JP4931887B2 - ネギ属植物の可食部の辛さを推定する方法 - Google Patents
ネギ属植物の可食部の辛さを推定する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4931887B2 JP4931887B2 JP2008244461A JP2008244461A JP4931887B2 JP 4931887 B2 JP4931887 B2 JP 4931887B2 JP 2008244461 A JP2008244461 A JP 2008244461A JP 2008244461 A JP2008244461 A JP 2008244461A JP 4931887 B2 JP4931887 B2 JP 4931887B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- lfs
- onion
- amount
- elisa
- hotness
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000234282 Allium Species 0.000 title claims description 125
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 72
- 235000019633 pungent taste Nutrition 0.000 title claims description 62
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 claims description 90
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 23
- 240000006108 Allium ampeloprasum Species 0.000 claims description 22
- 235000005254 Allium ampeloprasum Nutrition 0.000 claims description 20
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 20
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 18
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 9
- 241001214984 Crinum thaianum Species 0.000 claims description 7
- 241000282330 Procyon lotor Species 0.000 claims description 3
- 238000010187 selection method Methods 0.000 claims description 3
- 244000291564 Allium cepa Species 0.000 claims description 2
- 235000010167 Allium cepa var aggregatum Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims 1
- 101710179616 Lachrymatory-factor synthase Proteins 0.000 description 83
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 75
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 44
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 24
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 14
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 14
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 238000011161 development Methods 0.000 description 11
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 11
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 10
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 9
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 8
- 229940072113 onion extract Drugs 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 7
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 7
- MJPOWQTYEJVYKF-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxysulfanylprop-1-ene Chemical compound CC=CSO MJPOWQTYEJVYKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WZFUQSJFWNHZHM-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2 WZFUQSJFWNHZHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 6
