ES2321922T3 - Dna y vector para regular la expresion del gen de la sintasa del factor lacrimatorio, metodo para regular la expresion del gen de la sintasa del factor lacrimatorio mediante su uso, y planta con expresion regulada del gen de la sintasa del factor lacrimatorio. - Google Patents

Abstract

Una construcción que comprende un DNA unido operablemente a una secuencia reguladora, en la que dicho DNA suprime la expresión de una proteína o un polipéptido que posee actividad enzimática que produce factor lacrimatorio, en el que dicho DNA comprende una secuencia seleccionada entre las (i), (ii), (iii), (iv) y (v) que siguen, en ambas orientaciones, sentido y antisentido: (i) una secuencia de DNA de SEQ ID NO. 1, 5, 7, 9, 11, 13 ó 15; (ii) una secuencia de DNA que tiene una identidad de 75% por lo menos, con una secuencia de DNA representada por SEQ ID NO. 1, 5, 7, 9, 11, 13 ó 15; (iii) una secuencia de DNA reguladora ubicada inmediatamente en el lado aguas arriba y que regula la expresión de una secuencia de DNA representada por SEQ ID NO. 1, 5, 7, 9, 11, 13 ó 15, de un DNA genómico del género Allium; (iv) una secuencia de DNA ubicada entre la secuencia de DNA citada en (i) y la secuencia de DNA reguladora citada en (iii), de un DNA genómico del género Allium; y (v) una secuencia de DNA que tiene una longitud de 18 nucleótidos, por lo menos, de la secuencia de DNA citada en (i), (ii), (iii) o (iv).

Description

DNA y vector para regular la expresión del gen de la sintasa del factor lacrimatorio, método para regular la expresión del gen de la sintasa del factor lacrimatorio mediante su uso, y la planta con expresión regulada del gen de la sintasa del factor lacrimatorio.

Campo técnico

La presente invención se refiere a DNA y un vector para reprimir la expresión de DNA (gen de la enzima que produce el factor lacrimatorio) que codifica una proteína o un polipéptido que tiene el efecto de convertir el ácido 1-propenilsulfénico, que concierne a la formación de factores lacrimatorios generados cuando plantas tales como las cebollas se fragmentan o cortan produciendo el factor lacrimatorio, un método para reprimir con ellos la expresión del gen de la enzima que produce el factor lacrimatorio, y vegetales con expresión reprimida del gen de la enzima que produce el factor lacrimatorio.

La expresión "factor lacrimatorio" (en lo sucesivo "LF") en esta memoria descriptiva indica el tiopropanal-S-óxido. La expresión "que tiene actividad enzimática que produce el factor lacrimatorio" indica que tiene efecto de conversión del ácido trans-1-propenilsulfénico, que es un sustrato estimado de la enzima que produce el factor lacrimatorio, en un factor lacrimatorio, o que tiene efecto de generación del factor lacrimatorio a partir del sulfóxido de trans-S-1-propenil-cisteína (PeCSO) contenido en las cebollas o vegetales semejantes, en presencia de la enzima denominada aliinasa.

Antecedentes de la técnica

La faceta característica más notable de la cebolla es que se genera una gran cantidad de un factor lacrimatorio (en lo sucesivo, "LF") cuando la cebolla se pulveriza o se corta. Por tanto, la generación de LF es un serio problema, no solamente para cocinar en cocinas ordinarias si no también en instalaciones destinadas a producir cebolla seca. En estas condiciones, se han llevado a cabo diversas investigaciones acerca de la estructura química del LF y su proceso de generación. Se ha indicado que el LF es esencialmente el tiopropanal S-óxido (Wilkins, W. F. tesis doctoral, Universidad Cornell, Ithaca, N.Y. 1961), que el sulfóxido de S-1-propenil-cisteína (en lo sucesivo "PeCSO", que es un compuesto que contiene azufre, contenido en la cebolla, es descompuesto por la aliinasa (Virtanen, A.I. et al., Suom. Kemistil. B, 34, 72, 1961), y que se genera LF a través del ácido 1-propenilsulfénico que es un producto de descomposición del PeCSO con la aliinasa (Block, e. et al., J. Am. Chem. Soc.,11, 2200, 1979).

Debido a que se consideró en la técnica anterior que el LF se forma por descomposición del PeCSO con la aliinasa, se propuso un método para producir cebollas que generaran una cantidad reducida de LF, que comprende la producción de cebollas que poseen un contenido reducido de PeCSO, o la producción de cebollas que poseen una actividad reducida de aliinasa.

En tales circunstancias, se llevaron a cabo investigaciones con el fin de variar la cantidad de PeCSO acumulada en las cebollas variando las condiciones de cultivo. Por ejemplo, se ha informado de que cuando se cultiva la cebolla en condiciones de un bajo contenido de azufre, el contenido de LF se reduce. (Randle, W.M. et al., J. Agr. Food Chem. 42, 2085, 1994) y la cantidad relativa de PeCSO como sustrato de la aliinasa, se reduce también (Randle, W. M. et al., J. Amer. Soc. Hort. Sci. 120, 1075, 1995). Se ha indicado también que cuando se cultivan cebollas en presencia de selenio, el producto posee un contenido reducido de PeCSO (Kopsell, D. E. et al., J. Amer. Soc Hort. Sci. 124, 307, 1999), que el contenido de PeCSO de las cebollas obtenidas aumenta durante su almacenamiento (Kopsell, D. E. et al., J. Amer. Soc Hort. Sci. 124, 177, 1999) y que cuanto mayor es la cantidad de nitrato amónico usado como fertilizante, menor es el contenido de PeCSO (Randle, W.M. et al., J. Amer. Soc Hort. Sci. 125, 254, 2000).

Sin embargo, las cebollas cultivadas en presencia de una cantidad reducida de PeCSO tienen el problema de que el olor está debilitado (p. 41-52. En: S. J. Risch y C. Ho (compiladores). Spices: Flavor chemistry and antioxidant properties. Amer. Chem. Soc., Wash., D. C.) y que la cantidad relativa de PeCSO respecto del sustrato de aliinasa cambia a costa de la calidad del olor per se. Así pues, solamente el cambio de las condiciones de cultivo no es la solución fundamental por la siguiente razón: el ácido 1-propenilsulfénico producido por la descomposición del PeCSO con la aliinasa se convierte no solo en LF sino también en compuestos tiosulfinato que son el origen de los ingredientes olorosos.

La solicitante ha descubierto una enzima que produce el factor lacrimatorio capaz de convertir el ácido 1-propenilsulfenico en LF, y ha solicitado una patente de ello (Solicitud de Patente Japonesa publicada, sin examinar (en lo sucesivo "J. P. KOKAI") No. Hei 10-295373). La solicitante dilucidó, además, una isozima de esta enzima que produce el factor lacrimatorio, su secuencia de aminoácidos y del DNA que codifica la isozima, y solicitó patente para ello (Solicitud de Patente Internacional PCT/JP01/07465).

Presumiblemente, si la expresión de la enzima que produce el factor lacrimatorio puede ser reprimida e inhibirse su actividad mediante el uso de la enzima que produce el factor lacrimatorio dilucidada en la solicitud de patente antes descrita, no se produce LF a partir del ácido 1-propenilsulfénico sino que pueden producirse los compuestos tiosulfinato que producen el olor, en una cantidad no menor que la que figura en la técnica anterior, independientemente del efecto de la enzima. Además, conforme a la información genética de un gen que codifica la enzima que produce el factor lacrimatorio, la recombinación genética, la inducción de variación, el apareamiento, etc., pueden llevarse a cabo eficazmente y puede desarrollarse una técnica de producción de vegetales tales como la cebolla, en la que no se forma con facilidad el factor lacrimatorio al pulverizar o cortar.

El punto principal de la presente invención es la obtención de vegetales que tienen una expresión reprimida de la enzima que produce el factor lacrimatorio, mediante una técnica de ingeniería genética para producir eficazmente vegetales pretendidos en un período corto según la información de la secuencia del gen que codifica la enzima que produce el factor lacrimatorio de la solicitud anterior.

A saber, el objeto de la presente invención es proporcionar DNA y RNA diseñados sobre la base de la secuencia del gen de una enzima, para formar el factor lacrimatorio a partir de un precursor de este factor, con la finalidad de reprimir la expresión, y también un vector, requerido para introducir en un vegetal el DNA que reprime la expresión, del gen de la enzima que produce el factor lacrimatorio. Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método para reprimir la expresión del gen de la enzima que produce el factor lacrimatorio mediante el uso del mismo, así como también un vegetal en el que esté reprimida la expresión del gen de la enzima que produce el factor lacrimatorio. La presente invención tiene grandes ventajas puesto que, debido a que la formación del factor lacrimatorio puede ser esencialmente reprimida, la cebolla no está influenciada por otros factores externos y también debido a que no se ejerce influencia sobre la cantidad del precursor del factor lacrimatorio, no disminuye la calidad de la cebolla. Otra ventaja de la presente invención es que la expresión del gen puede ser reprimida en un período más corto que el de las técnicas ordinarias de producción de vegetales que están libres de la ingeniería genética.

Sumario de la invención

Después de investigaciones intensas llevadas a cabo con la finalidad de resolver los problemas descritos, los inventores han tenido éxito en construir medios de reprimir la expresión del gen de una enzima que produce el factor lacrimatorio, mediante el uso de un DNA que codifica una proteína o un polipéptido de la enzima que produce el factor lacrimatorio, que tiene el efecto de convertir el ácido 1-propenilsulfénico en el factor lacrimatorio.

La presente invención se refiere también a un DNA utilizable para reprimir la expresión del gen de la enzima que produce el factor lacrimatorio sobre la base de la secuencia antes descrita. La constitución del DNA es la siguiente:

(1) DNA que comprende al menos una secuencia seleccionada entre las secuencias que siguen y

una secuencia reguladora unida a dicha secuencia para hacer posible la transcripción:

(a) una secuencia génica de una enzima que produce el factor lacrimatorio o una parte de la secuencia génica en orientación sentido, en orientación antisentido o en ambas orientaciones;

(b) una secuencia reguladora del DNA del DNA genómico de vegetales determinado sobre la base de la secuencia génica de la enzima que produce el factor lacrimatorio o una parte de la secuencia reguladora en orientación sentido, en orientación antisentido o en ambas orientaciones, y

(c) una secuencia de DNA ubicada entre la secuencia génica de la enzima que produce el factor lacrimatorio y la secuencia reguladora del DNA en el DNA genómico de vegetales, determinada sobre la base de la secuencia génica o una parte de la secuencia de DNA en orientación sentido, en orientación antisentido o en ambas orientaciones.

La expresión "gen de la enzima que produce el factor lacrimatorio" de esta memoria, indica una región de DNA (gen estructural) que define la estructura primaria de la enzima que produce el factor lacrimatorio. La expresión "secuencia reguladora en el DNA genómico de vegetales determinada sobre la base del gen de la enzima que produce el factor lacrimatorio" indica, en general, un elemento de DNA sobre un gen que comprende un promotor que sirve de núcleo del gen de la enzima que produce el factor lacrimatorio y un elemento regulador (gen regulador). "Un DNA ubicado entre el gen de la enzima que produce el factor lacrimatorio y una secuencia reguladora en el DNA genómico de vegetales, determinada sobre la base de este gen", indica una región de DNA (secuencia intermedia) entre el gen estructural antes descrito y el gen regulador (refiérase a la Fig. 1). La totalidad o una parte de las regiones de DNA son transcritas a mRNA (("Wakariyasui Idenshi Kogaku", compilado por Hiroshi Handa, publicado por Shokodo en 1999). Por tanto, estas regiones génicas con importantes para producir la enzima que produce el factor lacrimatorio. La expresión "una parte de la secuencia" indica en esta memoria una secuencia que posee por lo menos 18 nucleótidos, de preferencia, por lo menos 22 nucleótidos, en una parte de las secuencias (a), (b) y (c) antes descritas.

