JP2004105134A - 水透過能を強化した植物 - Google Patents

Abstract

【課題】水の透過能が増強するように改変された植物の作出。
【解決手段】細胞膜の水透過能が増強されるように改変された植物。
【選択図】　　図４

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞膜の水透過能が増強されるように改変された植物に関する発明である。より詳しくは、本発明は、細胞膜の水透過能が増強されるように改変されたことにより、細胞膜の二酸化炭素透過能が増強された植物に関する発明である。さらに詳しくは、本発明は、オオムギ（品種名：赤神力　学名　Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ）より単離された水チャネル遺伝子を用いた高い二酸化炭素透過能を持つ植物に関する発明であり、本発明を用いて光合成において律速となっている二酸化炭素の細胞内での移送能の強化が可能となり、これを応用することにより主要作物等の光合成能の強化が可能となる。即ち、作物栽培における高い収量増が期待される。
【０００２】
【従来の技術】
水チャネルは分子量２３〜３０Ｋｄａの疎水性の高い膜貫通領域を６つ持つ生体膜上のタンパク質で、水分子が膜を透過する孔（チャネル）を形成するチャネルタンパク質の一つである。１９９２年にヒトの赤血球から初めてｃＤＮＡが単離され、水透過の機能が明らかにされた。１９９３年に植物での水チャネルの存在が確認され、これまで、４６種類の植物より１８７個の水チャネル遺伝子が２００１年１１月末の段階で報告されている（例えば、非特許文献１を参照）。
【０００３】
植物の水チャネルには、原形質膜型と液胞膜型が存在し、原形質膜型の水チャネル（３０ｋＤａ）のほうが液胞膜型（２３ｋＤａ）よりアミノ末端部分が長く大きい。植物水チャネルの特徴は、分子種が多く、量も多い点にある。動物と比べて植物では細胞が大きくまた成長も早い。細胞が大きく成長するときに必要な急速な水の透過や、小さな浸透圧差を利用した速やかな水の透過を達成させるために多量の水チャネルが必要と考えられている。
【０００４】
ところで、根における水吸収は根の重要な機能の一つであり、また、水吸収の制御は水関連ストレス（乾燥ストレスや塩ストレス）耐性機構と密接に関係する。根の水チャネルは、このような水分生理の分子機構の一つであり、その遺伝子発現は、塩ストレスや乾燥ストレスで動的に調節されていることが近年の研究で明らかになってきた（例えば、非特許文献２を参照）。
【０００５】
植物根表層において、水チャネルは外界からの水の吸収に関与し、また根内部では水の組織内移行と道管への水の移動に寄与している。乾燥や塩ストレスによって根外部環境の浸透圧が減少すると、水が逆に植物から流出する可能性があるが、この場合植物は水チャネル発現量を減少させたり、タンパク質りん酸化による水透過率を減少させたりすることにより対応している（例えば、非特許文献３を参照）。
【０００６】
これまでに、且原らによりオオムギ水チャネル遺伝子ＢＰＷ１（別名ＨｖＰＩＰ２；１）が単離同定されその機能が明らかにされている（非特許文献４を参照）。
さらに、水分の調整は、気孔の開閉及びそれに伴う炭酸ガスの吸収、さらには、光合成を介した物質生産と密接に関連しており（例えば、非特許文献５および６を参照）、水吸収の制御とその生理機能との関連を明らかにすることが、作物の収量を高める上で重要な課題となっている。
【０００７】
しかしながら、これまでに水吸収を制御するよう改変した植物についての報告はされておらず、間接的に耐塩性を付与した植物についての報告があるのみである。耐塩性を付与したということは、水吸収を制御するよう改変したと考えることもできる。このような例として、例えば、コリン酸化酵素（ｃｏｄＡ）を導入して浸透圧調整物質であるグリシンベタインを高度に蓄積させることにより耐塩性のイネを作出したもの（例えば、非特許文献７を参照。）やナトリウムを液胞へ多く貯めるようにＮａ^＋／Ｈ^＋アンチポーター遺伝子（ＡｔＮＨＸ１）をトマトに過剰発現させたもの（例えば、非特許文献８を参照。）などがある。また、浸透圧調整物質として、このほかにプロリンの過剰蓄積により植物の耐塩性を強化したものが報告されている（例えば、非特許文献９を参照。）。
また、これまでに、水の膜透過に関与するタンパク質、例えば、水チャネルタンパク質の植物体内における働きを調べる研究がアンチセンスなどを使ってなされていたものの（例えば、非特許文献１０および１１を参照。）、水チャネルタンパク質には多くの種類が存在し、一つの遺伝子の発現を抑制してもほかのアイソフォームにより機能が相補されてしまうため、その働きは見えにくく、詳細は明らかとなっていなかった。すなわち、水チャネルタンパク質には多数のアイソフォームが存在することから、その表現系を調べることが困難であると考えられていた。したがって、これまでに、水チャネル遺伝子などの増強などにより水透過能が増強されるように改変された植物の作出は試みられておらず、またこのような植物も報告されていなかった。
さらに、植物の水透過能を増強するよう改変することにより、二酸化炭素透過能が高められた植物についても報告されていなかった。
【０００８】
【非特許文献１】
インターネット　　ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ　ｈｔｔｐ：／／ｍｂｃｌｓｅｒｖｅｒ．ｒｕｔｇｅｒｓ．ｅｄｕ／ＣＰＧＮ／ＡｑｕａｐｏｒｉｎＷｅｂ／Ａｑｕａｐｏｒｉｎ．ｇｒｏｕｐ．ｈｔｍｌ　ｈｔｔｐ：／／ｍｂｃｌｓｅｒｖｅｒ．ｒｕｔｇｅｒｓ．ｅｄｕ／ＣＰＧＮ／ＡｑｕａｐｏｒｉｎＷｅｂ／Ａｑｕａｐｏｒｉｎ．ｇｒｏｕｐ．ｈｔｍｌに掲載されているリスト
【非特許文献２】
Ｔｙｅｒｍａｎ　Ｓ．Ｄ．，　Ｎｉｅｍｉｅｔｚ　Ｃ．Ｍ．，　＆　Ｂｒａｍｌｙ　Ｈ．　（２００２）　Ｐｌａｎｔ　ａｑｕａｐｏｒｉｎｓ：　ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｗａｔｅｒ　ａｎｄ　ｓｏｌｕｔｅ　ｃｈａｎｎｅｌｓ　ｗｉｔｈ　ｅｘｐａｎｄｉｎｇ　ｒｏｌｅｓ．　Ｐｌａｎｔ，　Ｃｅｌｌ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　２５，　１７３−１９４
【非特許文献３】
Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ　Ｉ．　Ｋａｒｌｓｓｏｎ　Ｍ．，　Ｊｏｈａｎｓｏｎ　Ｕ．，　　Ｌａｒｓｓｏｎ　Ｃ．　＆　Ｋｊｅｌｌｂｏｍ，　Ｐ．　（２０００）　　Ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ａｑｕａｐｏｒｉｎｓ　ｉｎ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ａｎｄ　ｗｈｏｌｅ　ｐｌａｎｔ　ｗａｔｅｒ　ｂａｌａｎｃｅ．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ　１４６５，　３２４−３４２
【非特許文献４】
Ｍ．Ｋａｔｓｕｈａｒａ，　Ｙ．Ａｋｉｙａｍａ，　Ｋ．Ｋｏｓｈｉｏ，　Ｍ．Ｓｈｉｂａｓａｋａ，　Ｋ．Ｋａｓａｍｏ．　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｗａｔｅｒ　ｃｈａｎｎｅｌｓ　ｉｎ　ｂａｒｌｅｙ　ｒｏｏｔｓ．　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　４３（８），　８８５−８９３　（２００２）