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 6
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 6
- 150000008111 thiosulfinates Chemical class 0.000 description 6
- 108010092760 Alliin lyase Proteins 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- MCMNRKCIXSYSNV-UHFFFAOYSA-N Zirconium dioxide Chemical compound O=[Zr]=O MCMNRKCIXSYSNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- -1 alkenyl cysteine sulfoxide Chemical compound 0.000 description 4
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000000538 analytical sample Substances 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 229940076788 pyruvate Drugs 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 3
- HORQAOAYAYGIBM-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitrophenylhydrazine Chemical compound NNC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O HORQAOAYAYGIBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001499808 Allium atrorubens Species 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- OKYHUOHBRKWCQJ-FTJYXMLISA-N S-1-propenyl-L-cysteine sulfoxide zwitterion Chemical compound C\C=C\S(=O)C[C@H](N)C(O)=O OKYHUOHBRKWCQJ-FTJYXMLISA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- AMPHKYRLSOPVBX-YFKPBYRVSA-N allylcysteine Chemical compound OC(=O)[C@H](CS)NCC=C AMPHKYRLSOPVBX-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- BAZSXBOAXJLRNH-UHFFFAOYSA-N propanethial S-oxide Chemical compound CCC=S=O BAZSXBOAXJLRNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 235000012045 salad Nutrition 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000002344 surface layer Substances 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- WVVOBOZHTQJXPB-UHFFFAOYSA-N N-anilino-N-nitronitramide Chemical compound [N+](=O)([O-])N(NC1=CC=CC=C1)[N+](=O)[O-] WVVOBOZHTQJXPB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 235000021329 brown rice Nutrition 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 235000018927 edible plant Nutrition 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 238000003898 horticulture Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 230000000174 oncolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- POECFFCNUXZPJT-UHFFFAOYSA-M sodium;carbonic acid;hydrogen carbonate Chemical compound [Na+].OC(O)=O.OC([O-])=O POECFFCNUXZPJT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000019654 spicy taste Nutrition 0.000 description 1
- RVEZZJVBDQCTEF-UHFFFAOYSA-N sulfenic acid Chemical compound SO RVEZZJVBDQCTEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
