgttgtg ttctatttaa gtcttggttt atgttggatg gaaataagac tgtaataact 1500

atttatgtat tgttgtctta agccgg 1526

<210> 4

<211> 383

<212> PRT

<213> 奇亚(Salvia hispanica)

<400> 4

Met Gly Ala Gly Gly Arg Met Ser Val Pro Pro Ala Glu Lys Ala Ala

1 5 10 15

Lys Ser Asp Ile Val Gln Arg Val Pro His Thr Lys Pro Pro Phe Thr

20 25 30

Leu Gly Asp Ile Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Lys Arg Ser

35 40 45

Ile Pro Arg Ser Phe Ser Tyr Val Val Tyr Asp Leu Val Phe Ala Ser

50 55 60

Leu Phe Tyr Tyr Val Ala Thr Asn Tyr Ile His Gln Leu Pro His Pro

65 70 75 80

Leu Ser Tyr Pro Ala Trp Ile Leu Tyr Gly Ile Cys Gln Gly Cys Ile

85 90 95

Leu Thr Gly Val Trp Val Ile Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe

100 105 110

Ser Asp Tyr Gln Trp Leu Asp Asp Thr Val Gly Leu Ile Leu His Ser

115 120 125

Phe Leu Leu Val Pro Phe Phe Ser Trp Lys Tyr Ser His Arg Arg His

130 135 140

His Ser Asn Thr Gly Ser Leu Glu Arg Asp Glu Val Phe Val Pro Lys

145 150 155 160

Val Lys Thr Gly Val Ser Trp Ala Ala Lys Tyr Met Asn Asn Pro Pro

165 170 175

Gly Arg Leu Ile Thr Leu Val Val Gln Leu Thr Leu Gly Trp Pro Leu

180 185 190

Tyr Leu Met Phe Asn Val Ser Gly Arg Pro Tyr Asp Arg Phe Ala Cys

195 200 205

His Phe Asp Pro Asn Ser Pro Ile Tyr Ser Asp Arg Glu Arg Ala Gln

210 215 220

Ile Phe Ile Ser Asp Ala Gly Ile Leu Ala Val Thr Tyr Gly Leu Tyr

225 230 235 240

Arg Leu Ser Val Ala Lys Gly Leu Ala Trp Val Leu Cys Val Tyr Gly

245 250 255

Gly Pro Leu Leu Val Val Asn Gly Phe Leu Val Leu Ile Thr Phe Leu

260 265 270

Gln His Thr His Pro Ser Leu Pro His Tyr Asp Ser Ser Glu Trp Asp

275 280 285

Trp Leu Arg Gly Ala Leu Ser Thr Val Asp Arg Asp Tyr Gly Ile Leu

290 295 300

Asn Thr Val Phe His Asn Ile Thr Asp Thr His Val Ala His His Leu

305 310 315 320

Phe Ser Thr Met Pro His Tyr His Ala Met Glu Ala Thr Lys Val Ile

325 330 335

Lys Pro Ile Leu Gly Lys Tyr Tyr Gln Phe Asp Gly Thr Pro Val Phe

340 345 350

Lys Ala Met Phe Arg Glu Val Lys Glu Cys Ile Tyr Val Glu Pro Asp

355 360 365

Glu Gly Glu Glu Asn Lys Gly Val Phe Trp Tyr Asn Asn Lys Leu

370 375 380

<210> 5

<211> 1498

<212> DNA

<213> 奇亚(Salvia hispanica)