【非特許文献５】
Ｆ．Ａ．Ｂａｚｚａｚ　”Ｔｈｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｏｆ　ｎａｔｕｒａｌ　ｅｃｏｓｙｓｔｅｍｓ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｒｉｓｉｎｆ　ｇｌｏｂａｌＣ２　ｌｅｖｅｌｓ．”　Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｅｃｏｌ．Ｓｙｓｔ．　（１９９０）　２１：１６７−１９６
【非特許文献６】
Ｂ．Ａ．Ｋｉｍｂａｌｌ　”Ｃａｒｂｏｎ　ｄｉｏｘｉｄｅ　ａｎｄ　ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ｙｉｅｌｄ：　ａｎ　ａｓｓｅｍｂｌａｇｅ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　４３０　ｐｒｉｏｉｒ　ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ”　ａｇｒｏｎｏｍｙ　ｊｏｕｒｎａｌ　（１９８３）　７５：７７９−
【非特許文献７】
Ａ．　Ｓａｋａｍｏｔｏ，　Ａｌｉａ，　ａｎｄ　Ｎ．　Ｍｕｒａｔａ．　Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　ｒｉｃｅ　ｌｅａｄｉｎｇ　ｔｏ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｇｌｙｃｉｎｅｂｅｔａｉｎｅ　ａｎｄ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｔｏ　ｓａｌｔ　ａｎｄ　ｃｏｌｄ．　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　３８：　１０１１−１０１９，　１９９８
【非特許文献８】
Ｈ−Ｘ．　Ｚｈａｎｇ　ａｎｄ　Ｅ．　Ｂｌｕｍｗａｌｄ．　Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｓａｌｔ−ｔｏｌｅｒａｎｔ　ｔｏｍａｔｏ　ｐｌａｎｔｓ　ａｃｃｕｍｕｌａｔｅ　ｓａｌｔ　ｉｎ　ｆｏｌｉａｇｅ　ｂｕｔ　ｎｏｔ　ｉｎ　ｆｒｕｉｔ．　Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１９：　７６５−７６８，　２００１
【非特許文献９】
Ｐ．　Ｂ．　Ｋ．　Ｋａｖｉ　Ｋｉｓｈｏｒ，　Ｚ．　Ｈｏｎｇ，　Ｇ．−Ｈ．　Ｍｉａｏ，　Ｃ．−Ａ．　Ａ．　Ｈｕ，　ａｎｄ　Ｄ．　Ｐ．　Ｓ．　Ｖｅｒｍａ．　Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　△　１−ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ−５−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ　ｉｎｃｒｅａｓｅｓ　ｐｒｏｌｉｎｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｏｎｆｅｒｓ　ｏｓｍｏｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ．　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　１０８：　１３８７−１３９４，　１９９５
【非特許文献１０】
Ｋａｌｄｅｎｈｏｆｆ　Ｒａｌｆ，　Ｇｒｏｔｅ　Ｋａｒｓｔｅｎ，　Ｚｈｕ　Ｊｉａｎ−Ｋｕｎ，　Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ　ｏｆ　ｐｌａｓｍａｌｅｍｍａ　ａｑｕａｐｏｒｉｎｓ　ｆｏｒ　ｗａｔｅｒ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ．　Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ．　１４：　１２１−１２８，　１９９８
【非特許文献１１】
Ｃｈｅｎ，　Ｇ．　Ｐ；　Ｗｉｌｓｏｎ，　Ｉ　Ｄ；　Ｋｉｍ，　Ｓ　Ｈ；　Ｇｒｉｅｒｓｏｎ，　Ｄ．　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｔｏｍａｔｏ　ｒｉｐｅｎｉｎｇ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎｃｒｅａｓｅｓ　ｏｒｇａｎｉｃ　ａｃｉｄｓａｎｄ　ｒｅｄｕｃｅｓ　ｓｕｇａｒ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ｆｒｕｉｔ．　Ｐｌａｎｔａ　２１２，　７９９−８０７　（２００１）
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、水の透過能が増強するように改変した植物、さらに、このような改変により二酸化炭素の透過能の増加した植物、さらに、より収量の高い穀物の作出を目指すものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、今般、はじめて植物に水チャネル遺伝子を導入し、発現させ、水の透過能を向上させた植物および、さらに二酸化炭素の透過能を向上させた植物を作出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１）　細胞膜の水透過能が増強されるように改変された植物。
（２）　細胞膜の水透過能が増強されるように改変されたことにより、細胞膜の二酸化炭素透過能が増強された（１）に記載の植物。
（３）　植物における水の透過能が、水の膜透過に関与する遺伝子の発現を増強することにより、増強されているものである（１）または（２）に記載の植物。
（４）　水の膜透過に関与する遺伝子が、水チャネル遺伝子である（３）に記載の植物。
（５）　植物における水の透過能が、下記の何れかの塩基配列を有する遺伝子の発現を増強することにより、増強されているものである（１）〜（３）のいずれかに記載の植物。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列；
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列であって、細胞膜において水を透過する活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列；
（Ｃ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号５３〜９１３からなる塩基配列；
（Ｄ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号５３〜９１３からなる塩基配列において１から複数個の塩基が欠失、付加または置換されている塩基配列であって、細胞膜において水を透過する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；または