(2) DNA que comprende una secuencia que produce uno o más RNAs que tienen actividad de endonucleasa,

por lo menos una secuencia seleccionada entre las secuencias siguientes y

una secuencia reguladora unida a dichas secuencias para hacer posible la transcripción:

(a) una secuencia génica de una enzima que produce el factor lacrimatorio o una parte de la secuencia génica en orientación antisentido;

(b) una secuencia reguladora de un DNA situada en el DNA genómico de un vegetal, determinado sobre la base del gen de la enzima que produce el factor lacrimatorio o una parte de la secuencia reguladora en orientación antisentido; y

(c) una secuencia de DNA ubicada entre el gen de la enzima que produce el factor lacrimatorio y la secuencia reguladora de DNA situada en el DNA genómico de un vegetal, determinado sobre la base del gen o una parte de la secuencia de DNA, en orientación antisentido.

La presente invención se refiere también a RNA que posee una secuencia de bases capaz de hibridarse con el RNA que corresponde a DNA que comprende, por lo menos, una secuencia seleccionada entre las secuencias siguientes:

(a) una secuencia génica de una enzima que produce el factor lacrimatorio o una parte de la secuencia génica, en orientación sentido, en orientación antisentido o en ambas orientaciones;

(b) una secuencia reguladora de un DNA situado en el DNA genómico de un vegetal, determinado sobre la base del gen de la enzima que produce el factor lacrimatorio o una parte de la secuencia reguladora, en orientación sentido, en orientación antisentido o en ambas orientaciones; y

(c) una secuencia de DNA situada entre el gen de la enzima que produce el factor lacrimatorio y la secuencia reguladora del DNA situada en el DNA genómico de un vegetal, determinado sobre la base del gen o una parte de la secuencia de DNA, en orientación sentido, en orientación antisentido o en ambas orientaciones.

La expresión "RNA que corresponde a DNA" indica en esta memoria RNA que posee la misma secuencia de bases que la del DNA excepto que T (timina) del DNA está reemplazada por U (uracilo) en el RNA. Por ejemplo, cuando se usa DNA que tiene la secuencia (a) en orientación sentido, el RNA correspondiente tiene una secuencia en orientación sentido, y el RNA capaz de hibridarse con este RNA posee una secuencia en orientación antisentido. A saber, un RNA que posee la secuencia en orientación antisentido corresponde a RNA antisentido que posee una secuencia de bases complementaria de mRNA que corresponde a DNA de la secuencia (a) en orientación sentido.

La presente invención incluye RNA que excluye RNA de orientación antisentido que tiene una secuencia de bases complementaria de mRNA que corresponde a DNA que posee la secuencia de bases de SEQ ID NO. 11.

Descripción de la invención DNA de vegetales

Las proteínas capaces de catalizar la reacción de conversión de PeCSO, que es un precursor del factor lacrimatorio, en el factor lacrimatorio, incluyen la aliinasa y enzimas que producen el factor lacrimatorio. Estas proteínas están contenidas en vegetales liliáceos que producen los factores lacrimatorios por un daño físico tal como corte, por ejemplo, la cebolla, cebolla verde, cebolleta, puerro, echarote y cebollino. Los genes de la enzima que produce el factor lacrimatorio incluyen el DNA de la cebolla verde, de la SEQ ID NOS. 1 y 3, el DNA de la cebolleta, de la SEQ ID NO. 5, el DNA del echarote, de la SEQ ID NO. 7, el DNA del puerro, de la SEQ ID NOS. 9 y 13, el DNA de la cebolla, de la SEQ ID NO. 11, y el DNA del ajo elefante, de la SEQ ID NO. 15. Sin embargo, los genes de las enzimas que producen el factor lacrimatorio no están limitados a ellos. En las secuencias de bases antes descritas, de DNA o de una parte de las secuencias de los mismos, puede añadirse una o más bases, suprimirse o reemplazarse. Por ejemplo, el DNA o una parte de su secuencia puede codificar las proteínas o los polipéptidos, en que en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOS. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 16 correspondientes al DNA antes descrito, pueden añadirse uno o más aminoácidos, suprimirse o reemplazarse. Dichas proteínas o dichos polipéptidos tienen la función de convertir el ácido 1-propenilsulfénico en el factor lacrimatorio.

Los genes de la enzima que produce el factor lacrimatorio son DNA o una parte de su secuencia capaz de hibridarse con DNA de una secuencia de bases de las secuencias SEQ ID NOS. 1, 5, 7, 9, 13 ó 15, antes descritas, en condiciones restrictivas. El DNA que puede hibridarse o una fracción del mismo incluye ambos, DNA capaz de hibridarse con DNA de una secuencia de bases de cada número de SEQ ID y DNA complementario. En otras palabras, este DNA o una parte de la secuencia del mismo consiste en una secuencia de bases que poseen homología de 60% por lo menos, de preferencia 70% por lo menos y más preferiblemente 75% por lo menos, con la secuencia de bases de las SEQ ID NOS. 1, 5, 7, 9, 13 ó 15 anteriormente descritas.

Condiciones de hibridación de la secuencia de bases

La expresión "condiciones restrictivas" de la presente invención, indica en esta memoria condiciones tales que la secuencia de bases de SEQ ID NO. 1, 5, 7, 9, 11, 13 ó 15, o una parte de las mismas se hibrida específicamente con DNA y que no se genera ni detecta híbrido inespecífico. Es difícil expresar numéricamente las condiciones restrictivas. Un ejemplo de las condiciones es como sigue: incluso cuando se forma un híbrido bajo condiciones de hibridación tales que se utiliza un tampón de hibridación que contiene 30% (v/v) de formaldehído desionizado, NaCl 0,6 M, NaH_{2}PO_{4} 0,04 M, EDTA 2,5 mM y 7% de SDS, a 42ºC, y después el híbrido formado se lava 2 x SSC, SDS al 0,1%, el híbrido se mantiene todavía. La hibridación de ácidos nucleicos puede llevarse a cabo según se indica, por ejemplo, en Molecular Cloning: A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, EE.UU.

Homología de la secuencia de bases

La homología de la secuencia de bases se estima como sigue: la alineación de la secuencia de bases realizada antes de estimar la homología de bases de las secuencias, se realiza usando CLUSTAL W 1.81 DDBJ, versión extendida (el algorismo es conducido de conformidad con Gene 73 (1988) 237-244; CLUSTAL W por SSBJ) que es un servicio de análisis de internet del Banco de Datos de DNA de Japón (http://www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/homology.html). Los parámetros del análisis se mantienen por defecto (gapdist: 8, maxdiv: 40, gapopen: 15, gapext:6,66). Los resultados de la alineación obtenidos de este modo se utilizan para calcular el tanto por ciento del número de las bases que coinciden en ORF basado en el número total de las bases de ORF (se excluye la región gap formada por la alineación) para calcular la homología de las bases de ORF.

Método para reprimir la expresión génica

El DNA antes descrito codifica la proteína de las enzimas que producen el factor lacrimatorio de los vegetales liliáceos y, por consiguiente, la generación del factor lacrimatorio puede ser reprimida regulando la expresión de estos DNAs. Para reprimir la expresión de los genes de las enzimas que producen el factor lacrimatorio, pueden emplearse en la presente invención diversos métodos bien conocidos en la técnica. La represión de la expresión génica incluye la represión de la transferencia de los genes así como la represión de la traducción desde mRNA a proteína, y también incluye no solo la terminación completa de la expresión de genes sino también la reducción de la
expresión.

Recientemente, han sido descritos varios casos de producción de vegetales transformados mediante la mejora de la técnica de cultivo de tejidos de plantas así como de la técnica de introducción de genes. en cuanto a los vegetales liliáceos, se ha indicado ya que un gen extrínseco fue introducido con Agrobacterium (C.C. Eady et al., Plant Cell Reports, 19, 376-381 (2000), S-J. Zheng et al., Molecular Breeding, 7, 101-115 (2001)) y que un gen extrínseco fue introducido con una pistola de partículas (C. C. Eady et al., Plant Cell Reports, 15, 958-962 (1996)). En cuanto a las técnicas de represión de la expresión génica de un vegetal mediante la técnica de introducción génica, han sido conocidas las que se describen a continuación.

En una de las técnicas, la función del RNA es reprimida mediante un RNA antisentido o, en otras palabras, un RNA que posee una secuencia de bases complementaria a la del mRNA, que es una información de la síntesis de proteínas. El RNA antisentido puede producirse artificialmente mediante una técnica de recombinación genética. Por ejemplo, ha sido propuesta una petunia que tiene un color de la flor diferente del de una petunia salvaje que produce RNA antisentido de una chalcona-sintasa concerniente a la síntesis del pigmento floral (van der Krol et al., Nature, 333, 866-869 (1988)). Además, ha sido reprimida la expresión del gen de la poligalacturonasa que desempeña un papel importante en el ablandamiento de los frutos de tomate con RNA antisentido, produciendo tomates que pueden ser almacenados durante un período de tiempo más largo que el de los tomates de tipo salvaje (Publicación de Patente Europea No. 341885).

Además de esto, se ha indicado un fenómeno denominado "co-supresión" (C. Napoli et al., Plant Cell, 2, 279 (1990) y A.R. van der Krol et al., Plant Cell, 2, 291 (1990). En este fenómeno cuando es introducido DNA construido para producir RNA de orientación sentido, que tiene una secuencia homóloga a la de un gen intrínseco, son reprimidas la expresión del gen extrínseco introducido y la del gen intrínseco homólogo a éste.

Además de estos dos métodos ("método de introducción de una cadena de orientación antisentido" y "método de introducción de una cadena de orientación sentido") recientemente se ha conocido un nuevo método para reprimir la expresión génica denominado "RNAi (interferencia de RNA)" (J. Z. Levin et al., Plant Molecular Biology, 44, 759-775 (2000, Senri Ushida, "Protein, Nucleic Acid, Enzyme" 46 (10), 1381-1386 (2001)). En este método RNA bicatenario (dsRNA) homólogo de un gen diana, es introducido directamente en una célula mediante una técnica de electroporación, microinyección, pistola de partículas o semejante, o es integrado una secuencia de DNA que expresa dsRNA. El hecho de obtener dsRNA mediante el enlace complementario de una cadena de DNA de orientación sentido y una cadena de RNA antisentido, indica que la cadena de DNA de orientación sentido y la cadena antisentido han sido introducidas juntas. Con independencia del método de introducción (la introducción de la cadena de DNA de orientación sentido y la cadena antisentido, por separado, o la introducción de la combinación de ellas), el producto final obtenido a partir de los genes respectivos introducidos es dsRNA complementario del gen diana. Este producto es descompuesto en dsRNA corto (siRNA) que comprende veinte nucleótidos con endonucleasa desemparejados. Además, cuando siRNA se enlaza con la parte complementaria de mRNA procedente del gen estructural, la parte enlazada se hace guía del complejo de procesamiento de RNA (RISC) que comprende dos o más subunidades y también el mRNA diana es cortado en el centro del RNA guía con RISC. Tal mecanismo ha sido propuesto (V. Vance et al., Science, 292, 2277-2280 22 de Junio (2001)). Por tanto, puede decirse que los tres métodos descritos tienen el mismo efecto de reprimir la expresión génica después de la transcripción, aun cuando son diferentes uno de otro en cuanto a la orientación y combinación de los genes que han de ser integrados.