<400> 5

cttcaaactg aaaaccagct cctcgtcccc aaaaatggcc gtttcttccg gtgcccgtct 60

ctccgagagt ggcgctgaag gaggagagcc ctacgccggc caatgcgagc acctcgaagg 120

aatcggaaag cgcgccgccg acaaattcga ccccgccgcg ccgccgccgt tcaagatcgc 180

cgacatccgc gccgcgatcc cgccgcattg ctgggtgaag gaccccctcc gctccctcag 240

ctacgtcgcc tgggatctca tcgccgtcgc cgcgctcctc gccgccgccg cctacttcga 300

cagctggatc ttctggccga tctactgggc ggcccagggc accatgtttt gggccttgtt 360

cgtcctcggc cacgattgtg ggcacgggag tttttcagac agcaccacgc taaataacgt 420

ggtgggacac atactacatt cttcaattct tgtaccttat catggatggc gaattagcca 480

tcgaacacac caccagaatc atggtcacgt ggagaaggac gagtcatggg tgccgctgcc 540

tgagaattta tacaagcagc tagatttctc aactaaattc ttgagataca aaatcccatt 600

ccccatgttt gcctaccctc tctacttgtg gtatagaagt cctggaaaaa ctggatctca 660

tttcaaccca gatagcagtt tgttcaaacc caatgagaga gatttggtca tcacttccac 720

cgtttgttgg gctgcaatgg ttgcttttct cctttatgct tccaccattg ttggcccaac 780

catgttgttc aagctctacg gcgtgcctta tttgatattc gttgtgtggt tggacacggt 840

gacatatttg catcaccatg gttacgacaa gaagctgcca tggtaccgca gcaaggaatg 900

gagttattta agaggaggat tgacaacagt agatcaagac tatggaatat tcaacaaaat 960

tcaccatgat attggcaccc atgttataca ccacctcttc cctcagatcc cacactacca 1020

tttagtggaa gcgacgaggg aggcgaagag ggtgctcgga aattactaca gagagcccag 1080

aaaatctgga ccagttccat ttcacttgat tcccacattg ttgaaaagtc taagcagaga 1140

tcattatgtc agtgataatg gagacatagt ttactatcaa actgatagtc agctattttc 1200

gtcaaaagag atttagtgat gggttctaaa ataatcaaat tgtattagat ttatttcatg 1260

gtagcttttt ggggccacat tgttttaatt agagaaatga ttgtgtgcct caagaagaat 1320

tttaaataat tgtatcgagt ttttcagaat gcaattttgc tcccccttgt tttttgtttt 1380

atgattatgt aatatccctt taaataaagt ttttaggtga ttgtgtgcca gttttgtgga 1440

cttttgaaga ttacttgtat tatttaaaaa gaaaagaaga ggtttggtat attttgtt 1498

<210> 6

<211> 393

<212> PRT

<213> 奇亚(Salvia hispanica)