（Ｅ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号５３〜９１３からなる塩基配列もしくはその相補配列またはそれらの一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、細胞膜において水を透過する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下本発明を詳細に説明する。
本発明の植物は、細胞膜の水透過能が増強されるように改変された植物である。「水透過能」は、以下の実施例において詳細に記載される方法で、根の単位時間あたり単位面積あたりの水透過率として測定することができる。
本発明の好ましい一形態は、細胞膜の水透過能が増強されるように改変されたことにより、細胞膜の二酸化炭素透過能が増強された植物である。「二酸化炭素透過能」は、以下の実施例において詳細に記載される方法で葉の二酸化炭素透過能として測定することができる。
本発明に用いることができる植物としては、植物における水の透過能が増強するように改変することができ、好ましくは、その結果として、該植物の二酸化炭素透過能が増強される限り、特に限定されない。このような植物として、例えば、主要穀物であるイネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ジャガイモ等や油量作物であるダイズ、ナタネ、パーム椰子やワタ等が好ましく例示できる。
【００１２】
「水の透過能の増強」は、植物における水の透過能が増強するように改変することができ、好ましくは、その結果として、該植物の二酸化炭素透過能が増強される限り、方法は限定されないが、植物における水の透過能を、水の膜透過に関与する遺伝子の発現を増強することにより、増強する方法が好ましく挙げられる。「発現の増強」は、目的植物と同じ／または異なる植物由来の水の膜透過に関与する遺伝子を目的植物に導入・発現させることによって、目的の植物に元々存在する水の膜透過に関与する遺伝子のコピー数を増加させることによっておこなうことができ、また目的植物と同じ／または異なる植物由来のより比活性の高い水の膜透過に関与する遺伝子を目的植物に導入・発現させることによっても行うこともできる。また目的の植物に元々存在しない水の膜透過に関与する遺伝子を、目的植物に導入・発現させることによってもおこなうこともできる。さらに、目的の植物に元々存在する水の膜透過に関与する遺伝子の発現を増強させることによっても行うこともできる。なお、「発現の増強」は、これらのうち、１種の方法を用いて行ってもよいし、複数の方法を組み合わせてもよい。
【００１３】
「水の膜透過に関与する遺伝子」とは、その発現を増強することにより、目的とする植物における水の透過能が増強され、好ましくは、その結果、該植物の二酸化炭素透過能が増強されるような遺伝子であれば、どのようなものであってもよい。水の膜透過に関与する遺伝子として、例えば、水チャネル遺伝子が好ましい。水チャネル遺伝子は、大きく以下の４つのファミリーに分けられる。（Ｆ．　Ｃｈａｕｍｏｎｔ，　Ｆ．　Ｂａｒｒｉｅｕ，　Ｅ．　Ｗｏｊｃｉｋ，　Ｍ．　Ｊ．　Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ，　ａｎｄ　Ｒ．　Ｊｕｎｇ，　Ａｑｕａｐｏｒｉｎｓ　ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ　ａ　ｌａｒｇｅ　ａｎｄ　ｈｉｇｈｌｙ　ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆａｍｉｌｙ　ｉｎ　ｍａｉｚｅ．　ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　１２５：　１２０６−１２１５　（２００１））（Ｕ．　Ｊｏｈａｎｓｏｎ，　Ｍ．　Ｋａｒｌｓｓｏｎ，　Ｉ．　Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，　Ｓ．　Ｇｕｓｔａｖｓｓｏｎ，　Ｓ．　Ｓｊｏｖａｌｌ，　Ｌ．　Ｆｒａｙｓｓｅ，　Ｆ．　Ｒ．　Ｗｅｉｇ，　ａｎｄ　Ｐ．　Ｋｊｅｌｌｂｏｍ，　Ｔｈｅ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｓｅｔ　ｏｆ　ｇｅｎｅｓ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｍａｊｏｒ　ｉｎｓｔｒｉｓｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ａ　ｆｒａｍｅｗｏｒｋ　ｆｏｒ　ａ　ｎｅｗ　ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　ｆｏｒ　ｍａｊｏｒ　ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｐｌａｎｔｓ．　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　１２６：　１３５８−１３６９（２００１））。
１．　Ｐｌａｓｍａ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＰＩＰｓ）
２．　ｔｏｎｏｐｌａｓｔ　ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＴＩＰｓ）
３．　ＮＯＤ２６−ｌｉｋｅ　ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＮＩＰｓ）
４．　ｓｍａｌｌ　ｂａｓｉｃ　ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＳＩＰｓ）
すなわち、水の膜透過に関する遺伝子として、例えば原形質膜型水チャネル遺伝子（ＰＩＰｓ）、液胞膜型水チャネル遺伝子（ＴＩＰｓ）、ＮＯＤ２６様水チャネル遺伝子（ＮＩＰｓ）などが好ましく例示でき、原形質膜型水チャネル遺伝子が特に好ましい。
原形質膜型水チャネル遺伝子としては、オオムギ由来のものとして例えば、水チャネル遺伝子ＢＰＷ１（配列番号１；ジェンバンク　アクセッション番号　ＡＢ００９３０７）、シロイヌナズナ由来のものとして例えば、ＰＩＰ１；１（アクセッション番号ＣＡＢ７１０７３）、ＰＩＰ１；２（アクセッション番号ＡＡＣ２８５２９）、ＰＩＰ１；３（アクセッション番号ＡＡＦ８１３２０）、トウモロコシ由来のものとして例えば、ＺｍＰＩＰ１−１（アクセッション番号Ｘ８２６３３）、ＺｍＰＩＰ１−２（アクセッション番号ＡＦ１３１２０１）が挙げられる。このうち、オオムギ水チャネル遺伝子ＢＰＷ１が好ましい。
なお、「水の膜透過に関与する遺伝子」は、１種を用いてもよいし、複数を組み合わせて用いてもよい。
水チャネル遺伝子は、上記のような既知の植物の水チャネル遺伝子の配列をもとに適当なプライマーを作製し、該プライマーを用いて、植物のｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ等によって得ることができる。
【００１４】
本発明の好ましい一形態は、オオムギの水チャネル遺伝子ＢＰＷ１の発現を植物において増強させることによって水透過能が増強するように改変された植物、また本発明の別の好ましい一形態は、該遺伝子の発現を植物において増強させたことにより、水透過能が増強するように改変された結果、二酸化炭素透過能が増強された植物である。
