JP4837643B2 - ネギ属植物中におけるｐｒｅｎｃｓｏの測定方法 - Google Patents
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Description
本発明は、タマネギやネギ等のネギ属植物中におけるＡＣＳＯｓの含有量を測定する方法に関する。
アリルシステインスルフォキシド（Ａｌｋｙｌ cysteine ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）、アルケニルシステインスルフォキシド（Ａｌｋｅｎｙｌ cysteine ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）は、cysteineのイオウ原子に炭化水素鎖と酸素が結合したアミノ酸の一種であり、タマネギやネギ等のネギ属植物に多く含まれている化合物（ＡＣＳＯｓ）として知られている。これらＡＣＳＯｓはネギ属植物の種によってその種類や組成比の異なることが知られており、その種類や組成比がネギ属植物の香りや味に影響を与えている。
ネギ属植物は調理や加工等に伴う細胞破砕が起きると、酵素ａｌｌｉｉｎａｓｅによるＡＣＳＯｓの分解がトリガーとなって一連の反応が引き起こされ、その反応過程で生成される種々の物質が香りや味の質を特徴付けている。例えば、ニンニクには２−ｐｒｏｐｅｎｙｌ Ｌ−cysteine ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ａｌｌｉｉｎ）が多量に含まれており、そのａｌｌｉｉｎａｓｅ反応分解物が２分子結合して生成されるｔｈｉｏｓｕｌｆｉｎａｔｅの一種であるａｌｉｃｉｎはニンニク臭の本体であり、その生理活性についても多くの研究が行われている。また、タマネギにおける主要なＡＣＳＯはｔｒａｎｓ１−ｐｒｏｐｅｎｙｌ cysteine ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＰＲＥＮＣＳＯ）であり、この物質のａｌｌｉｉｎａｓｅ反応分解物が催涙因子合成酵素（ＬＦＳ）の働きを受け、催涙因子（ＬＦ）になることが報告されている（非特許文献１）。
ネギ属植物の種によって異なる香りや味の特性を解明するために、そのネギ属植物の香りや味の質を特徴付けている物質の含有量を測定することが行われている。しかし、一連の反応過程で生成される物質の中には、不安定で、また機器分析によって捉え難いものも含まれているため、その測定が困難な場合がある。こうしたことから、一連の反応の出発物質である酵素ａｌｌｉｉｎａｓｅの活性の強さを測定することや（非特許文献２）、ＡＣＳＯｓの含有量を測定することも行われている。
非特許文献３には、タマネギ中におけるＡＣＳＯｓの含有量を測定するに当たり、有機溶媒を用いてタマネギ組織からＡＣＳＯｓを抽出する方法が開示されている。具体的には、タマネギを−２０℃下でメタノール：クロロホルム：水（１２：５：３）の溶媒に一晩浸漬した後、更にメタノール：クロロホルム：水（１２：５：３）の溶媒を交換して３〜４時間抽出し、その後、８０％エタノールで２時間抽出する方法が記載されている。また、非特許文献４には、有機溶媒による抽出時にｈｙｄｒｏｘｙａｍｉｎｅを添加しておく方法、抽出に供するニンニクを予め液体窒素で凍結しておく方法が開示されている。