El DNA de la presente invención que puede utilizarse para reprimir la expresión del gen de la enzima que produce el factor lacrimatorio, de los métodos descritos, es como sigue:

DNA que comprende por lo menos una secuencia seleccionada entre las secuencias siguientes y

una secuencia reguladora unida a dicha secuencia para hacer posible la transcripción:

(a) una secuencia génica de una enzima que produce el factor lacrimatorio en orientación sentido, en orientación antisentido o en ambas orientaciones, o una parte de la secuencia de DNA en orientación sentido, en orientación antisentido o en ambas orientaciones;

(b) una secuencia reguladora de un DNA de un DNA genómico de un vegetal, determinado sobre la base del gen de la enzima que produce el factor lacrimatorio, en orientación sentido, en orientación antisentido o en ambas orientaciones, o una parte de la secuencia reguladora en orientación sentido, en orientación antisentido o en ambas orientaciones; y

(c) una secuencia de DNA ubicada entre el gen de la enzima que produce el factor lacrimatorio y la secuencia reguladora del DNA en el DNA genómico de un vegetal,. determinado sobre la base del gen en orientación sentido, en orientación antisentido o en ambas orientaciones, o una parte de la secuencia de DNA colocada entre ellas en orientación sentido, en orientación antisentido o en ambas orientaciones.

La orientación sentido y la orientación antisentido de los genes se muestran en la Fig. 1.

Cualquiera de las secuencias (a), (b) y (c) puede ser usada como el DNA para reprimir la expresión del gen de la enzima que produce el factor lacrimatorio, de la presente invención. Entre ellas, se prefiere una secuencia de una parte que puede ser transcrita como mRNA y, en particular, se prefiere una parte de (a) del gen estructural.

La secuencia (a) usada en el DNA para reprimir la expresión del gen de la enzima que produce el factor lacrimatorio, puede ser la secuencia o bien del gen total de la enzima que produce el factor lacrimatorio o bien de una parte del mismo. Además, puede ser la secuencia total del DNA o de una parte del DNA que codifica la proteína anteriormente descrita pero en la que uno o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la proteína han sido añadidos, suprimidos o reemplazados.

La secuencia (b) usada en el DNA para reprimir la expresión del gen de la enzima que produce el factor lacrimatorio, puede ser la secuencia reguladora total de DNA en el DNA genómico de un vegetal, determinado sobre la base del gen de la enzima que produce el factor lacrimatorio o la secuencia de una parte de la misma, o la secuencia total o una parte de la secuencia obtenida mediante la adición, supresión o reemplazo de una o más bases de la secuencia de bases de la secuencia reguladora.

La secuencia (c) usada en el DNA para reprimir la expresión del gen de la enzima que produce el factor lacrimatorio, puede ser la secuencia del DNA total ubicada entre el gen de la enzima que produce el factor lacrimatorio y la secuencia reguladora del DNA del DNA genómico de un vegetal, determinado sobre la base del gen, la secuencia de una parte del mismo, o la secuencia total o una parte de la secuencia obtenida mediante la adición, supresión o reemplazo de una o más bases de la secuencia de bases de la secuencia de DNA.

La presente invención incluye la secuencia reguladora del DNA genómico de un vegetal y DNA ubicado entre el gen de la enzima que produce el factor lacrimatorio y la secuencia reguladora del mismo (secuencias (b) y (c)). Estas secuencias pueden ser determinadas sobre la base de la secuencia de bases del gen de la enzima que produce el factor lacrimatorio. A saber, la secuencia es clonada adecuadamente partiendo de la secuencia de bases del gen anteriormente descrito. Por ejemplo, la secuencia puede ser seleccionada desde una biblioteca genómica usando una parte apropiada sobre el lado del extremo 5' de cDNA que posee, como sonda. la longitud completa de la secuencia anteriormente descrita. En otro método, se prepara un oligonucleótido sintético para el extremo N-terminal de la secuencia de aminoácidos y puede ser clonada partiendo desde la biblioteca genómica una fracción génica que contiene el dominio de un promotor. También es posible clonar DNA de longitud total sin la preparación de la biblioteca genómica mediante el método RACE, en que un dominio desconocido es clonado por PCR partiendo del DNA
descrito.

RNA para reprimir la expresión del gen de la enzima que produce el factor lacrimatorio, de la presente invención, indica RNA transcrito desde el DNA anteriormente descrito, para reprimir la expresión. Tal RNA incluye RNA sintetizado artificialmente que posee las mismas secuencias de bases y que puede usarse directamente para la
represión.

La secuencia de los nucleótidos de orientación sentido o antisentido que se usa en la presente invención es, preferiblemente, complementaria de la totalidad o de una parte de la secuencia de genes endógenos (o genes homólogos) del vegetal que haya de ser transformado. No obstante, la complementación puede ser incompleta en tanto en cuanto la expresión de los genes pueda ser reprimida eficazmente. Por ejemplo, RNA transcrito desde DNA que posee por lo menos una de las secuencias de DNA de la presente invención, es hibridado preferiblemente para formar RNA transcrito partiendo de los genes de la enzima que produce el factor lacrimatorio, la secuencia reguladora de su lado aguas arriba y RNA transcrito desde la secuencia de DNA entre ellas. Este RNA puede ser o bien monocatenario o bicatenario.

Molécula de ácido nucleico que posee la función de inhibir la traducción de mRNA de una proteína o un polipéptido de la enzima que produce el factor lacrimatorio

Se ha comprobado por las investigaciones de los presentes inventores, que la enzima que produce el factor lacrimatorio es un factor indispensable para formar el factor lacrimatorio (J. P. KOKAI No. Hei 10-295373). Por consiguiente, es evidente por sí mismo que cuando se inhibe la acción de esta enzima, no se forma factor lacrimatorio.

Diversas investigaciones fueron llevadas a cabo con la finalidad de reprimir la formación del factor lacrimatorio. Estas investigaciones incluyen un método de cultivo en el que se reduce la cantidad de fertilizantes que contienen azufre, para reducir la acumulación del sulfóxido de S-1-propenil-cisteína (PeCSO) que es un sustrato para la aliinasa, y un método para inactivar la aliinasa para alcanzar tal finalidad. Sin embargo, ellas no pueden resolver los problemas al tiempo que mantener alta la calidad del producto.

Así pues, el método de reprimir las etapas que varían desde la transcripción hasta la traducción del gen que codifica la enzima que produce el factor lacrimatorio, es muy útil para la producción de vegetales liliáceos que tienen alta calidad y efecto lacrimatorio reprimido. Este método no puede ser realizado a menos que la secuencia génica de la enzima sea esclarecida.

Diversos métodos conocidos en la técnica pueden ser empleados para inhibir la expresión del gen de la enzima que produce el factor lacrimatorio. La represión de la expresión génica incluye la represión de la transcripción de genes y la represión de su traducción a proteína. Para inhibir eficazmente la expresión de los genes, es eficaz reprimir la traducción de mRNA de la enzima que produce el factor lacrimatorio contenido en vegetales liliáceos.

Las técnicas de la represión conocidas para la finalidad antes descrita, incluyen un método antisentido en el que la longitud total o una parte del mRNA de la enzima intrínseca que produce el factor lacrimatorio es hibridada para formar RNA bicatenario, de modo que pueden introducirse genes al tiempo que la traducción subsiguiente es reprimida, y también el método de RNAi en el que se forma RNA bicatenario de todas las secuencias de la enzima o una parte de las mismas para introducir el gen y descomponer de este modo el mRNA de la enzima intrínseca que produce el factor lacrimatorio. Otro método eficaz comprende utilizar una co-represión en la que un gen es introducido para sobreexpresar la longitud total o una parte de la cadena en orientación sentido o una secuencia análoga de la enzima que produce el factor lacrimatorio, para reprimir la expresión de un gen homólogo a ella.

A saber, la totalidad de las moléculas de ácido nucleico capaces de eliminar la función del mRNA intrínseco mediante los mecanismos antes descritos, o semejantes, son eficaces con independencia de su longitud, el número de las cadenas (una sola cadena o dos cadenas) o de la hibridación con los genes de la enzima que produce el factor lacrimatorio. La longitud de las moléculas de ácido nucleico es, por lo menos, 18 nucleótidos, de preferencia, por lo menos, 22 nucleótidos. Exponer repetidamente razones por las que el diseño o el comportamiento de tales moléculas de ácido nucleico ha llegado a ser posible, son que la secuencia génica de la enzima que produce el factor lacrimatorio fue dilucidada y el diseño o el comportamiento de ellas ha llegado a ser posible sobre la base de la
secuencia.

Ensayo del efecto de moléculas de ácidos nucleicos que inhiben la traducción del mRNA

Para examinar si una molécula de ácido nucleico inhibía o no la traducción del mRNA de la enzima intrínseca que produce el factor lacrimatorio, es eficaz determinar la actividad enzimática que produce el factor lacrimatorio de un tejido vegetal en el que habían sido introducidos genes para traducir las moléculas de ácido nucleico a RNA, o para determinar la cantidad de proteína de la enzima para confirmar directamente el efecto. El hecho de que la actividad enzimática que produce el factor lacrimatorio está reducida o de que la cantidad de la proteína de la enzima está reducida, indica que la traducción del mRNA intrínseco ha sido inhibida mediante las moléculas de ácido nucleico introducidas. La eficacia de las moléculas de ácido nucleico introducidas puede deducirse de estos
resultados.

Por ejemplo, la actividad enzimática que produce el factor lacrimatorio se determina añadiendo un extracto de un tejido vegetal que ha de ser ensayado, al sistema de reacción de aliinasa extraída del ajo y exenta de esta enzima y de PeCSO que es el sustrato de la aliinasa, y determinando por HPLC o semejante, el factor lacrimatorio (LF) generado. Más concretamente, el hecho de si un vegetal transformado posee o no la actividad enzimática que produce el factor lacrimatorio, puede ser confirmado mediante el método descrito en la Solicitud de Patente Internacional PCT/JP01/07465 como se indica en los Ejemplos que figuran más adelante.

El hecho de que la cantidad de la proteína de la enzima que produce el factor lacrimatorio esté reducida, puede ser decidido mediante el método de la transferencia western en el que se utiliza un anticuerpo de esta enzima preparado usando esta enzima como el antígeno. Es decir, esta decisión puede realizarse mediante el método ordinario de transferencia western en el que una fracción extraída del tejido vegetal que ha de ser ensayado, es fraccionada mediante SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS) y, después de la transferencia con una membrana PVDF, la proteína es detectada selectivamente con el anticuerpo de la enzima que produce el factor lacrimatorio. La proteína patrón de la enzima que produce el factor lacrimatorio que se usa en este ensayo, puede ser preparada extrayéndola de diversos vegetales liliáceos y purificando el extracto. También es posible usar una enzima que produce factor lacrimatorio, recombinante, obtenida mediante la expresión de la secuencia de DNA de la enzima con E. coli o semejante. El método de determinación de la actividad enzimática así como el método de determinación de la cantidad de la proteína de la enzima que produce el factor lacrimatorio, no se limitan a los métodos ordinarios aquí descritos sino que puede emplearse cualquier método.

En cuanto a un método de aplicación de RNA antisentido, se menciona un método en el que se emplea DNA que codifica una ribozima. La palabra "ribozima" significa una molécula de RNA que posee actividad catalítica. Las ribozimas poseen diversas actividades. En particular, se llevaron a cabo investigaciones sobre ribozimas como enzimas para dividir RNA, haciendo posible diseñar ribozimas usadas para dividir RNA específicamente en el sitio. Las ribozimas incluyen aquellas que comprenden 400 ó más nucleótidos tales como las de tipo intrón en el grupo I y m1RNA contenido en RnasaP, y también incluyen aquellas que poseen un dominio activo de 40 nucleótidos aproximadamente, que son denominadas de tipo de "cabeza de martillo" y del tipo de "horquilla del pelo" (Makoto Koizumi y Eiko Otsuka, "Protein, Nucleic acids, Enzyme", 35, 2191, 1990).