また、通常遺伝子においては、種、属、個体等の違いによって、１から複数の位置での１から複数個の塩基の欠失、付加または置換などの変異が当然存在する。本発明に用いることができる遺伝子には、コードするタンパク質の植物の細胞膜において水を透過する活性が損なわれない範囲において、このような変異を含む遺伝子も含まれる。すなわち、本発明の別の好ましい一形態は、コードするタンパク質の植物の細胞膜において水を透過する活性が損なわれない範囲において、配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号５３〜９１３からなる塩基配列において１から複数個の塩基が欠失、付加または置換されている塩基配列を有する遺伝子の発現を植物において増強させることによって、該植物の水透過能が増強するように改変された植物、またさらにその結果、二酸化炭素透過能が増強された植物である。ここで「複数個」とは、具体的には２から４３０個、好ましくは、２から３４４個、より好ましくは２から１７０個である。
【００１５】
このような欠失、付加または置換されている塩基配列は、オオムギの水チャネル遺伝子ＢＰＷ１の配列をもとに適当なプライマーを作製し、該プライマーを用いて、他の植物のｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ等によって得ることができる他、例えば部位特異的変異法によって得ることができる。また、他の従来知られている変異処理によっても取得され得る。
【００１６】
上記のような変異を有する塩基配列を、目的の植物において発現させ、該植物の水の透過性または二酸化炭素透過性を調べることにより、本発明に用いることができる塩基配列が得られる。水の膜透過性および二酸化炭素透過性は以下の実施例に詳細に示す方法に従って行うことができる。また、変異を有するＤＮＡまたはこれを保持する細胞から、例えば配列番号１に記載の塩基配列のうち少なくとも塩基番号５３〜９１３からなる塩基配列もしくはその相補配列、またはそれらの一部を有するプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、水を透過する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、本発明に用いられるＤＮＡが得られる。なお、ここでいう「一部」とはプローブとして使用するのに有効な長さのことである。また、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、例えば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば、配列番号１に示す塩基配列のうち、少なくとも塩基番号５３〜９１３と約５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩条件でハイブリダイズする条件が挙げられる。なお、相同性はＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｄ．　Ｊ．　Ｌｉｐｍａｎ　ａｎｄ　Ｗ．　Ｒ．　Ｐｅａｒｓｏｎ，　２２７，　１４３５−１４４１，　（１９８５），　Ｓｃｉｅｎｃｅ）により計算した場合である。
【００１７】
上記のような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、それらについては、目的の植物に導入し、水の透過性または二酸化炭素透過性を以下の実施例で詳細に述べられる方法で測定することによって容易に取り除くことができる。
【００１８】
本発明の別の好ましい一形態は、配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子の発現を植物において増強させることによって、水透過能が増強するように改変された植物、また、本発明の別の好ましい一形態は、前記のように、水透過能が増強するように改変された結果、該植物の二酸化炭素透過能が増強された植物である。また、本発明の別の好ましい一形態は、コードするタンパク質の植物の細胞膜において水を透過する活性が損なわれない範囲において、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子の発現を植物において増強させることによって、水透過能が増強するように改変された植物、また、本発明の別の好ましい一形態は、前記のように、水透過能が増強するように改変された結果、該植物の二酸化炭素透過能が増強された植物である。ここで「複数個」とは、具体的には２から１４４個、好ましくは、２から１１５個、より好ましくは２から５７個である。
【００１９】
以下本発明の植物を取得する方法を例示する。
オオムギ等すでに水チャネル遺伝子の同定されている植物を選んで実験に供試する。種子を発芽後３日間水耕培養し、長さが２−３ｃｍになったところで、根をはさみで切って収穫する。この根サンプルから定法にしたがってＲＮＡを抽出する。このＲＮＡを鋳型として、すでに公表されている水チャネル遺伝子、例えばオオムギのＢＰＷ１全体をカバーするような、特異的な上流プライマーおよび下流ポリＴプライマー（１８個のＴ）を用いて定法によりＰＣＲをおこない、ＢＰＷ１全長を含むｃＤＮＡ断片を得る。得られたｃＤＮＡ断片を市販のクローニングベクターに組み込み、塩基配列の確認を行う。これを出発材料として植物発現用ベクターを構築する。なお、オオムギのＢＰＷ１遺伝子の名称は、２００１年にＨｖＰＩＰ２；１と改められた。本明細書においては、該遺伝子をＢＰＷ１遺伝子と記載するが、これはＨｖＰＩＰ２；１と同義である。
【００２０】
例えば、水チャネル遺伝子のｃＤＮＡを植物用の発現ベクターのカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターやその他の植物で機能するプロモーターの下流に挿入し、エレクトロポレーション法・アグロバクテリウム法・パーティクルガン法等を用いて主要穀物であるイネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ジャガイモ、等や油量作物である、ダイズ、ナタネ、パーム椰子やワタ等を形質転換する。かくして、本発明の水の透過能が増強された植物、また、さらに二酸化炭素透過能が向上した植物の作出が可能となる。
【００２１】
イネの場合、例えば、エレクトロポレーション法により形質転換を行う（Ｎａｔｕｒｅ３３８，２７４　（１９８９））。即ち、継代後３〜６日のサスペンジョン細胞よりイネプロトプラストを単離後、ＥＰバッファー（５ｍＭ　ＭｇＣｌ_２，　７０　ｍＭ　ＫＣｌ，　０．１％ＭＥＳ，　ｐＨ５．６；フィルター滅菌する。）１０　ｍｌに懸濁、遠心する。再度ＥＰバッファーを加えて、最終６〜８×１０^６プロトプラスト／１０　ｍｌとする。３５Ｓプロモーター等で制御された該遺伝子を含むベクター及び３５Ｓプロモーターで制御されたハイグロマイシンＢ　フォスフォトランスフェラーゼ（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ　Ｂ　ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子を含むベクターをそれぞれ懸濁液１ｍｌに対し、各々３０μｇを加え混合する。この懸濁液をマイクロキュベットに入れ、Ｘ−Ｃｅｌｌ　４５０　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）にて、１，０００μＦ、７５０Ｖ／ｃｍの減衰波を３０秒かける。プロトプラストをチューブに戻し氷中で冷却後、直径３ｃｍのプラスチックシャーレに移す。