Ｎａｔｕｒｅ ｖｏｌ．４１９ ｐ．６８５ （２００２） Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．５０ ｐ．２８８４−２８９０ （２００２） Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｈｏｒｔ．Ｓｃｉ．ｖｏｌ１２４（２） ｐ．１７７−１８３ （１９９９） Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｖｏｌ．４ ｐ．４−９ （１９９４）
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ネギ属植物中におけるＡＣＳＯｓの測定において、非特許文献３及び非特許文献４に開示される有機溶媒を用いてＡＣＳＯｓを抽出する方法は、ＡＣＳＯｓの抽出に一晩以上の長い時間が必要である。また、この方法では最終的なＨＰＬＣ分析に当たり、挟雑物を除去するための前処理として、イオン交換樹脂への吸着、洗浄及び酸溶液での溶出工程を経る必要があった。したがって、非特許文献３及び非特許文献４に開示される有機溶媒を用いてＡＣＳＯｓを抽出する方法は、迅速性及び簡便性の点で課題がある。
そこで、本発明の目的は、ネギ属植物中におけるＡＣＳＯｓの含有量を迅速且つ簡便に測定する方法を提供することにある。
かかる技術的課題は、タマネギ又はネギ中におけるＰＲＥＮＣＳＯの含有量を測定する方法であって、（ａ）タマネギ又はネギを砕くことなくマイクロ波により加熱して該タマネギ又はネギ細胞内の酵素ａｌｌｉｉｎａｓｅを失活させる工程と、（ｂ）前記工程（ａ）で酵素ａｌｌｉｉｎａｓｅを失活させたタマネギ又はネギを砕いて試料液を調製する工程と、（ｃ）前記工程（ｂ）で得られた試料液を前処理を行うことなく用いて、ＨＰＬＣ分析によりＰＲＥＮＣＳＯの含有量を測定する工程とを含むことを特徴とするタマネギ又はネギ中におけるＰＲＥＮＣＳＯの測定方法により達成される。
本発明の測定方法によれば、ネギ属植物を砕くことなく植物組織内で酵素ａｌｌｉｉｎａｓｅとＡＣＳＯｓとが別々の場所に存在し両者が出会う前の状態で、マイクロ波により加熱して酵素ａｌｌｉｉｎａｓｅを失活させ、その後、酵素ａｌｌｉｉｎａｓｅを失活させたネギ属植物を砕いて試料液を調製し、この試料液を用いてＨＰＬＣ分析によりＡＣＳＯｓの含有量を測定することにより、ネギ属植物中におけるＡＣＳＯｓの含有量を迅速且つ簡便に測定することができる。
本発明の測定方法が適用される「ネギ属植物」とは、分類学的にネギ属（Ａｌｌｉｕｍ）に属する植物であり、その代表的な植物としては、タマネギ、ネギ、ラッキョウ、ニンニク、リーキ等が挙げられる。また、本発明において「ＡＣＳＯｓ」とは、アリルシステインスルフォキシド（Ａｌｋｙｌ cysteine ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）と、アルケニルシステインスルフォキシド（Ａｌｋｅｎｙｌ cysteine ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）との両方を包含する用語である。このＡＣＳＯｓの具体例としては、タマネギやネギ、ラッキョウ、ニンニク、リーキに含まれているｔｒａｎｓ１−ｐｒｏｐｅｎｙｌ cysteine ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＰＲＥＮＣＳＯ）、ネギやラッキョウに含まれているＭｅｔｈｙ Ｌ−cysteine ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＭｅＣＳＯ）、ニンニクに含まれている２−ｐｒｏｐｅｎｙｌ Ｌ−cysteine ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ａｌｌｉｉｎ）等が挙げられる。