<400> 6

Met Ala Val Ser Ser Gly Ala Arg Leu Ser Glu Ser Gly Ala Glu Gly

1 5 10 15

Gly Glu Pro Tyr Ala Gly Gln Cys Glu His Leu Glu Gly Ile Gly Lys

20 25 30

Arg Ala Ala Asp Lys Phe Asp Pro Ala Ala Pro Pro Pro Phe Lys Ile

35 40 45

Ala Asp Ile Arg Ala Ala Ile Pro Pro His Cys Trp Val Lys Asp Pro

50 55 60

Leu Arg Ser Leu Ser Tyr Val Ala Trp Asp Leu Ile Ala Val Ala Ala

65 70 75 80

Leu Leu Ala Ala Ala Ala Tyr Phe Asp Ser Trp Ile Phe Trp Pro Ile

85 90 95

Tyr Trp Ala Ala Gln Gly Thr Met Phe Trp Ala Leu Phe Val Leu Gly

100 105 110

His Asp Cys Gly His Gly Ser Phe Ser Asp Ser Thr Thr Leu Asn Asn

115 120 125

Val Val Gly His Ile Leu His Ser Ser Ile Leu Val Pro Tyr His Gly

130 135 140

Trp Arg Ile Ser His Arg Thr His His Gln Asn His Gly His Val Glu

145 150 155 160

Lys Asp Glu Ser Trp Val Pro Leu Pro Glu Asn Leu Tyr Lys Gln Leu

165 170 175

Asp Phe Ser Thr Lys Phe Leu Arg Tyr Lys Ile Pro Phe Pro Met Phe

180 185 190

Ala Tyr Pro Leu Tyr Leu Trp Tyr Arg Ser Pro Gly Lys Thr Gly Ser

195 200 205

His Phe Asn Pro Asp Ser Ser Leu Phe Lys Pro Asn Glu Arg Asp Leu

210 215 220

Val Ile Thr Ser Thr Val Cys Trp Ala Ala Met Val Ala Phe Leu Leu

225 230 235 240

Tyr Ala Ser Thr Ile Val Gly Pro Thr Met Leu Phe Lys Leu Tyr Gly

245 250 255

Val Pro Tyr Leu Ile Phe Val Val Trp Leu Asp Thr Val Thr Tyr Leu

260 265 270

His His His Gly Tyr Asp Lys Lys Leu Pro Trp Tyr Arg Ser Lys Glu

275 280 285

Trp Ser Tyr Leu Arg Gly Gly Leu Thr Thr Val Asp Gln Asp Tyr Gly

290 295 300

Ile Phe Asn Lys Ile His His Asp Ile Gly Thr His Val Ile His His

305 310 315 320

Leu Phe Pro Gln Ile Pro His Tyr His Leu Val Glu Ala Thr Arg Glu

325 330 335

Ala Lys Arg Val Leu Gly Asn Tyr Tyr Arg Glu Pro Arg Lys Ser Gly

340 345 350

Pro Val Pro Phe His Leu Ile Pro Thr Leu Leu Lys Ser Leu Ser Arg

355 360 365

Asp His Tyr Val Ser Asp Asn Gly Asp Ile Val Tyr Tyr Gln Thr Asp

370 375 380

Ser Gln Leu Phe Ser Ser Lys Glu Ile

385 390

<210> 7

<211> 1495

<212> DNA

<213> 奇亚(Salvia hispanica)

<400> 7

tcctccacaa atgtgaacac gtatatgaat tccagtctat atatacgcat acatgcccca 60

ctcactcacg cctattccat tccttttgta actgaaaact ctcgattcga aaccccctcc 120

ggaaaatggc cgtctcttcc ggtgccgacg ctgagcacca cggccacgcc caatacgagc 180

acctcggcaa gcgcgccgcc gacaaattcg acccggccgc gcctcctccg ttcaagatcg 240

ccgacatccg cgccgccatc ccgccgcatt gctgggtcaa ggaccccctc cgctccctca 300

gctacgtcgc ctgggatgtg ttcgtcgtcg ccgcgctcct cgccgccgcc gcctttttcg 360

acagctggat cttctggccc atctactggg ccgcccaggg caccatgttt tgggccttgt 420

tcgtcctcgg ccacgattgt gggcacggga gtttttcgga caataccacg ctgaataacg 480

tggtgggaca tgtactacat tcctcaattc ttgtacctta tcatggatgg cgaataagcc 540

atcgaacaca ccaccagaat catggtcatg tggagaacga cgagtcatgg gttccgctga 600

ctgagaattt atacaagcag ctggatttct ccaccaaatt cttgagatac aaaatcccat 660

tccccatgtt tgcctacccc ctatacttgt ggtatagaag ccccggaaaa agtggatctc 720

acttcaaccc atatagtagt ttgttcaaac ccaatgagag agatttggtg atcacttcca 780

ccatatgttg ggctgcaatg gttgcttgtc tcctctatgc ttccaccatt gttggcccaa 840

ccatgttgtt caagctctac ggcgttcctt atttgatatt cgttgtgtgg ttggacacgg 900

ttacatatct gcaccaccat ggttacgaca agaaactccc ttggtaccgc agcaaggaat 960

ggagttattt acgtggagga ttgacgacag tagatcaaga ctatggaata ttcaacaaaa 1020

ttcaccacga tattggcacc catgttgttc accacctatt ccctcagatc ccacattacc 1080

atttagtgga ggcgacgagg gaggcgaaaa gggtgctcgg aaattactac agagagccca 1140

gaaaatctgg agccgttccg tttcacttgg ttccgacgtt gttgaaaagt ctaagtagag 1200

atcattatgt gagtgacaat ggagacatag tttactatca aacagatgga gaactatttt 1260

cttctaaaga gatttagtga tgggctctaa acaccaaagc atagtagatt tatttaaact 1320

agctttttgg ggccacatta ttttcacaag acaaataatt gtgtgcaaca ataagccttt 1380

taaataactg tagtaagttt tttaggttgc agttttgctc tcccttgttt ttttgtcttt 1440

ccttatgttc aattatgtaa tgttgcttta aataaagttt acttgttgta ttatc 1495

<210> 8

<211> 383

<212> PRT

<213> 奇亚(Salvia hispanica)