アガロース（８０　ｍｇ）を入れたパイレックス（コーニング　インコーポレイテッドの登録商標）チューブ（オートクレーブ滅菌）に、Ｒ２Ｐ培地２．５　ｍｌを加え溶かした後、３７〜４０℃に冷却する。プロトプラストを入れたシャーレに寒天溶液を０．５　ｍｌ加え、素早く混合して固めた後、Ｒ２Ｐ培地を５ｍｌ入れた直径５ｃｍのプラスチックシャーレに移す。ナース細胞として、ＯＣ細胞を１００　ｍｇ程度加え、３０℃、８０回転／分で振とう培養する。１０〜１４日に２０〜３０個の細胞塊となるのでこれを取り出し、新しいシャーレに移す。新たにＲ２Ｐ培地５ｍｌを入れ、最終濃度２５μｇ／ｍｌとなるように、ハイグロマイシン溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を加える。２〜３週間後、耐性を示して生育を続ける形質転換細胞と、分裂を停止する非形質転換細胞とが区別できるようになる。耐性を示した形質転換細胞塊をハイグロマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を含むＲ２ＳＡ寒天培地５ｍｌに置き、３０℃、２，０００　ｌｕｘで静置培養する。３週間から１カ月で耐性コロニーは生育を続けてカルスとなる。カルスをＲ２Ａ培地上で２週間ほど培養した後、ＰＣＲ等で該遺伝子の導入を確認する。遺伝子の導入されたものを再生培地に移し、再生個体を得る。
この他にも、アグロバクテリウム法（Ｐｌａｎｔ　Ｊ．６，２７１　（１９９４））やパーティクルガン法（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐ．１４，５８６　（１９９５））によりイネの形質転換を行うことができる。
【００２２】
ナタネの形質転換は、アグロバクテリウム法及びエレクトロポレーション法で行う。アグロバクテリウム法による形質転換（Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６，１１１５（１９９４））は、以下のように行う。１０％過酸化水素水で２５分間処理して乾燥させた種子をＭＳ寒天培地上で照明下（１，０００〜４，０００　ｌｕｘ）２〜３週間培養する。発芽し生長した無菌の下胚軸を２〜５ｍｍの長さに切断し、前培養培地（Ｂ５−ビタミン、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（１ｍｇ／ｌ）、３％ショ糖、０．７％アガロースを含むＭＳ寒天培地上に適当量のタバコ培養細胞ＢＹ−２を敷き詰め滅菌ろ紙をかぶせた培地）上に置いて明所下一晩前培養する。植物で作用するプロモーターで制御された該遺伝子を含むプラスミドを有したアグロバクテリウムを抗生物質を含む５ｍｌのＹＥＢ液体培地中、３０℃で一晩培養する。この培養液を３，０００　ｒｐｍで１０分間遠心分離し３％のショ糖を含むＭＳ液体培地で一回洗浄した後、同じＭＳ培地に懸濁する。このアグロバクテリウム懸濁液に先の前培養した下胚軸を入れて２５℃で５〜２０分間振とう培養する。この溶液をろ過し下胚軸のみを取り出し、無菌ペーパータオル上で余分なアグロバクテリウムを取り除き元の前培養培地上で二晩同時培養し下胚軸にアグロバクテリウムを感染させる。この後、下胚軸を除菌培地（Ｂ５−ビタミン、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（１ｍｇ／ｌ）、３％ショ糖、０．７％アガロース、５００ｍｇ／ｌカルベニシリンを含んだＭＳ寒天培地）上に移して三日間培養してアグロバクテリウムの増殖を抑える。次にこれらの下胚軸を一次選抜培地（Ｂ５−ビタミン、３ｍｇ／ｌベンジルアミノプリン、１ｍｇ／ｌゼアチン、２％ショ糖、０．７％アガロース、３０ｍｇ／ｌカナマイシン、５００　ｍｇ／ｌカルベニシリンを含むＭＳ寒天培地）上に移して２週間培養する。更にこれらの下胚軸を二次選抜培地（一次選抜培地のショ糖含量を２％から１％に減少させた培地）上に移し３週間培養する。この時形質転換したカルスは更に大きくなるので、次にこのカルス部分のみを発芽培地（二次選抜培地よりカナマイシンを除き、カルベニシリンを５００ｍｇ／ｌから２５０ｍｇ／ｌに減少させたもの）に移す。再生した芽は伸長培地（０．１　ｍｇ／ｌベンジルアミノプリン、２５０ｍｇ／ｌカルベニシリン、０．７％アガロースを含むＢ５寒天培地）上で成長させ、次に発根培地（０．１　ｍｇ／ｌ１−ナフタレン酢酸、０．０１ｍｇ／ｌベンジルアミノプリン、３％ショ糖、０．８％アガロースを含むＭＳ寒天培地）に移した後、馴化させる。馴化の終了した植物体は隔離温室内で生育させ自家受粉させて種子を得ることができる。
【００２３】
エレクトロポーレーション法によるナタネの形質転換（Ｐｌａｎｔ　Ｔｉｓｓｕｅ　ＣｕｌｔｕｒｅＬｅｔｔｅｒｓ１１，１９９　（１９９４））は、以下のように行う。無菌発芽させた下胚軸よりプロトプラストを得、エレクトロポーレーション懸濁溶液（０．４　Ｍマンニトール、５ｍＭ塩化マグネシウム、７０　ｍＭ塩化カリウム、０．１％ＭＥＳ、ｐＨ　５．５）に６ｘ１０^５個／ｍｌの濃度で懸濁する。この懸濁液０．５　ｍｌに該遺伝子のＤＮＡを含んだプラスミドを４０μｇ／ｍｌ、ウシ精子遺伝子を４０μｇ／ｍｌの濃度になるように加えた後、Ｘ−Ｃｅｌｌ４５０（プロメガ社製）で電気パルス（電気容量４００　μＦ、電圧６００　Ｖ／ｃｍ、時間７．５　ｍｓ）を印加して遺伝子導入する。エレクトロポーレーション処理したプロトプラストは、０．４　Ｍグルコース、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（１ｍｇ／ｌ）、０．１　ｍｇ／ｌナフタレン酢酸、０．４　ｍｇ／ｌベンジルアミノプリンを含むＫＭ８ｐ培地で１週間培養した後、１０　ｍｇ／ｌカナマイシンを加えて形質転換細胞を選抜する。３週間後に得られた形質転換カルスを１０　ｍｇ／ｌカナマイシンを含んだＣＮ培地、ＤＮ培地、Ｋ３培地、Ｂ５培地、ＭＳ培地に３週間毎に移植し、再生個体を得る。馴化の終了した植物体は隔離温室内で生育させ自家受粉させて種子を得ることができる。
【００２４】
その他、各植物の形質転換は、常法により行うことが出来、例えば、大豆等を形質転換する場合には、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６，９１５　（１９８８）、同　５，１２０２　（１９８７）（以上アグロバクテリウム法）、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐ．１０，１０６　（１９９１）、同　９，５５　（１９９０）（以上エレクトロポーレーション法）及びＴｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｎｅｔ．７９，３３７　（１９９０）、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ　Ｒｅｐ．１２，２５０　（１９９３）（以上パーティクルガン法）等に準じて、行うことができる。
【００２５】
【実施例】
以下に実施例を挙げて更に具体的に本発明を説明するが、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。
【００２６】
（１）オオムギからのｍＲＮＡの単離