本発明の測定方法は、
（ａ）ネギ属植物を砕くことなくマイクロ波により加熱して該植物細胞内の酵素ａｌｌｉｉｎａｓｅを失活させる工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）で酵素ａｌｌｉｉｎａｓｅを失活させたネギ属植物を砕いて試料液を調製する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）で得られた試料液を用いて、ＨＰＬＣ分析によりＡＣＳＯｓの含有量を測定する工程とを含む。
（ａ）ネギ属植物を砕くことなくマイクロ波により加熱して該植物細胞内の酵素ａｌｌｉｉｎａｓｅを失活させる工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）で酵素ａｌｌｉｉｎａｓｅを失活させたネギ属植物を砕いて試料液を調製する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）で得られた試料液を用いて、ＨＰＬＣ分析によりＡＣＳＯｓの含有量を測定する工程とを含む。
工程（ａ）では、具体的には、ネギ属植物を必要により剥皮し、適当な大きさに切るか又は切ることなく、電子レンジ等を用いてマイクロ波により加熱して該植物細胞内の酵素ａｌｌｉｉｎａｓｅを失活させる。これにより、酵素ａｌｌｉｉｎａｓｅよるＡＣＳＯｓの分解反応が進む前に、酵素ａｌｌｉｉｎａｓｅを短時間で失活させることができる。マイクロ波による加熱条件は、植物組織中のａｌｌｉｉｎａｓｅが失活するのに十分な処理条件であればよいが、後述する実施例において、タマネギを用いたマイクロ波による加熱条件の設定例について詳述する。
次に、工程（ｂ）では、具体的には、ネギ属植物の植物組織が均一になるまで破砕し、遠心分離する等して試料液を調製する。ネギ属植物を破砕する方法としては、破砕する植物組織の大きさを基にして選択すればよい。ネギ属植物を破砕する方法として、具体的には、例えば、家庭用のミキサーを用いて破砕する方法、乳鉢と乳棒を用いて破砕する方法、エッペンドルフチューブに入れた組織片をマイクロ乳棒を用いて破砕する方法、ＱＩＡＧＥＮ社ＭＭ３００等のビーズミルを用いて破砕する方法が挙げられる。
工程（ｂ）では、ネギ属植物に蒸留水を添加し、これを砕いて試料液を調製してもよい。これにより、ネギ属植物の破砕が容易になると共に、ＡＣＳＯｓの抽出効率を高めることができる。ここで、蒸留水の添加量としては、例えばネギ属植物と同重量を好適な量として挙げることができる。このようにして得られた試料液は、そのまま冷凍保存することが可能であり、多検体の分析を行うのに適しているという利点がある。
工程（ｃ）では、上述のようにして得られた試料液を前処理の必要なく、ＨＰＬＣ分析に供することができる。すなわち、本発明の測定方法においては、ＡＣＳＯｓ分析の障害となる挟雑物を除去するための前処理を行う必要がなく、工程（ｂ）で得られた試料液をそのままＨＰＬＣ分析に供することができ作業工程が少なくてよいこともからも迅速且つ簡便であり、また前処理段階の各操作に起因する誤差を排除することができるという利点も有している。
ＨＰＬＣ分析における移動相としては、酸性溶液（ｐＨ２〜６程度）を用いるのがよい。酸性溶液としては、酸性水だけであってもよいし、酸性水に有機溶媒（メタノール、アセトニトリル等）を加えたものであってもよく、酸性水と有機溶媒との体積比率が１００対０〜７０対３０の酸性溶液を用いることができる。移動相として用いる酸性溶液を酸性に調整するには、例えばＴＦＡを用いればよいが、ＴＦＡに限らずリン酸バッファー等の試薬を用いることもできる。