Por ejemplo, una ribozima del tipo de "cabeza de martillo" divide el lado 3' de C de una secuencia de GUC de un mRNA diana. Se ha sugerido que también cuando la secuencia del mRNA diana es no solamente GUC sino también GUA o GUU, es dividida por la enzima del tipo de "cabeza de martillo" (M. Koizumi et al., FEBS Lett. 228:225, 1988). Es posible producir una ribozima enzimática de restricción que escinde RNA, capaz de reconocer la secuencia de GUC, GUU o GUA de un RNA diana (M. Koizumi et al., FEBS Lett. 239:285, 1988, Makoto Koizumi y Eiko Otsuka, "Protein, Nucleic acids, Enzyme", 35, 2191, 1990 y M. Koizumi et al., Nucleic Acids Res. 17:7059, 1989). Se ha indicado también un método que comprende introducir una secuencia de DNA que produce una ribozima que posee efecto de dividir específicamente las cadenas de RNA además de una secuencia de DNA que produce RNA antisentido complementaria del mRNA de un gen diana, en un vegetal (A. O. Merlo et al., Plant Cell, 10, 1603-1622 (1988). El RNA producido partiendo del gen introducido tiene la propiedad de que la parte de RNA antisentido del mismo está enlazada complementariamente con RNA procedente del gen diana para escindir el RNA procedente del gen diana mediante la actividad de endonucleasa de su parte de ribozima, por lo que es reprimida la expresión del gen diana.

La enzima que produce el factor lacrimatorio, de la presente invención, contiene muchos sitios que pueden constituir las dianas de la ribozima.

La ribozima del tipo de "horquilla de pelo" es útil también para la finalidad de la presente invención. La ribozima del tipo de "horquilla de pelo" se encuentra, por ejemplo, en una cadena menos de RNA satélite del virus de la mancha circular del tabaco (J. M. Buzayan, Nature, 323:349, 1986). Se ha sugerido que también esta ribozima está destinada a causar la escisión del RNA específico de la diana (Y. Kikuchi y N. Sasaki, Nucleic Acids Res. 19:6751, 1992, y Hiroshi Kikuchi, Kagaku to Seibutsu 30:112, 1992).

La ribozima diseñada para dividir la diana es ligada con un promotor tal como el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor y una secuencia de terminación de la transcripción con lo que ésta es transcrita en las células vegetales. En este caso, si se añade una secuencia superflua al extremo terminal 5' o al extremo terminal 3' del RNA transcrito, la actividad de la ribozima puede perderse. En tal caso, es posible disponer otra ribozima que corte la actuación cis para cortar en el lado 5' o el lado 3' de la parte de ribozima, para escindir con precisión solamente la parte de la ribozima procedente del RNA transcrito que contiene ribozima (K. Taira et al., Protein Eng. 3:733, 1990; A.M. Dzianott y J.J. Bujarski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:4823, 1989; C. A. Grosshans y R.T. Cech, Nucleic Acids Res. 19:3875, 1991; K. Taira et al., Nucleic Acids Res. 19:5125, 1991). También es posible mejorar el efecto disponiendo en tándem las unidades constitutivas para que puedan ser escindidos dos o más sitios del gen diana (N. Yuyama et al., Biochem. Biophys. Res. Vommun. 186: 1271, 1992). La expresión del gen diana de la presente invención puede ser reprimida escindiendo específicamente con la ribozima el producto de transcripción del gen. Las técnicas de uso de la ribozima están descritas en J.P. KOKAI No. 2001-238686.

El DNA para reprimir la expresión del gen de la enzima que produce el factor lacrimatorio, de la presente invención, comprende:

una secuencia que produce uno o más RNAs que poseen actividad de endonucleasa,

por lo menos una secuencia seleccionada entre las secuencias que siguen y

una secuencia reguladora unida a dichas secuencias para hacer posible la transcripción:

(a) una secuencia génica de una enzima que produce factor lacrimatorio o una parte de la secuencia génica, en orientación antisentido;

(b) una secuencia reguladora de un DNA en el DNA genómico de un vegetal, determinado sobre la base del gen de la enzima que produce el factor lacrimatorio o una parte de la secuencia reguladora en orientación antisentido; y

(c) una secuencia de DNA ubicada entre el gen de la enzima que produce el factor lacrimatorio y la secuencia reguladora del DNA del DNA genómico del vegetal, determinado sobre la base del gen o una parte de la secuencia de DNA en orientación antisentido.

Las secuencias (a) a (c) usadas para el DNA para reprimir la expresión del gen de la enzima que produce el factor lacrimatorio son como se ha descrito anteriormente.

Para reprimir la generación del factor lacrimatorio en vegetales mediante el uso del DNA que reprime la expresión del gen de la enzima que produce el factor lacrimatorio, de la presente invención, este DNA se inserta en un vector adecuado, el vector es introducido en una célula vegetal y la célula vegetal transformada obtenida de este modo es regenerada. Los vectores usados no están limitados en tanto en cuanto satisfagan las condiciones siguientes:

\bullet El gen insertado pueda integrarse en el DNA genómico de un vegetal.

\bullet El vector tenga por lo menos 3 sitios de clonación para insertar el DNA que ha de ser introducido.

Los promotores enlazados para expresar el gen introducido no están limitados, en tanto en cuanto sean capaces de expresar ordinariamente genes en células vegetales. Estos promotores son, por ejemplo, el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor, el promotor de ubiquitina-1 del maíz y el promotor de nopalina sintasa.

Los órganos y tejidos vegetales en los que ha de introducirse el gen no están limitados, en tanto en cuanto mantengan el efecto de rediferenciación sobre los cuerpos vegetales. Se prefiere un tejido del callo que posea el efecto de rediferenciación Puede usarse cualquiera de células cultivadas, protoplastos, otros órganos y tejidos vegetales que posean el efecto de rediferenciación.

Los métodos de introducción del gen incluyen, por ejemplo, un método en el que un vegetal es infectado con un microorganismo del género Agrobacterium que posee un plásmido vector que tiene el gen introducido en él, un método en el que un vector que tiene el gen introducido en él es introducido en un protoplasto vegetal mediante el método de electroporación, y un método en el que el vector es introducido en una célula vegetal mediante el método de la "pistola de partículas" ("Model Shokubutsy no Jikken Protocol (Protocolo experimental de plantas modélicas)" compilado bajo la supervisión de Isao Shimamoto et al., páginas 82-98 (1996)).

Se ha descrito antes el método para reprimir la expresión del gen de la enzima que produce el factor lacrimatorio, principalmente con referencia a las técnicas de las orientaciones sentido y antisentido, RNAi y ribozima. Puede emplearse cualquiera de estas técnicas. Uno de los métodos comprende la recombinación directa de una parte del gen estructural del DNA genómico del vegetal. Por ejemplo, un método que puede ser empleado aquí comprende la introducción de un oligonucleótido quimérico en el que el RNA y el DNA están unidos complementariamente uno a otro, ocasionando una recombinación complementaria de una parte de los genes estructurales del genoma del vegetal. Reemplazando previamente una o dos bases de la secuencia del oligonucleótido quimérico que ha de ser introducido, con otras bases diferentes de las del gen estructural, el mRNA transcrito desde el gen estructural recombinante tiene una o dos bases reemplazadas. Puede cambiarse la variedad de los aminoácidos traducidos desde el mRNA, seleccionando adecuadamente las bases que han de reemplazarse. Alterando los aminoácidos del centro activo que desempeñan un papel importante en la actividad fisiológica de la proteína (actividad de la proteína de la enzima), puede reprimirse la expresión del gen estructural. En los vegetales, la frecuencia de recombinación está limitada a tan baja como 1/1000 a 1/10000 y el número de bases que han de ser recombinadas está limitada a 1 ó 2 (T. Zhu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 8768-8773 (1999)). Sin embargo, esta técnica es utilizable para reprimir la expresión del gen diana. Además de los métodos del nucleótido quimérico descritos, son utilizables también técnicas de marcación genética tales como la técnica de marcación de T-DNA y la técnica de marcación de transposón, en las que el DNA genómico del vegetal es atacado directamente.

Para reprimir el efecto de la enzima que produce el factor lacrimatorio, es posible emplear un método en el que se añade un inhibidor o un método en el que se fuerza a las cebollas a producir el inhibidor. Se prefiere el método en el que se reprime la expresión de la enzima que produce el factor lacrimatorio per se, debido a que el inhibidor ejerce, posiblemente, influencia sobre enzimas distintos de la enzima que produce el factor lacrimatorio. Los métodos para reprimir la expresión de la enzima que produce el factor lacrimatorio incluyen un método en el que se obtiene un vegetal de una variante pretendida mediante la irradiación con rayos \gamma, o usando un compuesto químico que induce variación tal como EMS (sulfonatos de etilmetano) y un método en el que se obtiene por apareamiento el vegetal variante pretendido. No obstante, cuando se induce la variación de un vegetal, la variación podría tener lugar no solo en la represión de la expresión de la enzima que produce el factor lacrimatorio y, por consiguiente, se requiere la selección subsiguiente del producto pretendido para alargar el período de la técnica, en general.

Modo de llevar a cabo la invención

Los métodos de introducción de DNA para reprimir la expresión de los genes de la enzima que produce el factor lacrimatorio y la selección y confirmación de los vegetales de expresión reprimida, de la presente invención, son, en líneas generales, como se describe seguidamente

(1) Preparación de vector

Se prepara un vector uniendo cualquiera de las secuencias en la orientación sentido de la secuencia de la longitud total del gen de la enzima que produce el factor lacrimatorio o una parte de la misma (de preferencia al menos 18 bp, más preferiblemente 22 bp por lo menos), la secuencia de su orientación antisentido y la secuencia que contiene ambas orientaciones, con una región aguas abajo de la región reguladora (promotor), enlazando un terminador con una región aguas abajo del mismo e integrando el producto en un plásmido. El procedimiento que sigue puede ser realizado según una técnica ordinaria de clonación de genes.

\ding{172} El plásmido obtenido subclonando el gen de la enzima que produce el factor lacrimatorio, es introducido en E. coli (tal como XL1-Blue) y hecho proliferar. Se lleva a cabo PCR usando el plásmido como molde para amplificar la longitud total o una parte de la secuencia del gen de la enzima que produce el factor lacrimatorio. La secuencia amplificada se une a un promotor para obtener la orientación pretendida. Se añade un terminador y esta secuencia es integrada en el plásmido.

Como promotor puede usarse, por ejemplo, el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor. También pueden utilizarse otros promotores en tanto en cuanto la expresión en las células vegetales sea posible. Como terminador, puede utilizarse, por ejemplo, el terminador de la nopalina sintasa. También pueden usarse otros terminadores.

Aunque pueden usarse plásmidos ordinarios tales como el pBI101 como los plásmidos para la integración de los genes, los plásmidos no están limitados a ellos. Cuando se usa para la integración del gen un plásmido que posea un marcador de selección (un marcador resistente a antibióticos tales como la higromicina y la kanamicina), se facilita la selección del transformante.

\ding{173} El plásmido \ding{172} puede ser recombinado con Agrobacterium por propagación del plásmido \ding{172} en E. coli (tal como HB101) y apareando triparentalmente este E. coli con E. coli que tenga un plásmido auxiliar (tal como HB101 (pRK2013)) y Agrobacterium que tenga un plásmido Ti auxiliar (tal como el pAL4404) (por ejemplo, se prefiere el Agrobacterium tumefaciens LBA4404, pero pueden emplearse también otra bacterias del género Agrobacterium tales como las EHA105 y EHA101). Además del apareamiento triparental con E. coli que tiene el plásmido auxiliar, es posible también introducir directamente el plásmido que tiene la secuencia génica introducida, en Agrobacterium mediante el método de electroporación.

(2) Preparación de materiales vegetales tales como cebollas para usar para la recombinación

\ding{172} Los materiales vegetales no están limitados en tanto en cuanto tengan facultad de rediferenciación (facultad de regenerar el cuerpo vegetal).

En vegetales de la familia de las Liliáceas tales como la cebolla, se usa preferiblemente un callo que tiene la facultad de rediferenciación, derivado del cuerpo del vegetal. Los órganos de los vegetales liliáceos tales como la cebolla, desde la que se deriva el callo, son, por ejemplo, embriones maduros o prematuros procedentes de semillas, raíces primarias germinadas procedentes de semillas, punto de crecimiento de hoja escamosa y placa basal de bulbo de cebolla.