オオムギ（品種名：赤神力）の種子１０−２０ｇを、１０％濃度の過酸化水素水で１０分処理した後、水道水および引き続き蒸留水で洗浄してから、蒸留水３００−４００ｍＬとともに５００ｍＬ容量の三角フラスコに入れて、一晩２５℃、暗黒下で吸水させる。この時、先端にスポンジをつけたガラス管を三角フラスコに挿入し、ポンプでガラス管を通じて空気を送ってバブリングをおこなう。吸水処理した種子を、０．２５ｍＭ濃度の硫酸カルシウム溶液３．５Ｌで満たしたポットの上に置いた網に播種する。このポットにも先端にスポンジをつけたガラス管を通し、ポンプでガラス管を通じて空気を送ってバブリングを行う。４８時間経過後、ポットの溶液を水耕栽培液（ＫＮＯ_３：４．０　ｍＭ，　ＮａＮＯ_３：１．０　ｍＭ，　ＮａＨ_２ＰＯ_４：４．０　ｍＭ，　ＣａＣｌ_２：２．０　ｍＭ，　ＭｇＳＯ_４：１．０　ｍＭ，Ｆｅ−クエン酸：１．０　ｐｐｍ，　Ｈ_３ＢＯ_３：０．５　ｐｐｍ，　ＭｎＣｌ_２：０．５　ｐｐｍ，　ＺｎＳＯ_４：０．０５　ｐｐｍ，　ＣｕＳＯ_４：０．０２　ｐｐｍ，　Ｎａ_２ＭｏＯ_４：０．０１　ｐｐｍ）に替え、引き続き２４時間培養する。長さが２−３ｃｍになった根をはさみで切って収穫する。
【００２７】
この根のサンプルから定法に従ってＲＮＡの抽出を行った。即ち、約０．２　ｇのサンプルを乳鉢中で液体窒素を加えて良く粉砕した。これに０．８　ｍｌの溶液　Ｄ（４　Ｍグアニジンチオシアン酸・２５　ｍＭクエン酸（ｐＨ７．０）・０．５％ザルコシール・０．１Ｍ　２−メルカプトエタノール）を加えさらに良く擦り潰した。これを２　ｍｌのエッペンドルフチューブへ移し、２　Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）、フェノール（０．１　Ｍトリス緩衝液飽和）、クロロフォルムをそれぞれ０．０８　ｍｌ、０．８　ｍｌ、０．１６　ｍｌ加えた後、良く撹拌して、氷中に１５分間静置した。４℃で２０分間遠心分離し、浮遊物に注意して上層を２　ｍｌのエッペンドルフチューブへ移し、等量のイソプロピールアルコールを加えた。４℃で２０分間遠心分離後、さらに０．３　ｍｌの溶液　Ｄに溶かし、再び、等量のイソプロピルアルコールでＲＮＡを沈殿させた。これを７０％のエタノールで洗浄し、乾固した後３０μｌのジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理した滅菌水に溶かしトータル　ＲＮＡを得た。トータル　ＲＮＡ溶液に溶出バッファー（最終濃度：１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ７．５・１　ｍＭ　ＥＤＴＡ・　０．１　％　ＳＤＳ）と滅菌水を加えＲＮＡ量が１μｇ／μｌとなるように調製した。Ｏｌｙｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０（ロッシュ社製）を等量加え、６５℃で５分間加熱し、氷上で３分間急冷後、５　Ｍ　ＮａＣｌを１／１０量加え、３７℃で３０分間インキュベートした。１５，０００　ｒｐｍで３分間の遠心分離後上清を除去した。ペレットを１　ｍｌの滅菌水に懸濁後６５℃で５分間加熱し、氷上で３分間急冷した。１５，０００　ｒｐｍで３分間の遠心分離後、上清を回収し、エタノール沈殿によりｍＲＮＡを回収した。
【００２８】
（２）ｃＤＮＡの合成
得られたｍＲＮＡよりｃＤＮＡ合成キット（例えば、Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。即ち、鋳型として上記（１）で得られたオオムギの根由来のｍＲＮＡ（２μｇ）を添付の５×緩衝液（最終濃度：５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ　８．３）、７５　ｍＭ　ＫＣｌ、３　ｍＭ　ＭｇＣｌ_２）に溶かした。これにポリＡ配列部と結合するオリゴ（ｄＴ）プライマー（１μｇ）、ｄＮＴＰ混合物（最終濃度：各０．５　ｍＭ）、ジチオスレイトール（最終濃度：１０　ｍＭ）、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ逆転写酵素（４００ユニット：Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ社製）を加え、ＤＥＰＣ処理水で全量を２０μｌとした。振盪後、３７℃で１時間保温し、終了後氷冷した。この操作により、１本鎖ｃＤＮＡを合成した。
【００２９】
次に、添付の緩衝液（最終濃度：２５　ｍＭ　Ｔｒｉｃ−ＨＣｌ（ｐＨ　７．５）、１００　ｍＭ　ＫＣｌ、５　ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、１０　ｍＭ　（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．１５　ｍＭ　β−ＮＤＡ＋）とｄＮＴＰ混合物（最終濃度：各２５０　μＭ）を加えた後、大腸菌のＤＮＡリガーゼ（１０ユニット）とＤＮＡポリメラーゼＩ（４０ユニット）、ＲＮａｓｅＨ（２ユニット）を加え、ＤＥＰＣ処理水で全量を１５０μｌとした。軽い撹拌後、１６℃で２時間処理した。この操作により２本鎖ｃＤＮＡを合成した。更に、平滑末端にするためにＴ４ファージのＤＮＡポリメラーゼ（１０ユニット）を加えて１６℃で１０分間保温した。反応を終了させるために０．５　Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ　８．０）１０μｌを加え撹拌した。これを等量のフェノール／クロロホルムで２回処理して酵素を除き、更に、倍量のジエチルエーテルで洗浄を行い、エタノール沈澱で精製されたｃＤＮＡを回収した。７０％エタノールで洗浄後乾燥させ、滅菌水に溶かしたものを以下の実験に用いた。
【００３０】
（３）ＰＣＲによる目的遺伝子の増幅とクローニング
（２）で作製したｃＤＮＡ　１００　ｎｇを鋳型にし、オオムギの水チャネルであるＢＰＷ１（配列番号１）（ジェンバンクアクセッション番号　ＡＢ００９３０７）全体をカバーするような、配列番号３に示す配列特異的上流プライマー、および下流ポリＴプライマー（１８個のＴ）を用いて、１００　μｌ溶液（最終濃度：２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ８．３・１．５　ｍＭ　ＭｇＣｌ２・０．２　ｍＭ　ｄＮＴＰ・０．０２％　ゼラチン・０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００）で以下の条件でＰＣＲを行った。即ち９４℃で１分加熱後、９４℃，３０秒、５２℃，６０秒、７２℃，６０秒の反応を３５回繰り返し、最後に７２℃，１２０秒加熱した。１％アガロースゲルで生成物を電気泳動しエチジウムブロマイドで染色したところ１本の主バンドが確認された。エタノール沈殿後乾固し１００　μｌの滅菌水に溶かした。本溶液１μｌとＴＡクローニングベクター（ｐＣＲ２．１；インビトロジェン社製）１μｌを混合し、ライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて１６℃でライゲーションを行った。形質転換は、コンピテントセル（ＤＨ５α）を用いてＨａｎａｈａｎの方法（ＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ．　ｖｏｌ１．　ｐ１０９−１３６．（１９８５））に従って行った。
【００３１】
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地上に形成された白色コロニーの中から、アルカリ−ＳＤＳ法でミニスクリーニングを行った。制限酵素ＥｃｏＲＩで切断しＤＮＡ断片の長さから目的とする該ＢＰＸ１遺伝子を含むと考えられるクローンを選抜した。該クローンを大量に精製し、蛍光シーケンサーにて塩基配列を確認したところ、報告されているＢＰＷ１遺伝子と完全に遺伝子配列が一致したので、以後該クローンをＢＰＷ１として用いた。