工程（ｃ）において、ＨＰＬＣ分析に用いるカラムとしては、上記移動相を用いたときに、ＡＣＳＯｓを分離できるのであれば如何なる樹脂が充填されたカラムでもよい。具体的には、Ｐｅｇａｓｉｌ ＯＤＳ （センシュウ科学）のようなＯＤＳ樹脂の充填されたＨＰＬＣカラムやＡｑｕａｓｉｌ （センシュウ科学）のような水系シリカゲル樹脂の充填されたＨＰＬＣカラムが挙がられる。但し、ＭｅＣＳＯは側鎖が短いので、ＯＤＳ樹脂への吸着が弱く、保持時間が短くなる。このため、測定したいＡＣＳＯｓの中にＭｅＣＳＯが含まれている場合には、ＯＤＳ樹脂よりも保持力の強い水系シリカゲル樹脂が充填されたＨＰＬＣカラムを用いるのが好ましい。
ＨＰＬＣ分析における検出は、目的とするＡＣＳＯｓがピークとして検出されるのであれば如何なる紫外波長であってもよいが、検出波長は２２０ｎｍ〜２３０ｎｍであるのがよい。より具体的には、検出波長の選択基準としては、例えば、ＰＲＥＮＣＳＯだけを測定すればよい場合には２３０ｎｍを用いるのがよく、ＭｅＣＳＯも測定対象である場合には検出波長を短く設定し、２２０ｎｍを用いるとよい。さらに低波長側であっても測定可能ではあるが、より低波長になるにしたがって、ベースラインが安定するまでに時間がかかったり、炭水化物由来と推定される不要ピークが観察されやすくなり、それらのピークが分析結果に影響を与えやすくなる傾向があることに留意すべきである。
１．ＭｅＣＳＯとＰＲＥＮＣＳＯの精製標品を用いたＨＰＬＣ分析
（１）酸性水（ｐＨ ３．３ ＴＦＡ ｓｏｌ．）の調製
蒸留水２リットルを密栓できる容器に注ぎ、アスピレーターを用いて脱気した。脱気した蒸留水２リットルにＴＦＡ（アミノ酸配列分析用特製試薬 ナカライテスク ３４９０２−１１ １ｍｌアンプル×５本入り）１ｍｌを加え、ストック溶液（ＴＦＡ溶液（Ｘ１０））とした。そのストック溶液を、脱気した蒸留水で１０倍に希釈して、酸性水（ｐＨ ３．３ ＴＦＡ ｓｏｌ．）を調製した。
（１）酸性水（ｐＨ ３．３ ＴＦＡ ｓｏｌ．）の調製
蒸留水２リットルを密栓できる容器に注ぎ、アスピレーターを用いて脱気した。脱気した蒸留水２リットルにＴＦＡ（アミノ酸配列分析用特製試薬 ナカライテスク ３４９０２−１１ １ｍｌアンプル×５本入り）１ｍｌを加え、ストック溶液（ＴＦＡ溶液（Ｘ１０））とした。そのストック溶液を、脱気した蒸留水で１０倍に希釈して、酸性水（ｐＨ ３．３ ＴＦＡ ｓｏｌ．）を調製した。
（２）ＨＰＬＣ分析
ラッキョウから精製したＭｅＣＳＯと、タマネギから精製したＰＲＥＮＣＳＯの両方を含む試料溶液を調製した。ＨＰＬＣ用カラム（Ａｑｕａｓｉ ４．６ｍｍφ×２５ｃｍセンシュー科学）をＳｈｉｍａｄｚｕ １０−ＡＤ ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍに接続し、酸性水（ｐＨ ３．３ ＴＦＡ ｓｏｌ．）を移動相として、３０分以上送液してベースラインを安定させてから、上記試料溶液１μｌ〜５μｌをＨＰＬＣに注入した。尚、ＨＰＬＣ条件は、流速０．６ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長２２０ｎｍ、カラム温度３５℃とした。