調理や加工に伴って、ネギ属植物の細胞破砕が引き起こされると、ACSOsがalliinaseによる分解を受け、一分子のACSOsからスルフェン酸、ピルビン酸、アンモニアがそれぞれ一分子ずつ生成される。ACSOsのうち、trans-1-propenyl cysteine sulfoxide(PRENCSO)については、生成されるスルフェン酸は1-propenyl sulfenic acidであり、次に、この1-propenyl sulfenic acidが催涙因子合成酵素(LFS)の働きによって、催涙因子(Lachrymatory factor LF)となる(非特許文献1)。従って、alliinase活性の強さやPRENCSO含有量が同じであれば、LFSの発現程度が低いタマネギほど催涙性が低くなることを示唆している。さらに、LFS量が少なくなるに従い、LFへ変換される1-propenyl sulfenic acidが少なくなり、1-propenyl sulfenic acidからの別の反応経路と考えられるthiosulfinate(s)生成に用いられるようになることも推測されている(非特許文献1)。
(2) ネギ属植物がタマネギ、シャロット、ネギ、ラッキョウ又はリーキである、(1)の方法。
(3) ネギ属植物中のLFSの量を、LFSに特異的な抗体を用いる免疫測定法により測定し、測定されたLFSの量に基づいて該ネギ属植物の可食部の辛さを推定する、(1)又は(2)の方法。
(4) ネギ属植物の成長点を含む部位以外の部分を分析試料として、該分析試料中のLFSの量を測定し、測定されたLFSの量に基づいて該ネギ属植物の可食部の辛さを推定する、(1)〜(3)のいずれかの方法。
(5) (1)〜(4)のいずれかの方法により、ネギ属植物の可食部の辛さを推定し、所望の辛さの可食部を有する個体を選抜する、ネギ属植物個体の選抜方法。
(6) LFSに特異的な抗体を含む、ネギ属植物の可食部の辛さを推定するためのキット。
(7) タマネギ球を、球の上端から1/3〜1/2の高さで、球の上下方向軸に垂直な面に沿って2分割して得られる上側部分又は下側部分の切断面中心部の鱗葉から抽出した抽出液を分析試料として、該分析試料中のLFSの量を、LFSに特異的な抗体を用いる免疫測定法により測定する、タマネギ中のLFSの量を測定する方法。
本発明において「ネギ属植物」とは、分類学的にネギ属(Allium)に属する植物を指し、典型的にはタマネギ、シャロット、ネギ、ラッキョウ、リーキ等を指す。
催涙成分生成酵素(LFS)は、ネギ属植物中に含まれる、1-propenyl sulfenic acidを催涙因子(Lachrymatory factor LF)に変換する酵素として公知である(非特許文献3)。
ネギ属植物中のLFSの量は、LFSに特異的な抗体を用いる免疫測定法により測定することが好ましい。免疫測定法は迅速かつ簡便に正確な測定を可能にする。免疫測定法によれば、実施例6に示すように分析試料を冷蔵又は冷凍にて長期保存した後でもLFS量の定量が可能であること、マルチウェルプレートを用いて一度に多数の試料を分析可能であることから、多検体分析に適している。
本発明で使用するELISA法について説明する。
LFS量を測定するための分析試料はネギ属植物のいずれかの部位に由来する。可食部の辛さを推定する場合には、対象とする可食部から分析試料が採取されることが好ましい。
タマネギ球中のLFS量を測定する場合には、球の上端から1/3〜1/2の高さで、球の上下方向軸(タマネギ球の底盤部と先端部とを通る軸)に垂直な面に沿って2分割し、得られた上側部分(先端部を含む側)又は下側部分(底盤部を含む側)の切断面中心部の鱗葉から抽出した抽出液を分析試料とすることが好ましい(図2参照)。図2は、前記下側部の切断面表層の中心部鱗葉を用いる例を示す。「切断面中心部の鱗葉」とは、切断面上に現れる鱗葉のうち最内層の鱗葉(軸心に存在する芽を囲む鱗葉)又はその近傍の鱗葉の、切断面側の表層部を指す。「表層部」とは例えば切断面から厚さ2mm〜10mmの部分である。更に、切断面中心部の鱗葉を粉砕又は細切し、そのうち数百ミリグラム(例えば400〜600ミリグラム)分を用いて抽出を行うことが好ましい。本発明者らは驚くべきことに、こうして得られた抽出液中のLFS量が、タマネギ球全体のLFS量を反映していることを見出した。
上記方法によるLFS量の測定結果または辛さの推定結果に基づいて、所望の辛さの可食部を生産するネギ属植物個体を選抜することができる。上述の通りLFS量の測定にELISA法を用いることにより多検体の処理が可能になることから、育種現場などの数百〜数千個体の集団から所望の個体を選抜することができる。このような育種の目的で使用できる辛さの推定方法は従来提供されていない。
ネギ属植物の可食部の辛さを推定するための本発明のキットはLFSに特異的な抗体を少なくとも含む。キットの他の構成要素としては、検量線を作成するための試料や、ELISA法を実施するための二次抗体、発色試薬、マルチウェルプレート、溶液等の各種試薬や、LFS量測定値と辛さとの関係を示す表またはグラフや、取り扱い説明書等の各種文書が挙げられる。
本発明によるネギ属植物可食部の辛さ推定法は、ピルビン酸生成量に基づく辛さ推定法と比較して精度が高く、なおかつ分析試料が少量で済むという点で有利である。しかも、本発明の辛さ推定法と従来の辛さ推定法とは観点が異なることから、両者を組み合わせて使用すれば、より高精度で辛さを推定することが可能となる。
大腸菌を用いて発現させたタマネギ催涙因子合成酵素(rLFS)を凍結乾燥した。得られた凍結乾燥LFSを抗原として、ウサギ(日本白色種 メス)の皮内に0.2mgずつ2週間おきに免疫した。アジュバントには、1回目の免疫時にはFCAを用い、2回目〜6回目の免疫時にはIFAを用いた。3回目〜5回目のそれぞれの免疫後1週間経過後、少量採血し、抗体価の上昇を調べた。6回目の免疫後1週間たってから、全採血した。得られた血液を遠心分離し、抗LFS抗血清を得た。