\ding{173} La composición del medio de cultivo en el que es derivado el callo es, preferiblemente, la composición del medio MS utilizable habitualmente para el cultivo de vegetales, y también pueden utilizarse medios de cultivo que tienen otras composiciones. Un componente indispensable del medio de derivación del callo es la auxina, que es una fitohormona. La concentración de auxina es, preferiblemente, 1 a 100 \muM. Las auxinas preferidas para derivar los callos incluyen 4-FPA (ácido 4-fluorofenoxiacético), Picrolam (ácido 4-amino-3,5,6-tricloro-2-piridinacarboxílico), 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético), etc. También pueden utilizarse otras auxinas.

\ding{174} El callo se cultiva en condiciones adecuadas para el cultivo. El cultivo se lleva a cabo preferiblemente bajo irradiación con una luz fluorescente de 1000 a 3000 lux, aproximadamente, a 25ºC. El callo derivado puede ser mantenido mediante el subcultivo. Para usar el callo manteniendo su facultad de rediferenciación, se prefiere que el período de cultivo para la derivación del callo sea acortado y que el número de veces del subcultivo sea reducido. En concreto, el período del cultivo para la derivación del callo es de 3 a 4 meses, aproximadamente, y el número de veces del subcultivo es 3 ó menos.

\ding{175} Cuando se usa la cebolla o un vegetal semejante, la facultad de rediferenciación del callo varía significativamente dependiendo de su variedad. Así pues, es deseable usar una variedad que tenga la facultad de diferenciación más alta. Las variedades preferidas de cebolla son, por ejemplo, Sen-shyuu-chu-kodakai, kurenai, momiji y tenju.

(3) Infección de callo con un vector de introducción génica

\ding{172} Los microbios de Agrobacterium que tienen el vector de introducción génica obtenido en (1), fueron propagados y se introdujo un callo en la suspensión de microbios. Es importante en esta etapa añadir acetosiringona que es un compuesto que se requiere para la infección de monocotiledóneas con Agrobacterium. La concentración de acetosiringona es, preferiblemente, 100 a 200 \muM.

\ding{173} Después del cultivo conjunto de los microbios y el callo durante 3 días por lo menos, de preferencia 4 a 6 días aproximadamente, se elimina el Agrobacterium con un antibiótico tal como cefotaxima (claforán) o carbenicilina.

(4) Selección de transformantes individuales procedentes desde el callo infectado

El callo se cultiva y se hace crecer en un medio que contiene antibióticos para obtener un marcador resistente a antibióticos tal como higromicina y kanamicina, incluidos con anterioridad en el vector, y después es rediferenciado. Los individuos vivientes son los individuos que han tenido éxito en la transformación. En cuanto a la composición del medio de cultivo usado para la rediferenciación procedente del callo, puede usarse la composición del medio MS utilizado habitualmente para el cultivo de vegetales y también son utilizables medios de cultivo que tienen otras composiciones. Es importante retirar la auxina del medio de rediferenciación.

(5) Confirmación de transformantes individuales

La introducción del gen pretendido en el vegetal de rediferenciación, es confirmada mediante extracción de DNA del vegetal y examen por el método de hibridación southern (Hiroki Nakayama et al., Bio experiment Illustrated \ding{173} Idenshi Kaisetu no Kiso, páginas 137-151 (1995)). Para confirmar si el vegetal rediferenciado tiene o no la actividad enzimátíca que produce el factor lacrimatorio, se emplea el método de la Solicitud de Patente Internacional PCT/JP01/07465 descrito seguidamente.

Método para determinar la actividad enzimática que produce el factor lacrimatorio

Una suspensión de enzima cruda extraída de individuos transformados se diluye con un tampón de dilución (tampón de fosfato potásico 50 mM, pH 6,5). 40 \mul de aliinasa de ajo (50 unidades/ml) y 20 \mul de solución de PeCSO (20 mg/ml), se añaden a 10 \mul de la muestra diluida. Después de llevar a cabo la reacción a temperatura ambiente durante 3 minutos, 1 \mul de la mezcla de reacción se somete a HPLC para determinar la cantidad de factor lacrimatorio obtenida de este modo. Para el análisis se emplea una columna de ODS (4,6 \Phi x 250 mm) (un producto de Senshuu Kagaku Co.), o una columna de DOCOSIL. (4,6 \Phi x 250 mm) (un producto de Senshuu Kagaku Co.). Como fase móvil se usa MeOH acidificado al 30% (v/v), el caudal es 0,6 ml/min, la temperatura de la columna es 35ºC y la detección se lleva a cabo a 254 nm.

Ejemplo de Referencia

En los vegetales con expresión reprimida de la enzima que produce el factor lacrimatorio, el factor lacrimatorio no es producido partiendo del ácido 1-propenilsulfénico sino que este compuesto actúa como origen del olor independientemente de la enzima y, además, se supone que se producen compuestos tiosulfinato que tienen efecto antiasmático, en una cantidad igual o mayor que la que se obtiene en la técnica anterior. Este hecho ha sido comprobado mediante los experimentos que se describen seguidamente.

(1) Preparación de aliinasa de ajo cruda exenta de la enzima que produce el factor lacrimatorio

Se añadieron 110 ml de agua destilada a 110 g de ajo fresco producido en China, se cortaron en pedazos con un mezclador y luego se sometió a centrifugación para separar la materia insoluble. Se añadió ácido clorhídrico al sobrenadante obtenido, con agitación, ajustando el pH del sobrenadante a 4. Se continuó la agitación durante 30 minutos más y después se recuperó por centrifugación el precipitado así formado. El precipitado se disolvió en 50 ml de tampón de fosfato potásico 50 mM que contenía glicerina al 10% y fosfato de piridoxal 20 \muM, pH 6,5, y después se determinó la actividad de aliinasa. La solución se diluyó adicionalmente con tampón de fosfato potásico 50 mM que tenía un pH de 6,5, ajustando su concentración a 6 unidades/ml. El procedimiento descrito se llevó a cabo a temperatura baja.

(2) Preparación de aliinasa de ajo cruda que contenía la enzima que produce el factor lacrimatorio

250 ml de tampón de fosfato potásico 20 mM que contenía 2,5 mg/ml de fosfato de piridoxal y que tenía un pH de 7,5, se añadieron a 250 g de cebolla amarilla de Sapporo, se cortó en pedazos con un mezclador y luego se filtró y centrifugó para separar la materia insoluble. Se añadió sulfato amónico con agitación al sobrenadante obtenido, ajustando la concentración del sobrenadante a 65%. Se continuó agitando durante 1 hora más y luego se recuperó por centrifugación el precipitado formado. El precipitado se disolvió en 50 ml de tampón de fosfato potásico 50 mM que contenía glicerina al 10%, mercaptoetanol al 0,05% y EDTA 5 mM, que tenía un pH de 7,5. Después de diálisis durante 3 horas con tampón de fosfato potásico 50 mM que contenía glicerina al 10%, mercaptoetanol al 0,05% y EDTA 5 mM y que tenia un pH de 7,5, se centrifugó el producto obtenido para separar la materia insoluble y se determinó después su actividad de aliinasa. El producto se diluyó con tampón de fosfato potásico 50 mM, pH 6,5. ajustando su concentración a 6 unidades/ml. El procedimiento antes descrito se llevó a cabo a temperatura
baja.

(3) La determinación de tiosulfinatos por el método de la N-etilmaleimida

350 \mul de tampón de fosfato potásico que tenía un pH de 6,5. se añadieron a 50 \mul de solución de PeCSO de 5 mg/ml. Después se añadieron a la mezcla obtenida 600 \mul aliinasa de cebolla cruda o aliinasa de ajo cruda, 6 unidades/ml, y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 1 minuto. Inmediatamente después de la reacción, se mezclaron con la mezcla de reacción 500 \mul de éter dietílico. Después de centrifugar, se tomaron desde la capa de éter etílico 100 \mul de muestra. 300 \mul de solución 0,05 M de N-etilmaleimida en el seno de 2-propanol, 300 \mul de solución 0,25 M de hidróxido potásico en 2-propanol y 450 \mul de solución de ácido ascórbico obtenida disolviendo 1 g de ácido ascórbico en 100 ml de agua destilada, se añadieron a la muestra y se mezcló. Los tiosulfinatos fueron determinados sobre la base de la coloración a 515 nm.

La determinación se llevó a cabo cinco veces para la aliinasa cruda procedente de cebolla, que contiene factor lacrimatorio, y también para la aliinasa cruda procedente del ajo, exenta de factor lacrimatorio. El blanco para cada enzima usada en los ensayos se preparó añadiendo 50 \mul de un tampón de fosfato potásico de pH 6,5 en lugar de 50 \mul de solución de PeCSO.

(4) Resultados de la determinación

Los resultados de la determinación de los tiosulfinatos se muestran en la Fig. 2. Ha de entenderse desde la Fig. 2 que la cantidad de los tiosulfinatos aumenta significativamente más por resolución del PeCSO con la aliinasa de ajo cruda exenta de factor lacrimatorio que por resolución del PeCSO con la aliinasa de cebolla, cruda, que contiene el factor lacrimatorio (nivel de significación del ensayo, t: 1%). Para el blanco de cada enzima no hubo diferencias importantes incluso cuando el nivel de significación fuera 5%. Por tanto, puede suponerse que la cantidad de tiosulfinatos formada puede ser incrementada por represión de la enzima que produce el factor lacrimatorio, de la cebolla.

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Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 muestra el gen de la enzima que produce el factor lacrimatorio y su región reguladora, así como la orientación la secuencia de DNA intermedia del mismo.

La Fig. 2 muestra los resultados de la determinación de los tiosulfinatos obtenidos en el Ejemplo de Referencia.

La Fig. 3 es un mapa del pPCV91.

La Fig. 4 muestra la actividad de LFS de un vegetal rediferenciado, transformado.

La Fig. 5 muestra la cantidad de proteína de LFS de un vegetal rediferenciado, transformado.

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Modo mejor para llevar a cabo la invención Ejemplos

La introducción de DNA para reprimir la expresión del gen de la enzima que produce el factor lacrimatorio, de la presente invención, en vegetales así como la selección y confirmación de los vegetales reprimidos en la expresión, se llevan a cabo, concretamente, mediante los métodos siguientes, que por ningún medio limitan la invención.

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Ejemplo 1

(1) Preparación de muestra de callo cultivado (i) Variedades de cebolla

Se seleccionó como la muestra, cebolla Sen-shyuu-chu-kodakaki producida en Japón, fue seleccionada como muestra.

(ii) Inducción de callo de cebolla

Semillas de cebolla completamente maduras fueron esterilizadas en la superficie sumergiendo las semillas en etanol de 70% durante 10 minutos y después en una solución de hipoclorito sódico que tenía una concentración de cloro eficaz de 3,3%, durante 20 minutos, e implantando luego en un medio de inducción de callo (sales inorgánicas de MS y vitaminas (Murashige, T y Skoog, F., 1962; Physiol. Plant., 15, 473-497), ácido fluorofenoxiacético 50 \muM, 2-isopenteniladenina 1 \muM, sacarosa 0,1 M, hidrolizado de caseína, 1 g/l, ácido N-morfolinoetanosulfónico 10 mM y goma de gelano, 2 g/l, pH 5,8) Después de realizar el cultivo bajo irradiación con una luz fluorescente de 1000 lux a 25ºC durante 2 ó 3 meses, se obtuvo un callo procedente de la raíz primaria germinada. El ácido N-morfolinoetanosulfónico añadido al medio de inducción del callo, era un reactivo capaz de mantener constante el pH del medio. Con respecto al efecto de este reactivo, el número de las semillas en las que tuvo lugar la inducción de callo, había aumentado y había aumentado el tamaño del callo al adicionarlo.