この結果、図１に示すＨＰＬＣチャートが得られた。ＭｅＣＳＯとＰＲＥＮＣＳＯの夫々を単独で含む試料溶液を注入した時の保持時間データと照らし合わせ、先に出てくるのがＭｅＣＳＯ（Ｍ）で、後に出てくるのがＰＲＥＮＣＳＯ（Ｐ）と特定した。ここで、ＭｅＣＳＯとＰＲＥＮＣＳＯは、共に充分カラムに保持されており且つ両化合物の保持時間の差が約３ｍｉｎあることから、両化合物の一斉分析が可能であった。
ラッキョウから精製したＭｅＣＳＯと、タマネギから精製したＰＲＥＮＣＳＯの両方を含む試料溶液を調製した。ＨＰＬＣ用カラム（Ａｑｕａｓｉ ４．６ｍｍφ×２５ｃｍセンシュー科学）をＳｈｉｍａｄｚｕ １０−ＡＤ ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍに接続し、酸性水（ｐＨ ３．３ ＴＦＡ ｓｏｌ．）を移動相として、３０分以上送液してベースラインを安定させてから、上記試料溶液１μｌ〜５μｌをＨＰＬＣに注入した。尚、ＨＰＬＣ条件は、流速０．６ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長２２０ｎｍ、カラム温度３５℃とした。
この結果、図１に示すＨＰＬＣチャートが得られた。ＭｅＣＳＯとＰＲＥＮＣＳＯの夫々を単独で含む試料溶液を注入した時の保持時間データと照らし合わせ、先に出てくるのがＭｅＣＳＯ（Ｍ）で、後に出てくるのがＰＲＥＮＣＳＯ（Ｐ）と特定した。ここで、ＭｅＣＳＯとＰＲＥＮＣＳＯは、共に充分カラムに保持されており且つ両化合物の保持時間の差が約３ｍｉｎあることから、両化合物の一斉分析が可能であった。
（３）定量性データ
ラッキョウから精製したＭｅＣＳＯと、タマネギから精製したＰＲＥＮＣＳＯとを、２ｍｇ／ｍｌ、０．６６７ｍｇ／ｍｌ、０．２２２ｍｇ／ｍｌ、０．０７４ｍｇ／ｍｌ、０．０２５ｍｇ／ｍｌ含む溶液を調製し、前記（２）と同じ条件でＨＰＬＣ分析を行った。それぞれの混合標品の分析結果（２２０ｎｍでの検出ピーク面積）とそれぞれの化合物の量（μｇ）の関係を図２に示す。両化合物とも、回帰直線のＲ２値が０．９９９９（ＰＲＥＮＣＳＯ）、１（ＭｅＣＳＯ）という高い直線性を示し、定量性があった。上記濃度範囲は、タマネギのＰＲＥＮＣＳＯ含量から見積もっており、実際のネギ属植物の分析時で得られるデータをカバーできると考えられる。
ラッキョウから精製したＭｅＣＳＯと、タマネギから精製したＰＲＥＮＣＳＯとを、２ｍｇ／ｍｌ、０．６６７ｍｇ／ｍｌ、０．２２２ｍｇ／ｍｌ、０．０７４ｍｇ／ｍｌ、０．０２５ｍｇ／ｍｌ含む溶液を調製し、前記（２）と同じ条件でＨＰＬＣ分析を行った。それぞれの混合標品の分析結果（２２０ｎｍでの検出ピーク面積）とそれぞれの化合物の量（μｇ）の関係を図２に示す。両化合物とも、回帰直線のＲ２値が０．９９９９（ＰＲＥＮＣＳＯ）、１（ＭｅＣＳＯ）という高い直線性を示し、定量性があった。上記濃度範囲は、タマネギのＰＲＥＮＣＳＯ含量から見積もっており、実際のネギ属植物の分析時で得られるデータをカバーできると考えられる。
２．タマネギ中のＰＲＥＮＣＳＯ含有量の測定
市販のタマネギ１、２の茶色の皮を剥き、縦半分に切って重さを量った。半球をラップに包んで電子レンジ加熱した（６５０Ｗ×５分間）。家庭用電動ミキサーに加熱処理した半球を入れ、さらに、その半球と同重量の蒸留水を加えて１０秒間破砕した。このタマネギ破砕液を１００００ｒｐｍ×１０分、２５℃の条件で遠心分離し、遠心上清を取り、その体積を記録した。遠心上清液を新しいエッペンドルフチューブに１ｍｌ量り取って、１５０００ｒｐｍ×５ｍｉｎの遠心分離を行い、その遠心上清を試料液とした。得られた試料液を用い、ＨＰＬＣ用カラム（Ｐｅｇａｓｉｌ ＯＤＳ ４．６ｍｍφ×２５ｃｍセンシュー科学）を用いること及び検出波長が２３０ｎｍであること以外は前記（２）と同じ条件でＨＰＬＣ分析を行い、その結果を表１に示す。表１に示すように、市販のタマネギ１中におけるＰＲＥＮＣＳＯの含有量は１ｇ当たり０．５６２ｍｇであり、市販のタマネギ２中におけるＰＲＥＮＣＳＯの含有量は１ｇ当たり０．５２５ｍｇであった。