【００３２】
（４）植物発現ベクターの構築
特開平１０−１９１９８３に記載の発現ベクター（ｐｂｅｔ／ｃｈｌ／Ｍ２）を利用して以下のＢＰＷ１発現ベクターを構築した。ｐｂｅｔ／ｃｈｌ／Ｍ２のＳａｃＩ部位で切断し、クレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）処理して平滑末端とした後、さらにＳａｌＩ部位で切断し、（３）で得られたＢＰＷ１を含むプラスミドをＳａｌＩ部位及びＥｃｏＲＩ部位で切断し、ゲル電気泳動後、ＤＮＡ断片回収キット（例えば、　ＧＦＸ　ＰＣＲ　ＤＮＡ　ＡＮＤ　ＧＥＬ　ＢＡＮＤ　ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ　ＫＩＴ　（アマシャム・ファルマシア社製）　）で回収したものと混合し、ライゲーションキット（例えば、Ｔａｋａｒａ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　（宝バイオ社製））を用いてライゲーションした。こうして、該ＰＢＷ１遺伝子を含むＤＮＡ断片をカリフラワーモザイクウイルス由来の３５Ｓプロモーター及びヒマ由来のカタラーゼの第一イントロン、アグロバクテリウム由来のノパリン合成酵素ポリアデニレーション配列を含む発現ベクターのイントロンとポリアデニレーション配列の間に挿入した。エレクトロポーレーション法で形質転換を行う場合にはこのプラスミド（ｐ３５ＳＢｐｗ１）を用いた。
【００３３】
（５）イネの形質転換
継代後３〜６日のサスペンジョン細胞よりイネプロトプラストを単離後、ＥＰバッファー（５ｍＭ　ＭｇＣｌ_２，　７０　ｍＭ　ＫＣｌ，　０．１％ＭＥＳ，　ｐＨ５．６；フィルター滅菌する。）１０　ｍｌに懸濁、遠心する。再度ＥＰバッファーを加えて、最終６〜８×１０^６プロトプラスト／１０　ｍｌとする。ベクター（ｐ３５ＳＰＢＷ１）及び３５Ｓプロモーターで制御されたハイグロマイシンＢ　フォスフォトランスフェラーゼ遺伝子を含むベクターをそれぞれ懸濁液１ｍｌに対し、各々３０μｇを加え混合する。この懸濁液をマイクロキュベットに入れ、Ｘ−Ｃｅｌｌ　４５０　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）にて、１，０００μＦ、７５０Ｖ／ｃｍの減衰波を３０秒かける。プロトプラストをチューブに戻し氷中で冷却後、直径３ｃｍのプラスチックシャーレに移す。アガロース（８０　ｍｇ）を入れたパイレックス（コーニング　インコーポレイテッドの登録商標）チューブ（オートクレーブ滅菌）に、Ｒ２Ｐ培地２．５　ｍｌを加え溶かした後、３７〜４０℃に冷却する。プロトプラストを入れたシャーレに寒天溶液を０．５　ｍｌ加え、素早く混合して固めた後、Ｒ２Ｐ培地を５ｍｌ入れた直径５ｃｍのプラスチックシャーレに移す。ナース細胞として、ＯＣ細胞を１００　ｍｇ程度加え、３０℃、８０回転／分で振とう培養する。１０〜１４日に２０〜３０個の細胞塊となるのでこれを取り出し、新しいシャーレに移す。新たにＲ２Ｐ培地５ｍｌを入れ、最終濃度２５μｇ／ｍｌとなるように、ハイグロマイシン溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を加える。２〜３週間後、耐性を示して生育を続ける形質転換細胞と、分裂を停止する非形質転換細胞とが区別できるようになる。耐性を示した形質転換細胞塊をハイグロマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を含むＲ２ＳＡ寒天培地５ｍｌに置き、３０℃、２，０００　ｌｕｘで静置培養する。３週間から１カ月で耐性コロニーは生育を続けてカルスとなる。カルスをＲ２Ａ培地上で２週間ほど培養した後、ＰＣＲ等で該遺伝子の導入を確認する。遺伝子の導入されたものを再生培地に移し、再生個体を得る。
【００３４】
形質転換イネは、人工気象器あるいは隔離（閉鎖系）温室にて、各系統ごとにポット植えで生育させた。自家受粉により種子採種を繰り返し、形質転換当代（Ｔ_０世代とする）から２世代後（Ｔ_２世代となる）の植物体を使って、実験と解析を行った。
【００３５】
（６）タンパク質発現量の測定
サンプルの生重量を測定し、その３倍容積の磨砕バッファー（シュークロース：０．３Ｍ，　Ｔｒｉｓ：５０　ｍＭ，　ＥＤＴＡ：８　ｍＭ，　ＤＴＴ：４　ｍＭ，　ＰＭＳＦ：２　ｍＭ　（ｐＨ７．８））を加えて、乳鉢・乳棒を用いて、あるいはガラスホモジナイザーを用いて磨砕し、残渣を遠心で除いて粗タンパク液を得た。タンパク量は、ブラッドフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，　Ｍ．Ｍ．　１９７６．　Ａ　ｒａｐｉｄ　ａｎｄ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｇｒａｍ　ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｙｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ．Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　７２，　２４８−２５４．）で定量した。サンプルを可溶化バッファー（６０％シュークロース：１　ｍＬ，　１０％　ＬＤＬ：１　ｍＬ，　蒸留水：０．５　ｍＬ，　ＤＴＴ：４６　ｍｇ）と１：１で混合し、１００℃で１分間ボイルした後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１３％アクリルアミド濃度）法で電気泳動を行った。分離したタンパク質はメンブレンに転写（ＡＴＴＯ社、セミドライ式ｂｌｏｔｔｉｎｇ装置）したのち、定法にしたがってウエスタンブロットにより、目的タンパク質を検出した。ＢＰＷ１の検出に用いた一次抗体は、ＢＰＷ１のＮ末端付近のアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸番号７〜２０）に相当する人工ペプチドをエピトープとして、ＭＢＬ社（（株）医学生物学研究所、名古屋市中区丸の内３−５−１０）に依頼してウサギを用いて作成した。二次抗体はアルカリホスファテースで標識したヤギ抗ウサギＩＧｇ抗体（ＩＣＮ社、カタログナンバー５９２９９、米国オハイオ州、国内代理店（株）コスモバイオ）を用いて、発色によってシグナルを検出した。発色反応には、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル燐酸、０．１５Ｍトリス酢酸バッファー（ｐＨ９．６）、ニトロブルーテトラゾリウムを用いた。
【００３６】
ウエスタンブロットにより検出されたバンドの濃さは、メンブレンの画像をスキャナーでコンピュータに取りこんだ後、画像解析ソフト（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ａｎａｌｙｓｔ２．１）を用いて数値化した。ＢＰＷ１と同じ手法で検出したチトクロームＣタンパクのデータも取りこみ、定常的に発現している考えられるチトクロームＣの発現量を基準にしてＢＰＷ１の量を推定した。その結果、それぞれ別系統の形質転換体、６３２（２）系統と６３６系統のＴ_２世代で、根で導入遺伝子が発現していることが確認された（図１、図２）。図１のデータから、チトクロームｃの値を基準にＢＰＷ１の発現量を数値化すると図２に示すように野生型に比べて３〜４倍量の増加が認められた。野生型でも発現が認められるが、イネ内在性水チャネルタンパク質にＢＰＷ１抗体が反応したものと考えられた。