(iii) Multiplicación de callos de cebolla

Los callos obtenidos mediante el método (ii) anteriormente descrito se hicieron pasar a través de un tamiz de malla de acero inoxidable que tenía una finura de 1 mm. 0,2 a 0,4 g de los finos obtenidos de este modo fueron puestos en 30 ml de medio 1 de multiplicación de callos (sales inorgánicas de MS y vitaminas, ácido 4-fluorofenoxiacético 50 \muM, 2-isopenteniladenina 1 \muM, sacarosa 0,1 M, hidrolizado de caseína, 1 g/l, y ácido N-morfolinoetanosulfónico 10 mM, pH 5,8) en un matraz Erlenmeyer de 100 ml. Después de agitar el cultivo a 100 rpm con irradiación con una luz fluorescente de 1000 lux, a 25ºC, durante 3 semanas, los callos multiplicados fueron puestos en 80 ml de medio de multiplicación 2 (sales inorgánicas de MS y vitaminas, ácido 4-fluorofenoxiacético 50 \muM, 2-isopenteniladenina 1 \muM, sacarosa 0,2 M, hidrolizado de caseína, 1 g/l, y ácido N-morfolinoetanosulfónico 10mM, pH 5,8) en un matraz Erlenmeyer de 200 ml. Después de agitar el cultivo a 100 rpm bajo irradiación con una luz fluorescente de 1000 lux, a 25ºC, durante 3 a 4 semanas más, se obtuvo el callo de cebolla multiplicado.

(2) Preparación de plásmido (vector)

Se preparó un plásmido, ilustrado más adelante, integrando una cadena de orientación sentido o una cadena de orientación antisentido o ambas de ellas, de un gen resistente a la higromicina (hph) y una parte (correspondiente a los Nos. 102 a 559 de la secuencia de bases de SEQ ID NO. 11) del gen (gen LFS) de la enzima de cebolla que produce el factor lacrimatorio (LFS) y el primer intrón del gen de desaturasa 2 de ácido graso (FAD2) de Arabidosis thaliana, en la región R de DNA.

Aun cuando la inserción del intrón no es indispensable, su efecto es conocido. A saber, insertando el intrón como un espaciador entre la cadena de orientación sentido y la cadena antisentido, la secuencia de DNA que se repite, invertida, que comprende la cadena de orientación sentido y la cadena antisentido, se estabiliza (Smith, N. A. et al., 2000; Nature, 407:319-320). También es sabido que cuando la cadena de orientación sentido y la cadena antisentido se usa sola, el efecto de restricción de la expresión génica mejora insertando el intrón cerca de la cadena (Wesley, S. V. et al., 2001; The Plant Journal, 27(6): 581-590). La cadena de orientación sentido y la cadena antisentido del gen LFS y el intrón, fueron amplificadas por PCR a partir del DNA genómico de la cebolla y del DNA genómico de Arabidopsis thaliana, respectivamente, con referencia a "un método de amplificación de genes por PCR con un cebador con anclaje de una enzima de restricción" (Levin, J.Z. et al., 2000; Plant Molecular Biology, 44:759-
775).

(i) Plásmido superbinario 1. Preparación de un vector intermedio

Una casete de expresión resistente a la higromicina, de pPCV91 (Fig. 3) (una fracción obtenida enlazando un promotor de la nopalina sintasa (pnos), un gen de higromicina fosfotransferasa (hph) y señal poli A del gen 4 del plásmido Ti de Agrobacterium (pAg4)m el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (caMV) en el pBI121 (adquirido de Invitrogen) y terminador de nopalina sintasa, fueron insertados por este orden en un lado del borde derecho de la región de DNA T del vector intermedio superbinario pSB11 (Komari, T. et al., 1996; The Plant Journal, 10(1):165-174). Después de la inserción, la cadena de orientación sentido del gen LFS de la cebolla y después el intrón de FAD2 fueron insertados entre el promotor 35S del vector y el terminador de nopalina sintasa, obteniendo un vector intermedio de orientación sentido. Después, el intrón de FAD2 y luego la cadena antisentido del gen LFS de la cebolla fueron insertados en este orden obteniendo un vector intermedio antisentido. Después, la cadena de orientación sentido del gen LFS de la cebolla, el intrón de FAD2 y la cadena antisentido del gen LFS de la cebolla, fueron insertados por este orden, obteniendo el vector intermedio de RNAi.

2. Preparación de un vector superbinario

Los genes deseados de los tres tipos de los vectores intermedios preparados en el proceso 1 anterior, fueron introducidos en el vector aceptador superbinario pSB1 (Komari, T. et al., 1996; The Plant Journal, 10(1): 165-174) mediante la recombinación homóloga. Por tanto, el vector intermedio y el pSB1, ambos, tenían una secuencia homóloga de 2,7 kb y la recombinación homóloga tuvo lugar en esta región formando un nuevo vector superbinario compuesto del vector intermedio y el pSB1 unidos uno con otro. La recombinación homóloga ocurre cuando el vector intermedio previamente introducido en E. coli es introducido en Agrobacterium en el que ha sido introducido el pSB1, mediante la técnica de triple cruce (Ditta, G. et al., 1980; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:7347-7351) lo que se establecerá en el párrafo (3). El vector superbinario pSBsentido se obtuvo mediante la recombinación homóloga del vector intermedio de orientación sentido con el pSB1. El pSBantisentido se obtuvo mediante la recombinación homóloga del vector intermedio antisentido con el pSB1. El vector superbinario pSBRNAi se obtuvo mediante la recombinación homóloga del vector intermedio de RNAi con el pSB1.

(ii) Plásmido binario

Una casete de expresión resistente a la higromicina de pPCV91 (una fracción obtenida enlazando un promotor de nopalina sintasa (pnos), el gen de la higromicina fosfotransferasa (hph) y la señal poli A del gen 4 del plásmido Ti de Agrobacterium (pAg4), fue insertada entre el terminador de nopalina sintasa y el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) en la región de DNA T del pBI121. Luego el gen de la \beta-glucuronidasa (GUS) fue retirado por el procedimiento realizado con una enzima de restricción. La cadena de orientación sentido del gen LFS de la cebolla y el intrón FAD2 fueron insertados, por este orden, en una parte desde la que había sido separado el gen GUS, sobre el lado del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) obteniendo el vector binario pBIsentido. Además, el intrón FAD2 y la cadena antisentido del gen LFS de la cebolla fueron insertados, por este orden, en él, obteniendo el vector binario pBIantisentido. Además, la cadena de orientación sentido del gen LFS de la cebolla, el intrón FAD2 y la cadena antisentido del gen LFS de la cebolla, fueron insertados, por este orden, obteniendo el vector binario
pBIRNAi.

(3)Agrobacterium parasítico

Se usó como la bacteria parasítica la Agrobacterium LBA4404 (comprada a Invitrogen) obtenida retirando la región de DNA T del plásmido Ti. El LBA4404 es un microorganismo que posee el plásmido auxiliar pAL4404 que tiene una región perfecta de virulencia.

Diversos vectores preparados en el párrafo anterior (2) fueron introducidos en el LBA4404 mediante la técnica de triple cruce para bacterias, y el microorganismo obtenido se usó como Agrobacterium para introducir un gen en el callo de la cebolla. Cuando un vector superbinario intermedio hubo de ser introducido, el LBA4404 (Agrobacterium en el que el vector aceptador superbinario pSB1 tenía que ser introducido) se empleó así para que el vector superbinario pudiera ser obtenido mediante la recombinación homóloga del vector intermedio y el vector aceptador. En la técnica del triple cruce. los medios de cultivo para seleccionar Agrobacterium en el que había de ser introducido el plásmido pretendido, fueron el medio AB que contiene espectinomicina (50 \mug/ml) (Chilton et al., 1974; Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 71: 3672-3676) para el vector superbinario, y el medio MinA que contiene kanamicina (400 \mug/ml) (Miller, J. H., 1972: Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York) para el vector binario. Se hace referencia al Agrobacterium en el que el plásmido (vector) ha sido introducido, con el nombre del microorganismo seguido del nombre del plásmido entre paréntesis, tal como LBA4404(pSBsentido). Los microorganismos que siguen fueron usados para introducir el gen en callos de la cebolla:

LBA4404(pSBsentido), LBA4404(pSBantisentido), LBA4404(pSBRNAi), LBA4404(pBIsentido), LBA4404
(pBIantisentido) y LBA4404(pBIRNAi).

(4) Preparación de suspensión de Agrobacterium

Cuando se uso LBA4404(pSBsentido), LBA4404(pSBantisentido) o LBA4404(pSBRNAi), éste se inoculó en medio de cultivo AB que contenía espectinomicina (50 \mug/ml), y cuando se usó LBA4404(pBIsentido), LBA4404(pBIantisentido) o LBA4404(pBIRNAi), éste fue inoculado en medio de cultivo MinA que contenía kanamicina (400 \mug/ml), y se realizó el cultivó a 28ºC durante 3 ó 4 días. Las células cultivadas fueron raspadas con una espátula y luego suspendidas en un medio de cultivo de suspensión de Agrobacterium (sales inorgánicas de MS y vitaminas, 2-isopenteniladenina 1 \muM, sacarosa 0,1 M, hidrolizado de caseína 1 g/l, ácido N-morfolinoetanosulfónico 10 mM y acetosiringona 10 mg/l, pH 5,8), y se reguló la turbiedad (DO600) a 0,15 a 0,20. La suspensión obtenida se usó para la infección.

(5) Infección de callos de cebolla con Agrobacterium

El callo de multiplicación de la cebolla preparado en el proceso (1) anterior, fue sumergido durante 1,5 a 2 minutos en la suspensión de Agrobacterium anteriormente descrita. Después de la inmersión, la suspensión de células superflua fue retirada del callo de la cebolla con una toalla de papel y el callo de la cebolla se colocó en medio MSCO (sales inorgánicas de MS y vitaminas, 2-isopenteniladenina 1 \muM, sacarosa 0,1 M, glucosa 10 g/l, hidrolizado de caseína 1 g/l, ácido N-morfolinoetanosulfónico 10 mM, acetosiringona 10 mg/l, y goma de gelano 2 g/l, pH 5,8) y se cultivó en oscuridad a 25 - 28ºC durante 3 ó 4 días.

(6) Selección de individuos transformados

El callo de cebolla cultivado conjuntamente con Agrobacterium durante 3 ó 4 días, se lavó con agua esterilizada que contenía 500 mg/l de cefotaxima y luego se transplantó a medio MSSE que contenía 500 mg/l de cefotaxima (sales inorgánicas de MS y vitaminas, 2-isopenteniladenina 1 \muM, sacarosa 0,1 M, hidrolizado de caseína 1 g/l, ácido N-morfolinoetanosulfónico 10 mM y goma de gelano 2 g/l, pH 5,8), se cultivó bajo irradiación con una luz fluorescente de 3.000 a 4.000 lux, a 25ºC, durante 1 semana, y luego se hizo pasar a medio MSSE que contenía cefotaxima, 250 mg/l e higromicina, 50 mg/l. El cultivo se continuó bajo irradiación con una luz fluorescente de 3.000 a 4.000 lux, a 25ºC, para seleccionar las células rediferenciadas, transformadas. Las células rediferenciadas obtenidas fueron movidas a medio MSSE que contenía 250 mg/l de cefotaxima y 50 mg/l de higromicina, y que tenía un grado de solidificación aumentado mediante la adición de 5 g/l de agar. Se continuó el cultivo en las mismas condiciones que las descritas para hacer crecer las células. Mediante el aumento del grado de solidificación del medio con agar, se reguló la vitrificación del vegetal rediferenciado (es decir, un fenómeno de conversión del tejido vegetal en un tejido transparente semejante al vidrio y que hace imposible el crecimiento normal. Este fenómeno se observa frecuentemente al cultivar un tejido en tubos de ensayo), y se aumentó el número de las células que habían crecido como el vegetal
normal.