市販のタマネギ１、２の茶色の皮を剥き、縦半分に切って重さを量った。半球をラップに包んで電子レンジ加熱した（６５０Ｗ×５分間）。家庭用電動ミキサーに加熱処理した半球を入れ、さらに、その半球と同重量の蒸留水を加えて１０秒間破砕した。このタマネギ破砕液を１００００ｒｐｍ×１０分、２５℃の条件で遠心分離し、遠心上清を取り、その体積を記録した。遠心上清液を新しいエッペンドルフチューブに１ｍｌ量り取って、１５０００ｒｐｍ×５ｍｉｎの遠心分離を行い、その遠心上清を試料液とした。得られた試料液を用い、ＨＰＬＣ用カラム（Ｐｅｇａｓｉｌ ＯＤＳ ４．６ｍｍφ×２５ｃｍセンシュー科学）を用いること及び検出波長が２３０ｎｍであること以外は前記（２）と同じ条件でＨＰＬＣ分析を行い、その結果を表１に示す。表１に示すように、市販のタマネギ１中におけるＰＲＥＮＣＳＯの含有量は１ｇ当たり０．５６２ｍｇであり、市販のタマネギ２中におけるＰＲＥＮＣＳＯの含有量は１ｇ当たり０．５２５ｍｇであった。
３．ネギ中のＭｅＣＳＯ及びＰＲＥＮＣＳＯ含有量の測定
高知県産の細いネギ（以下、細いネギ）と、産地不明の太いネギ（以下、太いネギ）の２種類のネギを生鮮スーパーで購入し、細いネギは１本全量（６．２ｇ）、太いネギは緑色と白色の境目付近の５ｃｍほど（１０．７ｇ）を手早くラップで包んだ。ラップで包んだネギを直ちに電子レンジで加熱した（６５０Ｗ ｘ ２ｍｉｎ）。電子レンジで加熱したネギを乳鉢に入れ、加熱による蒸散のために失った量（Ｙｇ）と加熱前の重量（Ｘｇ）を合わせた重さの蒸留水を加えた後、乳棒を用いて細かくすり潰して破砕した（約１０ｍｉｎ）。得られた破砕液を５０ｍｌ容ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｒｅｎｅ遠沈管（Ｆａｌｃｏｎ ２０７０）に移し、４，０００ｒｐｍ×１０ｍｉｎ．室温で遠心分離を行って沈殿物を取り除き、得られたネギ破砕液の遠心上清液を回収し、体積を記録した。尚、この遠心上清は別の容器に取って冷凍保存が可能だった。
高知県産の細いネギ（以下、細いネギ）と、産地不明の太いネギ（以下、太いネギ）の２種類のネギを生鮮スーパーで購入し、細いネギは１本全量（６．２ｇ）、太いネギは緑色と白色の境目付近の５ｃｍほど（１０．７ｇ）を手早くラップで包んだ。ラップで包んだネギを直ちに電子レンジで加熱した（６５０Ｗ ｘ ２ｍｉｎ）。電子レンジで加熱したネギを乳鉢に入れ、加熱による蒸散のために失った量（Ｙｇ）と加熱前の重量（Ｘｇ）を合わせた重さの蒸留水を加えた後、乳棒を用いて細かくすり潰して破砕した（約１０ｍｉｎ）。得られた破砕液を５０ｍｌ容ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｒｅｎｅ遠沈管（Ｆａｌｃｏｎ ２０７０）に移し、４，０００ｒｐｍ×１０ｍｉｎ．室温で遠心分離を行って沈殿物を取り除き、得られたネギ破砕液の遠心上清液を回収し、体積を記録した。尚、この遠心上清は別の容器に取って冷凍保存が可能だった。
次に、体積を記録した遠心上清液から１ｍｌを新しいエッペンドルフチューブに分取し、そのエッペンドルフチューブをさらに１５０００ｒｐｍ×２ｍｉｎの遠心分離に供し、低速遠心では除去できなかった浮遊物を取り除いた。遠心後のエッペンドルフチューブから沈殿を取らないようにして、上清を別のエッペンドルフチューブに移して試料液とした。こうして調製した試料液を前記（２）に記載のＨＰＬＣ条件で分析に供した時のＨＰＬＣチャートを図３に示す。