<400> 8

Met Ala Val Ser Ser Gly Ala Asp Ala Glu His His Gly His Ala Gln

1 5 10 15

Tyr Glu His Leu Gly Lys Arg Ala Ala Asp Lys Phe Asp Pro Ala Ala

20 25 30

Pro Pro Pro Phe Lys Ile Ala Asp Ile Arg Ala Ala Ile Pro Pro His

35 40 45

Cys Trp Val Lys Asp Pro Leu Arg Ser Leu Ser Tyr Val Ala Trp Asp

50 55 60

Val Phe Val Val Ala Ala Leu Leu Ala Ala Ala Ala Phe Phe Asp Ser

65 70 75 80

Trp Ile Phe Trp Pro Ile Tyr Trp Ala Ala Gln Gly Thr Met Phe Trp

85 90 95

Ala Leu Phe Val Leu Gly His Asp Cys Gly His Gly Ser Phe Ser Asp

100 105 110

Asn Thr Thr Leu Asn Asn Val Val Gly His Val Leu His Ser Ser Ile

115 120 125

Leu Val Pro Tyr His Gly Trp Arg Ile Ser His Arg Thr His His Gln

130 135 140

Asn His Gly His Val Glu Asn Asp Glu Ser Trp Val Pro Leu Thr Glu

145 150 155 160

Asn Leu Tyr Lys Gln Leu Asp Phe Ser Thr Lys Phe Leu Arg Tyr Lys

165 170 175

Ile Pro Phe Pro Met Phe Ala Tyr Pro Leu Tyr Leu Trp Tyr Arg Ser

180 185 190

Pro Gly Lys Ser Gly Ser His Phe Asn Pro Tyr Ser Ser Leu Phe Lys

195 200 205

Pro Asn Glu Arg Asp Leu Val Ile Thr Ser Thr Ile Cys Trp Ala Ala

210 215 220

Met Val Ala Cys Leu Leu Tyr Ala Ser Thr Ile Val Gly Pro Thr Met

225 230 235 240

Leu Phe Lys Leu Tyr Gly Val Pro Tyr Leu Ile Phe Val Val Trp Leu

245 250 255

Asp Thr Val Thr Tyr Leu His His His Gly Tyr Asp Lys Lys Leu Pro

260 265 270

Trp Tyr Arg Ser Lys Glu Trp Ser Tyr Leu Arg Gly Gly Leu Thr Thr

275 280 285

Val Asp Gln Asp Tyr Gly Ile Phe Asn Lys Ile His His Asp Ile Gly

290 295 300

Thr His Val Val His His Leu Phe Pro Gln Ile Pro His Tyr His Leu

305 310 315 320

Val Glu Ala Thr Arg Glu Ala Lys Arg Val Leu Gly Asn Tyr Tyr Arg

325 330 335

Glu Pro Arg Lys Ser Gly Ala Val Pro Phe His Leu Val Pro Thr Leu

340 345 350

Leu Lys Ser Leu Ser Arg Asp His Tyr Val Ser Asp Asn Gly Asp Ile

355 360 365

Val Tyr Tyr Gln Thr Asp Gly Glu Leu Phe Ser Ser Lys Glu Ile

370 375 380

<210> 9

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tctaacgctg ctgatgaagt tgctacactt cttaactttg atcttcttaa gcttgctggt 60

gatgttgaat ctaaccctgg tcct 84

<210> 10

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Ser Asn Ala Ala Asp Glu Val Ala Thr Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu

1 5 10 15

Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro

20 25

<210> 12

<211> 2385

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atgggtgctg gagggcgtat gtccgtaccc cctgcagaga aggcggcaaa atctgacatt 60