試料を添付したELISAプレートを37℃に調温した恒温槽内に1時間静置した。1時間経過後、ELISAプレートを恒温槽から取り出し、以下の洗浄ステップに進めた。(i) 全てのwellsから溶液を除去した。(ii) 洗浄buffer(0.05% ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート(Tween-20同等品)in 140mM NaCl,10mM Na2HPO4-NaH2PO4(pH7.4))を各wellに300ulずつ加え、ただちに洗浄bufferを除去することを3回繰り返した。(iii) 3回目の洗浄bufferを除去した後で、ペーパータオルを敷いた実験台上にELISAプレートをたたきつけて、well内から洗浄bufferを完全に取り除いた。以上の洗浄ステップ((i)〜(iii))を経たELISAプレートの各wellにblocking 溶液(1%(w/v) BSA in coating buffer (50mM sodium carbonate-bicarbonate buffer (pH9.6))を300ulずつ添加した。そのままELISAプレートを37℃に調温した恒温槽内に1時間静置した。1時間経過後、上記の洗浄ステップ((i)〜(iii))を繰り返した。洗浄後のELISA plateに一次抗体(抗LFS抗血清をdilution buffer(0.1% BSA in 140mM NaCl,10mM Na2HPO4-NaH2PO4(pH7.4))で1000倍に希釈したもの)を各wellに100ulずつ添加した。そのままELISAプレートを37℃に調温した恒温槽内を用いる場合は3時間、4℃冷蔵庫を用いる場合は一晩(16時間〜22時間)静置し、一次抗体を反応させた。一次抗体との反応時間後、ELISAプレートを上記の洗浄ステップ((i)〜(iii))に供した。洗浄後のELISA plateに二次抗体(POD conjugated anti-rabbit IgG whole molecule Sigma A0545をdilution bufferを5000倍〜20000倍希釈したもの)を各wellに200ulずつ添加した。二次抗体を添加したELISAプレートを37℃に調温した恒温槽内に1時間静置した。1時間経過後、上記の洗浄ステップ((i)〜(iii))を繰り返した。洗浄後のELISA plateに発色試薬(TBA ELISA基質溶液(Bio-Rad 172-1066)を100ulずつ添加した。添加後、ただちにELISAプレートを25℃恒温室内で、60rpmで振盪攪拌しながら発色反応を進めた。発色試薬添加後、10min〜60minの間にマイクロプレートリーダー(Emax モレキュラーダイナミクス社)を用いて650nmの吸光度を測定した。
本実施例では遺伝子組み換え法により調製されたLFS(rLFS)を用いた。1.6mg/mlのrLFS溶液をPBSで100倍希釈した。出来上がった100倍希釈液を3倍ずつ9段階希釈し、100倍、300倍、900倍、2700倍、8100倍、24300倍、72900倍、218700倍、656100倍、1968300倍の10段階の試料(1.6ug/well〜0.08ng/well)を調製した。それら100ulをELISA plate (Maxisorb Immuno plate Nunc社)の各wellに添加し、ELISA試料とし、実施例2の方法で抗LFS抗血清を用いたELISAを行った。
1)タマネギ球からのサンプリング方法(小片からの抽出)
(タマネギ小片の切り出し・計量)
電子天秤を用いて、タマネギ球(bulbs)の重さを測り記録してから、最外層の茶色の皮をはぎとり、個体識別のために、タマネギ球の下部に油性マジックで番号を書き込んだ。番号を書いたタマネギ球を、球の先端から1/3〜1/2の高さ位置において上下方向軸に垂直な面に沿って2分割し、下側2/3-1/2球側から、その切断面に平行に厚さ3〜5mmのタマネギスライスを一枚切り取った。出来上がったタマネギスライスの鱗葉をバラバラにしていき、いくつかの芽を取り囲んだ最内層のリングを取り出した(図-2の黒色部分)。取り出したリングをメス刃を用いて、12等分〜16等分して、1辺3−5mmの小片にした。こうしてできた小片をジルコニアビーズ(3mmφ)を3個入れた2ml容チューブ(safe lock tube eppendorf社)に400-600mg分サンプリングした。小片とビーズの入ったチューブを振って、サンプルとビーズができるだけ交互に位置するようにした。出来上がったサンプルを入れたチューブを氷上に置いた。
タマネギ小片とビーズの入っているチューブをビーズミル(MM300 QIAGEN社)のラックにセットし、30Hz×60secの条件で破砕した。破砕後、タマネギ組織が塊りとして残っていないことを目視で調べながら、ラックからチューブを取り出し、氷上に移した。組織片が塊りとして残っていたチューブはもう一度30Hz×60sceで破砕した。破砕の完了したチューブを氷上に置いた。
破砕物の入ったチューブに1000ulずつのPBS(リン酸緩衝生理食塩水)を加え、タッチミキサーを用いて攪拌した。攪拌後、15000rpm x 5min, 4℃の遠心分離に供した。遠心によって得られた上清をタマネギ抽出液として新しいサンプリングチューブに回収した。出来上がったタマネギ抽出液を-80℃冷凍庫に入れ、ELISA分析当日まで冷凍保管した。
タマネギ抽出液を冷凍庫から取り出して、融解してからタッチミキサーで攪拌し、均一にした。均一にした抽出液を10ul取り、90ulのcoating bufferと混合し1/10濃度液を調製した。1/10濃度液を100ul取り、150ulのcoating bufferと混合し1/25濃度液を調製した。1/25濃度液を90ul取り、90ulのcoating bufferと混合し1/50濃度液を調製した。この後、coating bufferとの等量混合を繰り返して、1/100濃度液、1/200濃度液、1/400濃度液、1/800濃度液を調製した。こうして調製した1/25濃度液〜1/800濃度液(6段階)をあらかじめ90ulのcoating bufferを添加したELISAプレートの各wellに10ulずつ添加して、抗LFS抗血清を用いたELISA実験を行った。ELISAプレートへの添加時にさらに10倍希釈されるので、最終的な測定濃度は、1/250濃度〜1/8000濃度となった。ELISAの手順は実施例2記載の手順で進めた。