図３に示すＨＰＬＣチャートに現れたピークのうち、標品（ＭｅＣＳＯ、ＰＲＥＮＣＳＯ）のＨＰＬＣ保持時間と一致するピーク、或いは、ネギ試料と標品を混合してＨＰＬＣ分析した時、大きくなるピークという２点からＭｅＣＳＯピーク、ＰＲＥＮＣＳＯピークを特定した。それらのピーク面積を両化合物の検量線から得られた回帰直線の式に代入し、ＭｅＣＳＯ、ＰＲＥＮＣＳＯの夫々の含有量を算出した結果を表２に示す。表２に示すように、細いネギ中におけるＭｅＣＳＯの含有量は１ｇ当たり０．０８４ｍｇであり、太いネギ２中におけるＭｅＣＳＯの含有量は１ｇ当たり０．２２６ｍｇであった。また、細いネギ中におけるＰＲＥＮＣＳＯの含有量は１ｇ当たり０．４８６ｍｇであり、太いネギ２中におけるＰＲＥＮＣＳＯの含有量は１ｇ当たり０．９２５ｍｇであった。
４．マイクロ波による加熱条件の設定例
市販のタマネギ１球を縦に凡そ同じぐらいの重量になるように４つに切り分け、夫々１／４の重量を測定した（６６．７ｇ〜７３．１ｇ）。一つずつ別々にラップで包んでから、６５０Ｗ出力の電子レンジを用いて、それぞれ１分、２分、３分、５分加熱した。加熱後のタマネギ片（約１／４球）をそれぞれ別々に等重量の蒸留水を加えてから、家庭用電動ミキサーで１０−２０秒間破砕した。このようにして調製した加熱時間の異なるタマネギ破砕液を１００００ｒｐｍ×１０分、２５℃の条件で遠心分離し、それぞれの遠心上清を取り、それぞれの体積を記録した。遠心上清液を新しいエッペンドルフチューブに１ｍｌ量り取って、１５０００ｒｐｍ×５ｍｉｎの遠心分離を行い、その遠心上清をＡＣＳＯｓ分析試料液とした。
市販のタマネギ１球を縦に凡そ同じぐらいの重量になるように４つに切り分け、夫々１／４の重量を測定した（６６．７ｇ〜７３．１ｇ）。一つずつ別々にラップで包んでから、６５０Ｗ出力の電子レンジを用いて、それぞれ１分、２分、３分、５分加熱した。加熱後のタマネギ片（約１／４球）をそれぞれ別々に等重量の蒸留水を加えてから、家庭用電動ミキサーで１０−２０秒間破砕した。このようにして調製した加熱時間の異なるタマネギ破砕液を１００００ｒｐｍ×１０分、２５℃の条件で遠心分離し、それぞれの遠心上清を取り、それぞれの体積を記録した。遠心上清液を新しいエッペンドルフチューブに１ｍｌ量り取って、１５０００ｒｐｍ×５ｍｉｎの遠心分離を行い、その遠心上清をＡＣＳＯｓ分析試料液とした。
得られた試料液を前記同様のＨＰＬＣ条件（Ｐｅｇａｓｉｌ ＯＤＳカラム、２３０ｎｍ検出）で分析に供した。その結果、電子レンジによる加熱時間とＰＲＥＮＣＳＯ測定値（タマネギ１ｇあたりのＰＲＥＮＣＳＯ量（ｍｇ））の関係を図４に示す。図４に示すように、６５０Ｗ出力の電子レンジを用いる場合、タマネギ６５ｇ〜７５ｇ当たり２分以上が好ましく、より好ましくは３分から５分程度であった。尚、タマネギの場合は、マイクロ波による加熱が不十分であるときは組織破砕後に催涙性が感じられることから判断することもできる。
５．移動相として酸性水に有機溶媒を加えた液体を用いた場合のＨＰＬＣ分析
ＭｅＣＳＯ、ａｌｌｉｉｎ及びＰＲＥＮＣＳＯの標準物質を夫々０．５ｍｇ／ｍｌ濃度ずつ含むように調整した混合標準試料液を用い、移動相として表３に示す体積比で有機溶媒（メタノール、アセトニトリル）を加えた酸性水を用いてＨＰＬＣ分析を行い、ＭｅＣＳＯ、ａｌｌｉｉｎ及びＰＲＥＮＣＳＯのリテンションタイムを表３に示す。尚、ここでのＨＰＬＣ条件は、Ａｑｕａｓｉｌカラム、検出波長が２２０ｎｍであった。