gtccaacgag ttccgcacac aaagcctcca tttacgctcg gtgatatcaa gaaagccatt 120

ccaccccatt gtttcaagcg atccattcct cgttcatttt cctatgtcgt atatgacctt 180

gtctttgcct ctctgtttta ctatgtcgcc acaaactaca tccatcagct cccccaccca 240

ctctcctacc ctgcctggat tctatatggg atatgtcaag gttgcatcct aactggtgtt 300

tgggtcatcg ctcatgaatg tggccaccat gcctttagtg actaccaatg gcttgacgac 360

actgtcggcc taatcctgca ctcattcctc ctagtgccgt tcttctcttg gaagtacagc 420

caccgtcgcc accactcaaa cactggctca ctcgagcggg atgaggtgtt tgtccccaag 480

gtcaagacag gggtcagctg ggctgccaag tacatgaaca acccacctgg cagactcatc 540

acccttgttg tccagctcac tctaggctgg cctctgtatc ttatgttcaa cgtttctgga 600

aggccttatg accggtttgc atgccacttc gacccaaaca gccctatcta ctctgatcgt 660

gaacgtgctc agatattcat ctctgatgca ggcattcttg ccgtcaccta tggactatac 720

cgtctgtctg tagccaaagg acttgcctgg gttctctgtg tctatggtgg tccattactc 780

gtggttaatg gattccttgt cttgatcact ttcttgcagc acacacaccc ttccctccct 840

cactacgact catcagagtg ggactggcta cgcggggccc tatccacagt cgacagagat 900

tatggtattc tcaacactgt cttccataac ataacggata cccatgttgc acatcatctg 960

ttctcgacca tgccgcacta ccatgcaatg gaggcgacaa aggttatcaa accaatcctg 1020

ggaaagtact accagttcga tgggacgcca gtttttaagg ccatgttcag agaggtgaag 1080

gaatgcatct atgtcgagcc cgatgaaggc gaggagaaca aaggtgtgtt ctggtacaat 1140

aacaagcttt ctaacgctgc tgatgaagtt gctacacttc ttaactttga tcttcttaag 1200

cttgctggtg atgttgaatc taaccctggt cctatggccg tctcttccgg tgccgacgct 1260

gagcaccacg gccacgccca atacgagcac ctcggcaagc gcgccgccga caaattcgac 1320

ccggccgcgc ctcctccgtt caagatcgcc gacatccgcg ccgccatccc gccgcattgc 1380

tgggtcaagg accccctccg ctccctcagc tacgtcgcct gggatgtgtt cgtcgtcgcc 1440

gcgctcctcg ccgccgccgc ctttttcgac agctggatct tctggcccat ctactgggcc 1500

gcccagggca ccatgttttg ggccttgttc gtcctcggcc acgattgtgg gcacgggagt 1560

ttttcggaca ataccacgct gaataacgtg gtgggacatg tactacattc ctcaattctt 1620

gtaccttatc atggatggcg aataagccat cgaacacacc accagaatca tggtcatgtg 1680

gagaacgacg agtcatgggt tccgctgact gagaatttat acaagcagct ggatttctcc 1740

accaaattct tgagatacaa aatcccattc cccatgtttg cctaccccct atacttgtgg 1800

tatagaagcc ccggaaaaag tggatctcac ttcaacccat atagtagttt gttcaaaccc 1860

aatgagagag atttggtgat cacttccacc atatgttggg ctgcaatggt tgcttgtctc 1920

ctctatgctt ccaccattgt tggcccaacc atgttgttca agctctacgg cgttccttat 1980

ttgatattcg ttgtgtggtt ggacacggtt acatatctgc accaccatgg ttacgacaag 2040

aaactccctt ggtaccgcag caaggaatgg agttatttac gtggaggatt gacgacagta 2100

gatcaagact atggaatatt caacaaaatt caccacgata ttggcaccca tgttgttcac 2160

cacctattcc ctcagatccc acattaccat ttagtggagg cgacgaggga ggcgaaaagg 2220

gtgctcggaa attactacag agagcccaga aaatctggag ccgttccgtt tcacttggtt 2280

ccgacgttgt tgaaaagtct aagtagagat cattatgtga gtgacaatgg agacatagtt 2340

tactatcaaa cagatggaga actattttct tctaaagaga tttag 2385

Claims (6)

1.过表达ShFAD2基因和过表达ShFAD3基因在制备高产α-亚麻酸的植物中的应用，其特征在于：所述ShFAD2基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述ShFAD3基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述植物为甘蓝型油菜。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述ShFAD2核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述ShFAD3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

3.一种获得高产α-亚麻酸的植物的方法，其特征在于：在植物中过量表达ShFAD2基因和ShFAD3基因，所述ShFAD2基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述ShFAD3编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；植物为甘蓝型油菜。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述在植物中过量表达ShFAD2基因和ShFAD3基因的方法是，构建含有ShFAD2基因和ShFAD3基因的重组表达载体，转化根癌农杆菌LBA4404，检测获得含重组表达载体的LBA4404工程菌株，然后用含重组表达载体的LBA4404工程菌株转化植物，筛选转基因植物即获得高产α-亚麻酸的植物。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述重组载体同时含有ShFAD2基因编码区、连接肽-内含肽LP4-2A编码区、ShFAD3基因编码区，三者串联形成一个融合蛋白基因ShFAD2-LP4-2A-ShFAD3，所述连接肽-内含肽LP4-2A编码区序列如SEQ ID NO.9所示。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于；所述重组载体由以下方法制备：所述重组载体由SEQ ID NO.11所示序列连入pC2301M1NPB质粒XbaI与XmaI酶切位点而得。

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