(7) Eficacia de la aparición de células rediferenciadas resistentes a higromicina, dependiendo de los vectores

Los vegetales rediferenciados resistentes a higromicina surgieron de callos de cebolla infectados con Agrobacterium que tenían diversos vectores introducidos. (Tabla 1)

TABLA 1 Eficacia de la aparición de vegetales rediferenciados resistentes a higromicina, dependiendo del vector

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1

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Cuando el vector usado fue un vector superbinario (pSB), que tenía una propiedad infecciosa fuerte, sobre vegetales, el grado de aparición del vegetal rediferenciado resistente a higromicina fue 2 a 15%, y cuando el vector usado era un vector binario ordinario (pBI), el grado de aparición del vegetal rediferenciado resistente a higromicina fue 7 a 10%. No se encontró diferencia importante en el grado de aparición del vegetal rediferenciado resistente a higromicina dependiendo de la diferencia de vector. El vegetal rediferenciado resistente a higromicina se obtuvo usando cualquier vector.

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Ejemplo 2

Un vegetal rediferenciado, S, obtenido de callos de cebolla, cultivado conjuntamente con LBA4404(pBIsentido) y resistente a la higromicina, así como un vegetal rediferenciado, A, obtenido de callos de cebolla, cultivado conjuntamente con LBA4404(pBIantisentido) y resistente a la higromicina, fueron analizados del modo siguiente:

(1) Análisis de gen introducido en un cuerpo vegetal rediferenciado, transformado

Se llevó a cabo el método de PCR para examinar si un gen pretendido había sido introducido o no en un cuerpo vegetal rediferenciado obtenido por la selección con higromicina

(i) Extracción de DNA desde un cuerpo vegetal rediferenciado resistente a la higromicina

Hojas de un cuerpo vegetal rediferenciado resistente a la higromicina, fueron usadas como el material de partida. Se extrajo DNA de las hojas con el Dneasy Plant Mini Kit (un producto de QIAGEN Co.) según las instrucciones del Manual de Dneasy Plant Mini Kit incluido en el kit.

(ii) Cebadores para la detección

Se empleó una combinación de los 5 tipos de cebadores que siguen para realizar la PCR, para conformar la presencia del gen introducido.

Cebador A: {}\hskip0,5cm 5'-AATTAAGGGAGTCACGTTATGACCC-3'

(SEQ ID NO. 17)

Cebador B: {}\hskip0,5cm 5'-AGAAACTTCTCGACAGACGTCGC-3'

(SEQ ID NO. 18)

Cebador C: {}\hskip0,5cm 5'-GTGGCAATCCCTTTCACAACCTG-3'

(SEQ ID NO. 19)

Cebador D: {}\hskip0,5cm 5'-TGGAGGGTCCTGAGCACAAG-3'

(SEQ ID NO. 20)

Cebador E: {}\hskip0,5cm 5'-TGCGGGACTCTAATCATAAAAACCCAT.3'

(SEQ ID NO. 21)

El cebador A se reasocia (hibridación de extremos complementarios) con el promotor de nopalina sintasa del gen introducido, y el cebador B se reasocia con el gen de higromicina fosfotransferasa de los genes introducidos. Usando la combinación de cebador A y cebador B para la PCR, puede confirmarse la presencia del gen resistente a la higromicina en los genes introducidos. Se obtiene un producto de amplificación de 344 bp a partir de DNA del cuerpo vegetal que contiene introducido en él el gen resistente a la higromicina.

El cebador C se reasocia con el intrón FAD2 del gen introducido, y el cebador D se reasocia con el gen LFS. Usando la combinación de cebador C y cebador D para la PCR, puede confirmarse la presencia de la cadena antisentido del gen LFS de la cebolla en los genes introducidos. Se obtiene un producto de amplificación de 326 bp a partir de DNA del cuerpo vegetal (cuerpo vegetal transformado con LBA4404(pBIantisentido)) que contiene la cadena antisentido del gen LFS de la cebolla introducido en él.

El cebador E se reasocia con el terminador de nopalina sintasa del gen introducido. Usando la combinación de cebador C y cebador E para la PCR, puede confirmarse la ausencia de la cadena antisentido del gen LFS en el DNA de la cebolla en el que está introducida una construcción exenta de cadena antisentido o, en otras palabras, una construcción compuesta de la cadena de orientación sentido e intrón. Se obtiene un producto de amplificación de 360 bp a partir de DNA del cuerpo vegetal de la cebolla (LBA4404(pBIsentido)) que contiene introducida en él, una construcción exenta de cadena antisentido.

(iii) PCR

Se llevó a cabo una PCR usando AmpliTaq Gold(R) and 10 X PCR Buffer II y Solución de MgCl_{2} con dNTP (un producto de Applied Biosystems Co.) mediante el método siguiente:

0,125 \mul de AmpliTaq Gold (5 U/\mul), 2,5 \mul de Mezcla de dNTPs (2 mM de cada) y 1,5 \mul de solución de MgCl_{2} (25 mM), se añadieron a 2,5 \mul de Tampón II de PCR 10 X. Luego se añadieron a la mezcla obtenida 0,5 \muM (concentración final) de cada uno de un par de cebadores y DNA de molde. Se añado agua ultrapura esterilizada para completar la cantidad total de 25 \mul. La solución para la reacción se colocó en un microtubo de 0,2 ml. Después de la activación enzimática (94ºC, 10 minutos) con el dispositivo térmico de ciclicidad Gene Amp PCR System 2400 (Applied Biosystems Co.), las reacciones de desnaturalización (94ºC, 1 minuto)/reasociación (58ºC, 1 minuto)/alargamiento (72ºC, 1 minuto), fueron repetidas 40 veces. La reacción se completó mediante el alargamiento final (72ºC, 7 minutos). La mezcla de reacción obtenida de la PCR se sometió a electroforesis con gel de agarosa al 2% que contenía bromuro de etidio, y luego se analizó con un FluorImager 595 (analizador de imágenes fluorescentes de Amercham Bioscience Co,).

(iv) Resultados de la confirmación del gen introducido en un cuerpo vegetal rediferenciado, resistente a higromicina

La presencia de un gen introducido en el cuerpo vegetal rediferenciado, S, resistente a la higromicina, fue confirmada obteniendo los resultados indicados en la Tabla 2. A saber, fueron confirmados el producto de amplificación de 344 bp obtenido mediante la combinación de los cebadores A y B, y el producto de amplificación de 360 bp obtenido mediante la combinación de los cebadores C y E. El DNA existente en ambos extremos de la construcción de introducción pudo confirmarse en el DNA del cuerpo vegetal rediferenciado, S. Se encontró, por tanto, que el cuerpo vegetal rediferenciado, S. era el cuerpo vegetal transformado.

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TABLA 2 Resultados de la confirmación del gen introducido en el cuerpo vegetal rediferenciado, S, resistente a higromicina

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2

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La presencia de un gen introducido en el cuerpo vegetal rediferenciado, A, resistente a la higromicina, fue confirmada, obteniendo los resultados indicados en la Tabla 3. A saber, fueron confirmados el producto de amplificación de 344 bp obtenido mediante la combinación de los cebadores A y B, y el producto de amplificación de 326 bp obtenido mediante la combinación de los cebadores C y D. El DNA existente en ambos extremos de la construcción de introducción pudo confirmarse en el DNA del cuerpo vegetal rediferenciado, A. Por tanto, se encontró que el cuerpo vegetal rediferenciado, A, era el cuerpo vegetal transformado.

TABLA 3 Resultados de la confirmación del gen introducido en el cuerpo vegetal rediferenciado, A, resistente a higromicina

3

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(2) Determinación de la actividad de LFS de un cuerpo vegetal rediferenciado transformado

Los cuerpos vegetales S y A rediferenciados transformados y sus retoños totales (hojas y tallos) fueron cortados y analizados con objeto de evitar resultados desiguales de la determinación dependiendo de los sitios de los individuos. 6 cuerpos vegetales regenerados procedentes de callos de cebolla que no había sido cultivada con Agrobacterium fueron sometidos también al análisis como testigos. Se añadió PBS (NaCl 137 mM, Na_{2}HPO_{4}.12 H_{2}O, 8,10 mM, KCl 2,68 mM y KH_{2}PO_{4} 1,47 mM) a los retoños cortados según se ha descrito antes. Después de homogeneización seguida de centrifugación a 6.000 xg durante 5 minutos, se tomó el sobrenadante como el extracto enzimático. 40 \mul de aliinasa de ajo (50 unidades/ml) y 20 \mul de solución de PeCSO (sulfóxido de trans(+)-S-(1-propenil)-L-cisteína (20 mg/ml) se añadieron a 10 \mul del extracto enzimático. El recipiente fue cerrado herméticamente y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 3 minutos. 1 \mul de la mezcla de reacción se sometió a análisis por HPLC para determinar el área del pico del factor lacrimatorio. En este análisis, se empleó una columna de ODS (4,6 \Phi x 250 mm) (un producto de Senshuu Kagaku Co.). Como fase móvil se usó metanol acidificado al 30% (v/v), y la determinación se llevó a cabo con un caudal de 0,6 ml/min, una temperatura de la columna de 35ºC y una longitud de onda de detección de 254 nm. El valor obtenido se convirtió en el área del pico del factor lacrimatorio por mg de la proteína total del extracto enzimático. El área del pico calculada de este modo se tomó como la actividad de LFS.

La cantidad total de proteína del extracto enzimático se determinó por el método de Bradford (Bradford, M.M., 1976, Anal. Biochem., 72, 248-254) con BSA (Albúmina de Suero Bovino) como patrón.

La actividad de LFS de cada uno de los 6 cuerpos vegetales testigo regenerados partiendo de callos de cebolla que no habían sido cultivados conjuntamente con Agrobacterium, se comparó con la actividad de LFS de cada uno de los cuerpos vegetales S y A rediferenciados, transformados, obteniendo los resultados que se indican en la Fig. 4. La actividad de LFS de cada uno de los 6 cuerpos vegetales testigo se mostró en términos de la media de ellos y también se mostró su error típico.

La actividad de LFS del cuerpo vegetal S rediferenciado, transformado, obtenido mediante el cultivo conjunto con el LBA4404(pBIsentido) fue tan bajo como 5%, aproximadamente, basado en el testigo. Por tanto, la actividad de LFS estaba notablemente reprimida a aproximadamente 1/20. La actividad de LFS del vegetal A rediferenciado, transformado, obtenida por el cultivo conjunto con LB4404(pBIantisentido) era aproximadamente 47% basado en el testigo. Así pues, la actividad de LFS estaba reprimida en aproximadamente la mitad. Aun cuando la extensión de la represión de la actividad de LFS variaba, la actividad de LFS estaba reprimida en todos los vegetales rediferenciados transformados.

(iv) Determinación de la proteína de LFS en vegetales regenerados transformados

La cantidad de proteína de LFS en los vegetales regenerados transformados fue determinada mediante el método de transferencia western.

El anticuerpo primario usado para la inmunotinción se preparó inmunizando una rata con LFS recombinante expresado en E. coli como el antígeno. La inmunización se llevó a cabo 6 veces en total, a intervalos de 2 semanas. En la primera inmunización, se usaron aproximadamente 0,2 mg de LFS recombinante. La sangre total se tomó 11 semanas después de iniciar la inmunización para preparar antisuero anti-LFS. El antisuero anti-LFS obtenido fue precipitado con sulfato amónico saturado al 50%. El precipitado se disolvió i sometió a diálisis con tampón de fosfato sódico 20 mM (pH 7,0). Finalmente, se usó anticuerpo anti-LFS purificado por afinidad, con una columna de unión de LFS como el anticuerpo primario. Otro reactivo de bloqueo, anticuerpo secundario, anticuerpo terciario y sustrato fluorescente usados, fueron los del ECF Western Blotting Kit (Amercham Bioscience Co.).