ＭｅＣＳＯ、ａｌｌｉｉｎ及びＰＲＥＮＣＳＯの標準物質を夫々０．５ｍｇ／ｍｌ濃度ずつ含むように調整した混合標準試料液を用い、移動相として表３に示す体積比で有機溶媒（メタノール、アセトニトリル）を加えた酸性水を用いてＨＰＬＣ分析を行い、ＭｅＣＳＯ、ａｌｌｉｉｎ及びＰＲＥＮＣＳＯのリテンションタイムを表３に示す。尚、ここでのＨＰＬＣ条件は、Ａｑｕａｓｉｌカラム、検出波長が２２０ｎｍであった。
表３に示すように、酸性水と有機溶媒との体積比率が９５対５の液体を用いた場合には、ＭｅＣＳＯとＰＲＥＮＣＳＯのリテンションタイムが十分に離れているので、両者の一斉分析が可能である。他方、酸性水と有機溶媒との体積比率が８５対１５の液体、７０対３０の液体を用いた場合には、ａｌｌｉｉｎとＰＲＥＮＣＳＯのリテンションタイムが同じでありこれらの一斉分析には適していないが、例えばタマネギ中のＡＣＳＯｓの含有量を測定する場合には、タマネギはＡＣＳＯｓとしては殆どPRENCSOしか含んでいないため、酸性水と有機溶媒との体積比率が８５対１５の液体、７０対３０の液体を用いることも可能である。
６．移動層としてpHの異なる酸性溶液を用いた場合のＨＰＬＣ分析
ＭｅＣＳＯ、ａｌｌｉｉｎ及びＰＲＥＮＣＳＯの標準物質を夫々０．５ｍｇ／ｍｌ濃度ずつ含むように調整した混合標準試料液を用い、移動相として表４に示す酸性溶液を用いてＨＰＬＣ分析を行い、ＭｅＣＳＯ、ａｌｌｉｉｎ及びＰＲＥＮＣＳＯのリテンションタイムを表４に示す。尚、ここでのＨＰＬＣ条件は、Ａｑｕａｓｉｌカラム、検出波長が２２０ｎｍであった。
ＭｅＣＳＯ、ａｌｌｉｉｎ及びＰＲＥＮＣＳＯの標準物質を夫々０．５ｍｇ／ｍｌ濃度ずつ含むように調整した混合標準試料液を用い、移動相として表４に示す酸性溶液を用いてＨＰＬＣ分析を行い、ＭｅＣＳＯ、ａｌｌｉｉｎ及びＰＲＥＮＣＳＯのリテンションタイムを表４に示す。尚、ここでのＨＰＬＣ条件は、Ａｑｕａｓｉｌカラム、検出波長が２２０ｎｍであった。
表４に示すように、ｐＨ２．４〜ｐＨ５．８までの間では、ｐＨの違いによる影響は小さく、移動相としていずれのｐＨの酸性溶液を用いても、ＭｅＣＳＯ、ａｌｌｉｉｎ、ＰＲＥＮＣＳＯの分離は良好だった。
Claims (4)
- タマネギ又はネギ中におけるＰＲＥＮＣＳＯの含有量を測定する方法であって、
（ａ）タマネギ又はネギを砕くことなくマイクロ波により加熱して該タマネギ又はネギ細胞内の酵素ａｌｌｉｉｎａｓｅを失活させる工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）で酵素ａｌｌｉｉｎａｓｅを失活させたタマネギ又はネギを砕いて試料液を調製する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）で得られた試料液を前処理を行うことなく用いて、ＨＰＬＣ分析によりＰＲＥＮＣＳＯの含有量を測定する工程とを含むことを特徴とするタマネギ又はネギ中におけるＰＲＥＮＣＳＯの測定方法。 - 前記工程（ｂ）で、前記工程（ａ）で酵素ａｌｌｉｉｎａｓｅを失活させたタマネギ又はネギに蒸留水を添加し且つ砕いて試料液を調製する、請求項１に記載の測定方法。
- 前記工程（ｃ）で、ＨＰＬＣ分析における移動相として酸性溶液を用いる、請求項１又は２に記載の測定方法。
- 前記工程（ｃ）で、ＨＰＬＣ分析における検出波長が２２０ｎｍ〜２３０ｎｍである、請求項１〜３の何れか１項に記載の測定方法。
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