【００３７】
（７）根における水透過率の測定
水透過率の測定は、Ｔａｚａｗａ等の方法（Ｔａｚａｗａ，　Ｍ．，　Ｏｏｋｕｍａ，　Ｅ．，　Ｓｈｉｂａｓａｋａ，　Ｍ．　ａｎｄ　Ｎａｋａｓｈｉｍａ，　Ｓ．　（１９９７）　Ｍｅｒｃｕｒｉａｌ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｗａｔｅｒ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔ　ｉｎ　ｂａｒｌｅｙｒｏｏｔｓ．　Ｊ．　Ｐｌａｎｔ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１１０：４３５−４４２）に従って行った。実験には、播種後４−６日の幼植物イネを用いた。根先端から６ｃｍの長さになるように根をサンプリングし、ＡＰＷ液（ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ_２各０．１ｍＭ）に浸した。根を下図３に示す装置にセットし、２室間はラノリンとグリセリンを４：６で混合したものを塗って仕切った。
気泡をＢ側に挿入後、両室をＡＰＷ液で満たし、次いでＡ室を高浸透圧液（ＡＰＷ液に最終濃度で２００ｍＭになるようにソルビトールを加えたもの）に替えた。浸透圧差にしたがって水が根を通って移動する量をＢ室の気泡の動きを測定することによって計測した。根の表面積を測定して、各根について、単位時間あたり単位面積当たりの水透過率を算出した。その結果、６３２（２）系統において、非形質転換体（野生型、品種名キヌヒカリ）に比較して、２５％程度根の水透過率が上昇していることが認められた（図４）。
【００３８】
（８）葉の二酸化炭素透過性
葉の二酸化炭素透過性は、以下のようにして測定を行った。光合成測定装置（Ｙｕｋｏ　Ｔ．　Ｈａｎｂａ，　Ｓｈｉｎ−Ｉｃｈｉ　Ｍｉｙａｚａｗａ，　Ｈｉｒｏｙｕｋｉ　Ｋｏｇａｍｉ　ａｎｄ　Ｉｃｈｉｒｏ　Ｔｅｒａｓｈｉｍａ　”Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｌｅａｆ　ａｇｅ　ｏｎ　ｉｎｔｅｒｎａｌ　ＣＯ_２　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ　ａｎｄ　ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｉｎ　　ｔｒｅｅ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｈａｖｉｎｇ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｙｐｅｓ　ｏｆ　ｓｈｏｏｔ　ｐｈｅｎｏｌｏｇｙ”　Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　（２００１）　２８：１０７５−１０８４）を用いて、測定チャンバに流入・流出する空気中の二酸化炭素分圧と水蒸気分圧を測定することにより、葉の光合成速度を算出した。光合成速度の測定後、測定チャンバから流出する空気中の二酸化炭素を、光合成測定装置に接続された真空ラインを用いて分離・精製し、質量分析計（フィニガンマット社製）にて、安定同位体比（^１３Ｃ／^１２Ｃ）を測定した。葉の内部での二酸化炭素透過性は、光合成速度と、二酸化炭素の^１３Ｃ／^１２Ｃから　以下の計算式によって算出した。
（計算式）
葉内での二酸化炭素に対する透過性（拡散コンダクタンス：ｇ_ｉ）は、次のようにして計算される。
【００３９】
【式１】

【００４０】
Δは精製されたＣＯ_２の同位体比から計算される同位体分別、Δ_ｉ　は拡散コンダクタンスが無限大であると仮定した場合の同位体分別、　Ａ　は光合成速度，　Ｃ_ａ　は大気中の二酸化炭素分圧、ａ_ｉ　は　ＣＯ_２　が水中で拡散・水和するときの同位体分別　（１．８‰）、　ｂ　は　Ｒｕｂｉｓｃｏ　とＰＥＰ　カルボキシラーゼによる同位体分別　（３０‰）。その結果、６３２（２）系統で、葉において二酸化炭素透過性が上昇した（図５）。
【００４１】
【発明の効果】
本発明により、水の透過能が増強するように改変された植物、さらに水の透過能が増強するように改変されたことにより二酸化炭素透過能を向上させた植物が提供される。本発明の植物は、光合成活性の強い農作物を作成するのに有用と考えられる。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、形質転換体Ｔ_２の根におけるＢＰＷ１タンパク質の発現を示す図（写真）である。野生型：　非形質転換体（品種名：キヌヒカリ）、６３２（２）および６３６：　形質転換イネそれぞれ別系統のＴ_２。
【図２】図２は、ＢＰＷ１タンパク質の発現の定量の結果を示す図である。
【図３】図３は、水透過率の測定装置模式図である。
【図４】図４は、形質転換体および非転換体イネ根の水透過率を示す図である。
【図５】図５は、二酸化炭素透過性の変化を示す図である。

Claims (5)

1. 細胞膜の水透過能が増強されるように改変された植物。
2. 細胞膜の水透過能が増強されるように改変されたことにより、細胞膜の二酸化炭素透過能が増強された請求項１に記載の植物。
3. 植物における水の透過能が、水の膜透過に関与する遺伝子の発現を増強することにより、増強されているものである請求項１または２に記載の植物。
4. 水の膜透過に関与する遺伝子が、水チャネル遺伝子である請求項３に記載の植物。
5. 植物における水の透過能が、下記の何れかの塩基配列を有する遺伝子の発現を増強することにより、増強されているものである請求項１〜３のいずれか一項に記載の植物。
   （Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列；
   （Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列であって、細胞膜において水を透過する活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列；
   （Ｃ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号５３〜９１３からなる塩基配列；
   （Ｄ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号５３〜９１３からなる塩基配列において１から複数個の塩基が欠失、付加または置換されている塩基配列であって、細胞膜において水を透過する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；または
   （Ｅ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号５３〜９１３からなる塩基配列もしくはその相補配列またはそれらの一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、細胞膜において水を透過する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。

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