La concentración de proteína del extracto enzimático preparado en la etapa (2) antes descrita, se ajustó a 40 \mug/ml. 15 \mul de este producto fueron aplicados a un pocillo de gel de poliacrilamida SDS. Después de la electroforesis seguida de la transferencia sobre una membrana PVDF mediante el método semi-seco, la membrana se sumergió en una solución de bloqueo y se agitó fuertemente a 4ºC durante la noche o a temperatura ambiente durante 1 hora. La solución de bloqueo se preparó disolviendo un agente de bloqueo de membranas, en PBS-T (NaCl 137 mM, Na_{2}HPO_{4}.12 H_{2}O 8,10 mM, KCl 2,68 mM, KH_{2}PO_{4} 1,47 mM, Tween 20 al 0,1% (p/v), para obtener una solución al 5% (p/v). Después del bloqueo, la membrana se lavó con PBS-T, se sumergió en una solución de anticuerpo anti-LFS (anticuerpo primario) diluida 1/250 con PBS-T y luego se agitó vigorosamente a temperatura ambiente durante 1 hora. Una vez completada la reacción, la membrana se lavó con PBS-T, se sumergió en una solución de Ig anti-conejo, anticuerpo total unido a fluoresceína (anticuerpo secundario) diluido a 1/600 con PBS-T y luego se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Una vez completada la reacción, la membrana se lavó con PBS-T, se sumergió en una solución de conjugado de fosfatasa alcalina anti-fluoresceína (anticuerpo terciario), la solución se diluyó a 1/2500 con PBS-T y después se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Una vez completada la reacción, seguida de lavado con PBS-T, se aplicó a la membrana una solución del sustrato fluorescente. La membrana se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 20 minutos para llevar a cabo la reacción. La solución del sustrato fluorescente se preparó disolviendo 36 mg de sustrato ECF (sustrato fluorescente) en 60 ml de solución tampón de dilución del sustrato ECF. Una vez completada la reacción, el sustrato fluorescente sobre la membrana se secó completamente y se detectó la señal fluorescente con un FluorImager 595 (Amercham Bioscience Co.). Desde la imagen digital obtenida se determinó la señal fluorescente (volumen) de la banda específica del LFS con el soporte lógico (software) ImageQuaNT (Amercham Bioscience Co.). El valor obtenido se convirtió en una cantidad de señal fluorescente de la banda específica de LFS por mg de la proteína total existente en el extracto enzimático, y esta cantidad se indicó como la cantidad de proteína de LFS.

La cantidad de proteína de LFS de los cuerpos vegetales testigo regenerados a partir de callo de cebolla que no habían sido cultivados conjuntamente con Agrobacterium, se comparó con la cantidad de proteína de LFS de cada uno de los cuerpos vegetales rediferenciados, transformados, S y A, obteniendo los resultados que se muestran en la Fig. 5

La cantidad de proteína de LFS del vegetal S rediferenciado, transformado, obtenida mediante el cultivo conjunto con LBA4404(pBIsentido) fue tan pequeña como aproximadamente 10%, basado en la del testigo. Este hecho indica que la expresión estaba notablemente reprimida. Por otra parte, la cantidad de proteína de LFS del vegetal A rediferenciado, transformado, obtenida mediante el cultivo conjunto con LBA4404(pBIantisentido) fue 43% aproximadamente, basado en la del testigo. Este indica que la expresión de la proteína de LFS estaba reprimida aproximadamente en una mitad. Aun cuando la extensión de la represión de la cantidad de la proteína de LFS era variable, la expresión de la proteína de LFS esta reprimida en todos los vegetales rediferenciados, transformados.

Aplicabilidad industrial

Según la presente invención, es posible proporcionar DNA y RNA diseñados sobre la base de la secuencia de un gen de una enzima, para formar el factor lacrimatorio partiendo de un precursor de este factor, un vector requerido para introducir en un vegetal el DNA, que reprime la expresión, del gen de la enzima que produce el factor lacrimatorio, un método para reprimir la expresión del gen de la enzima que produce el factor lacrimatorio usándolo y también un vegetal en el que está reprimida la expresión del gen de la enzima que produce el factor lacrimatorio. Por consiguiente, la expresión del gen puede ser reprimida de este modo. Otras ventajas de la presente invención son que, debido a que la formación del factor lacrimatorio puede ser reprimida esencialmente y no se ejerce influencia de otros factores externos sobre la calidad y la cantidad del precursor del factor lacrimatorio, la calidad de la cebolla no disminuye y que la expresión del gen puede ser reprimida en un período más corto que el de las técnicas ordinarias de cultivo de vegetales que están libres de la ingeniería genética.

Conforme a la presente invención, la expresión del gen de la enzima que produce el factor lacrimatorio puede ser reprimida para regular también la cantidad de la proteína de la enzima. Por tanto, puede obtenerse un vegetal que tiene una actividad disminuida de la enzima. También es posible obtener un vegetal que tiene una cantidad aumentada de compuestos tiosulfinatos que es una causa del aroma y que posee un efecto antiasmático, así como también una alta calidad del sabor y que contiene una gran cantidad de componentes que se supone poseen actividad fisiológica.

Además, según la presente invención, es posible producir un vegetal que tiene actividad enzimática de producción del factor lacrimatorio reprimida a menos del 50%, aproximadamente, o menos del 10%, aproximadamente, basada en la de un vegetal testigo sin transformar. Asimismo es posible producir un vegetal que posee un contenido de proteína de la enzima que produce el factor lacrimatorio, reprimido a menos de 50%, aproximadamente, o menos de 15%, aproximadamente, basado en el de un vegetal testigo sin transformar. Es posible, además, producir un vegetal que tiene una actividad deseable de la enzima que produce el factor lacrimatorio variando el nivel de represión de la expresión del gen de la enzima que produce el factor lacrimatorio. Además, es posible proporcionar un vegetal liliáceo que posee las propiedades descritas.

<110> House Foods Corporation

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<120> DNA y vector para inhibir la expresión del gen de la enzima que genera el factor lacrimatorio, método para inhibir la expresión del gen de la enzima que genera el factor lacrimatorio usando el DNA y el vector, y una planta en la que está inhibida la expresión del gen de la enzima que genera el factor lacrimatorio

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<130> Y1K0094

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<150> JP 2002-56523

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<151> 2002-03-01

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<150> JP 2002-56558

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<151> 2002-03-01

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<150> JP 2002-275799

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<151> 2002-09-20

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<160> 21

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<170> PatentIn version 3.1

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<210> 1

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<211> 739

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<212> DNA

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<213> Allium fistulosum L.

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<220>

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<221> CDS

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<222> (58)..(564)

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<223> P

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<220>

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<221> sitio poli A

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<222> (723)..(739)

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<223> P

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<400> 1

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\hskip0,8cm

4

\hskip0,8cm

5

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<210> 2

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<211> 169

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<212> PRT

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<213> Allium fistulosum L.

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<400> 2

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

6

\hskip0,8cm

7

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

8

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 682

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Allium fistulosum L.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(507)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sitio poli A

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (666)..(682)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

9

\hskip0,8cm

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 169

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Allium fistulosum L.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

11

\hskip0,8cm

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 730

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Allium chinense L.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (54)..(560)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sitio poli A

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (715)..(730)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

13

\hskip0,8cm

14

\hskip0,8cm

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 169

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Allium chinense L.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

16

\hskip0,8cm

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 739

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Allium cepa L.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (55)..(561)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sitio poli A

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (724)..(739)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

18

\hskip0,8cm

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 169

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Allium cepa L.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

20

\hskip0,8cm

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 648

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Allium ampeloprasum L.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(492)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sitio poli A

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (632)..(648)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

22

\hskip0,8cm

23

\hskip0,8cm

24

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 164

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Allium ampeloprasum L.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

25

\hskip0,8cm

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 737

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Allium cepa L.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (53)..(559)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sitio poli A

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (722)..(737)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

27

\hskip0,8cm

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 169

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Allium cepa L.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

29

\hskip0,8cm

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 661

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Allium ampeloprasum L.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(492)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sitio poli A

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (637)..(661)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

31

\hskip0,8cm

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 164

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Allium ampeloprasum L.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

33

\hskip0,8cm

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 726

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Allium ampeloprasum L.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (57)..(563)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sitio poli A

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (717)..(726)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

35

\hskip0,8cm

36

\hskip0,8cm

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 169

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Allium ampeloprasum L.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

38

\hskip0,8cm

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattaaggga gtcacgttat gaccc

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaaacttct cgacagacgt cgc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtggcaatcc ctttcacaac ctg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggagggtcc tgagcacaag

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgcgggactc taatcataaa aacccat

\hfill

27

Claims (7)

1. Una construcción que comprende un DNA unido operablemente a una secuencia reguladora, en la que dicho DNA suprime la expresión de una proteína o un polipéptido que posee actividad enzimática que produce factor lacrimatorio, en el que dicho DNA comprende una secuencia seleccionada entre las (i), (ii), (iii), (iv) y (v) que siguen, en ambas orientaciones, sentido y antisentido:

(i)

una secuencia de DNA de SEQ ID NO. 1, 5, 7, 9, 11, 13 ó 15;

(ii)

una secuencia de DNA que tiene una identidad de 75% por lo menos, con una secuencia de DNA representada por SEQ ID NO. 1, 5, 7, 9, 11, 13 ó 15;

(iii)

una secuencia de DNA reguladora ubicada inmediatamente en el lado aguas arriba y que regula la expresión de una secuencia de DNA representada por SEQ ID NO. 1, 5, 7, 9, 11, 13 ó 15, de un DNA genómico del género Allium;

(iv)

una secuencia de DNA ubicada entre la secuencia de DNA citada en (i) y la secuencia de DNA reguladora citada en (iii), de un DNA genómico del género Allium; y

(v)

una secuencia de DNA que tiene una longitud de 18 nucleótidos, por lo menos, de la secuencia de DNA citada en (i), (ii), (iii) o (iv).

2. Un vector que contiene la construcción según la reivindicación 1.

3. Un método para producir un vegetal transgénico, cuyo método comprende transformar la construcción según la reivindicación 1, en una célula vegetal.

4. Un vegetal transformado con la construcción según la reivindicación 1 o con el vector según la reivindicación 2.

5. El vegetal según la reivindicación 4, que posee un contenido de factor lacrimatorio inferior al de un vegetal testigo sin transformar.

6. El vegetal según la reivindicación 4 ó 5, que pertenece al género Allium.

7. El uso de una construcción que comprende un DNA unido operablemente a una secuencia reguladora, en el que dicho DNA suprime la expresión de una proteína o un polipéptido que posee actividad enzimática que produce factor lacrimatorio, en el que dicho DNA comprende una secuencia seleccionada entre las (i), (ii), (iii), (iv) y (v) que siguen, en orientación sentido o en orientación antisentido o en ambas orientaciones, sentido y antisentido:

(i)

una secuencia de DNA de SEQ ID NO. 1, 5, 7, 9, 11, 13 ó 15;

(ii)

una secuencia de DNA que tiene una identidad de 75% por lo menos, con una secuencia de DNA representada por SEQ ID NO. 1, 5, 7, 9, 11, 13 ó 15;

(iii)

una secuencia de DNA reguladora ubicada inmediatamente en el lado aguas arriba y que regula la expresión de una secuencia de DNA representada por SEQ ID NO. 1, 5, 7, 9, 11, 13 ó 15, en un DNA genómico del género Allium;

(iv)

una secuencia de DNA ubicada entre la secuencia de DNA citada en (i) y la secuencia de DNA reguladora citada en (iii), en un DNA genómico del género Allium; y

(v)

una secuencia de DNA que tiene una longitud de 18 nucleótidos, por lo menos, de la secuencia de DNA citada en (i), (ii), (iii) o (iv),

para suprimir la expresión de una proteína o un polipéptido que posee actividad enzimática que produce factor lacrimatorio.