実施例4-1)の手順で調製したタマネギ小片からの抽出試料でのELISA結果がタマネギ球の全体のLFSの濃度を反映しているかどうかを調べるために、以下の実験を行った。
図2のように、タマネギ球の上から1/3で2分割して得た上部1/3部分を1cm幅に刻んだ上で、全体が均一になるように混ぜ合わせ、その中から実施例4-1)で示した400-600mg分のサンプリングを行い、ビーズミルでの破砕を進めた。同じタマネギ球から実施例4-1)の手順どおりに球中央部小片からの試料調製も行った。
タマネギ3球(それぞれP, Q, Rと称する)について、中央部小片からの抽出試料と上部1/3全体からの抽出試料を調製し、その両方を用いたcoating bufferで200倍希釈した。それぞれの200倍希釈液をあらかじめ90ulのcoating bufferを入れたELISAプレートのwellに10ul添加して、実施例2の手順でELISA実験を進めた。
4つのタマネギ球(それぞれbulb S, bulb T, bulb U, bulb Vと称する)について、実施例4-1)の手順でその抽出液を調製し、3等分し、抽出当日ELSIAに供するもの(Dy=0)、4℃冷蔵庫に保管するもの、-80℃ freezerに冷凍保管するものに分けた。10日後に4℃保管品、-80℃保管品をELISAに供した結果を図5に示した。
今回のELISA法が実際のタマネギの辛味や催涙性の強さの特性を区別できる方法であるかどうかを調べるために以下の実験を行った。
あらかじめ官能評価を行い、辛味程度を判定した市販タマネギについて今回のELISA法を実施し、タマネギの辛味程度とLFS量の間に相関があるかどうかを調べるために以下の実験を行った。愛媛県甘タマネギ、佐賀県産早生系統、静岡県産、北海道産(2種類)の5種類のタマネギについて、各系統の4球或いは5球からの中央小片を混合した上で、実施例4-1)の手順でそれぞれ抽出液を調製した。得られた抽出液をcoating bufferで100倍希釈した。それぞれの100倍希釈液をあらかじめ90ulのcoating bufferを入れたELISAプレートのwellに10ul添加して、実施例2)の手順でELISA実験を進めた。同じELISAプレート内でrLFS段階希釈液を試料としたELISAも同時に進め、その発色量から検量線を作成し、それぞれの系統の発色量をrLFS濃度に換算して比較した。
(結果)
6-7名の評価結果をまとめると以下のとおりだった。
辛味が中程度と推測される国内産市販タマネギ17個体(淡路島産(系統(1):1個体、系統(2):2個体)、愛知県産(2個体)、熊本県産(3個体)、滋賀県産(3個体)、和歌山県産(3個体)、佐賀県産(赤タマネギ2個体))を試料とした。
タマネギ球から20-40gを切り出し、1g当たり1mlの蒸留水を加えて破砕した。得られた破砕液から1mlを取り、15000rpm×5minの遠心分離を行い、遠心上清を回収した。破砕開始10分後に遠心上清15ulに2mlのDNPH溶液(12.5mg DNPH (dinitro phenyl hydrazine/0.5M HCl 100ml)を加え、攪拌してから、37℃に調温した恒温水槽中に10min置いた。10min後に、1mlの1.5M NaOHを加え、攪拌してから、分光光度計を用いて515nmの吸光度を測定した。抽出サンプルのかわりにピルビン酸Na溶液の希釈系列を用いて、同様に測定した値から、検量線を作成し、抽出サンプルでの吸光度測定値をピルビン酸量に換算した。
実施例4-1)の手順でそれぞれのタマネギから抽出液を調製した。得られた抽出液をcoating bufferで100倍希釈した。それぞれの100倍希釈液をあらかじめ90ulのcoating bufferを入れたELISAプレートのwellに10ul添加して、実施例2の手順でELISA実験を進めた。同じELISAプレート内でrLFS段階希釈液を試料としたELISAも同時に進め、その発色量から検量線を作成し、それぞれの系統の発色量をrLFS濃度に換算して比較した。
タマネギ球の中心付近の鱗葉1-2g分を用いて、辛味の有無・強さを判定した。辛味の強さは、実施例8と同じ5段階に分類した。
それぞれのタマネギ球の辛味強さを縦軸にとり、横軸にピルビン酸生成量、或いは、LFS量を取った結果を図8に示した。図8中、左側グラフがピルビン酸生成量を横軸にとったものであり、右側のグラフがLFS量を横軸に取ったものである。
以上の結果は、ピルビン酸だけでは辛味が予想できないタマネギについて、LFS量を測定することで、官能評価結果に対応する辛味を予想できることを示していた。
今回用いている抗血清はタマネギLFSを抗原として調製したものである。催涙性を示すネギ属植物はタマネギの他にも知られており、それらがLFSを有しており、且つ、cDNAからの推定アミノ酸配列が類似していることも知られている(特許文献1)。そこで、今回のELISA法がタマネギ以外の催涙性を有するネギ属植物にも応用できるかどうかを以下の実験によって調べた。
Claims (7)
- ネギ属植物中の催涙成分生成酵素(LFS)の量に基づいて該ネギ属植物の可食部の辛さを推定する方法。
- ネギ属植物がタマネギ、シャロット、ネギ、ラッキョウ又はリーキである、請求項1の方法。
- ネギ属植物中のLFSの量を、LFSに特異的な抗体を用いる免疫測定法により測定し、測定されたLFSの量に基づいて該ネギ属植物の可食部の辛さを推定する、請求項1又は2の方法。
- ネギ属植物の成長点を含む部位以外の部分を分析試料として、該分析試料中のLFSの量を測定し、測定されたLFSの量に基づいて該ネギ属植物の可食部の辛さを推定する、請求項1〜3のいずれか1項の方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項の方法により、ネギ属植物の可食部の辛さを推定し、所望の辛さの可食部を有する個体を選抜する、ネギ属植物個体の選抜方法。
- LFSに特異的な抗体を含む、ネギ属植物の可食部の辛さを推定するためのキット。
- タマネギ球を、球の上端から1/3〜1/2の高さで、球の上下方向軸に垂直な面に沿って2分割して得られる上側部分又は下側部分の切断面中心部の鱗葉から抽出した抽出液を分析試料として、該分析試料中のLFSの量を、LFSに特異的な抗体を用いる免疫測定法により測定する、タマネギ中のLFSの量を測定する方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008244461A JP4931887B2 (ja) | 2008-09-24 | 2008-09-24 | ネギ属植物の可食部の辛さを推定する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008244461A JP4931887B2 (ja) | 2008-09-24 | 2008-09-24 | ネギ属植物の可食部の辛さを推定する方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2010078361A JP2010078361A (ja) | 2010-04-08 |
JP4931887B2 true JP4931887B2 (ja) | 2012-05-16 |
Family
ID=42209001
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008244461A Active JP4931887B2 (ja) | 2008-09-24 | 2008-09-24 | ネギ属植物の可食部の辛さを推定する方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP4931887B2 (ja) |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP3999914B2 (ja) * | 1999-10-26 | 2007-10-31 | 花王株式会社 | 油脂組成物 |
ES2321922T3 (es) * | 2002-03-01 | 2009-06-15 | House Foods Corporation | Dna y vector para regular la expresion del gen de la sintasa del factor lacrimatorio, metodo para regular la expresion del gen de la sintasa del factor lacrimatorio mediante su uso, y planta con expresion regulada del gen de la sintasa del factor lacrimatorio. |
US20070016984A1 (en) * | 2005-07-15 | 2007-01-18 | Scott Hendricks | Low pungency, long day onion |
JP4837643B2 (ja) * | 2007-09-28 | 2011-12-14 | ハウス食品株式会社 | ネギ属植物中におけるprencsoの測定方法 |
-
2008
- 2008-09-24 JP JP2008244461A patent/JP4931887B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2010078361A (ja) | 2010-04-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EFSA Panel on Dietetic Products, Nutrition and Allergies (NDA) | Scientific Opinion on the evaluation of allergenic foods and food ingredients for labelling purposes | |
Krause et al. | Lipid transfer protein (Ara h 9) as a new peanut allergen relevant for a Mediterranean allergic population | |
Peeters et al. | Lupine allergy: not simply cross-reactivity with peanut or soy | |
Scheurer et al. | Recombinant allergens Pru av 1 and Pru av 4 and a newly identified lipid transfer protein in the in vitro diagnosis of cherry allergy | |
Bublin et al. | IgE sensitization profiles toward green and gold kiwifruits differ among patients allergic to kiwifruit from 3 European countries | |
Pilolli et al. | Critical review on proteotypic peptide marker tracing for six allergenic ingredients in incurred foods by mass spectrometry | |
NO20110426A1 (no) | Fremgangsmate for a identifisere allergene proteiner og peptider | |
Saha et al. | Mining novel allergens from coconut pollen employing manual de novo sequencing and homology-driven proteomics | |
Kabasser et al. | Identification of Pru du 6 as a potential marker allergen for almond allergy | |
Mattarozzi et al. | The role of incurred materials in method development and validation to account for food processing effects in food allergen analysis | |
Bauermeister et al. | Assessment of component-resolved in vitro diagnosis of celeriac allergy | |
Monaci et al. | Food allergens: Classification, molecular properties, characterization, and detection in food sources | |
Crespo et al. | Germin‐like protein Cit s 1 and profilin Cit s 2 are major allergens in orange (Citrus sinensis) fruits | |
Sanchiz et al. | Detection of pistachio allergen coding sequences in food products: A comparison of two real time PCR approaches | |
Araujo et al. | Molecular-based diagnosis of respiratory allergic diseases in children from Curitiba, a city in Southern Brazil | |
Wang et al. | Development of an indirect competitive immunoassay for walnut protein component in food | |
Pasquariello et al. | Analysis of the potential allergenicity of traditional apple cultivars by Multiplex Biochip-Based Immunoassay | |
Goodman | Performing IgE serum testing due to bioinformatics matches in the allergenicity assessment of GM crops | |
Kang et al. | Quantification of major allergens in peach based on shotgun proteomics using liquid chromatography-tandem mass spectrometry | |
Khodadadi et al. | Occurrence of aflatoxin M1 in pasteurized and traditional cheese marketed in southern Khorasan, Iran | |
Cabanillas et al. | Pin p 1 is a major allergen in pine nut and the first food allergen described in the plant group of gymnosperms | |
JP4931887B2 (ja) | ネギ属植物の可食部の辛さを推定する方法 | |
Ribeiro et al. | Analysis of the pollen allergen content of twelve olive cultivars grown in Portugal | |
Kaeswurm et al. | New Mass Spectrometric Approach to Quantify the Major Isoallergens of the Apple Allergen Mal d 1 | |
US20110077472A1 (en) | Methods and compositions for biomarkers of fatigue, fitness and physical performance capacity |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20100917 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20120130 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20120207 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120214 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4931887 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150224 Year of fee payment: 3 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |