KR19990076740A - 식물체 수분함량 조절 방법 - Google Patents

식물체 수분함량 조절 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR19990076740A
KR19990076740A KR1019980704862A KR19980704862A KR19990076740A KR 19990076740 A KR19990076740 A KR 19990076740A KR 1019980704862 A KR1019980704862 A KR 1019980704862A KR 19980704862 A KR19980704862 A KR 19980704862A KR 19990076740 A KR19990076740 A KR 19990076740A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
plant
channel protein
protein gene
gene
derived
Prior art date
Application number
KR1019980704862A
Other languages
English (en)
Inventor
시게히로 야마다
Original Assignee
미즈노 마사루
니뽄 다바코 산교 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 미즈노 마사루, 니뽄 다바코 산교 가부시키가이샤 filed Critical 미즈노 마사루
Publication of KR19990076740A publication Critical patent/KR19990076740A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 건조스트레스에 내성을 가진 식물을 제공하기 위한 식물의 수분함량을 조절하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 식물의 수채널 단백질을 코드하는 유전자를 건조스트레스에 대하여 내성으로 하여야 할 식물에 기능가능하게 도입하는 것을 특징으로 한다.

Description

식물체 수분함량 조절 방법
식물은 통상의 육성환경하에 있어서도 항상 스트레스를 받고 있다. 이와같은 스트레스에는 염(鹽), 건조, 고온, 저온, 감광(減光), 공기오염등의 여러 가지의 것이 포함된다. 농업생산의 관점에서 가장 문제로 되고 있는 것은 염해(鹽害)나 건조에 의한 스트레스이다. 염해는 원래 염분이 많은 지역뿐 아니라 그때까지 문제가 없었던 농지에서도 관수를 함으로써 염해가 발생하여 문제가 되고 있다. 현재, 전체 경지의 10% 이상이 어떠한 염해를 받고 있다고 하고 있다. 또 인구증가에 따라 식량생산증가를 하는데는 현재까지는 경작 부적당 토양으로 되어 있는 토지에서의 농업생산이 필요하게 된다는 견해도 있다.
건조 스트레스는 일기 불순이나 지리적인 위치에 의해 생긴다. 미국에서는 수년마다 가뭄 때문에 농업물 생산고의 저하가 일어나고 있다.
따라서 이와같은 수분 스트레스에 내성을 가진 식물을 찾아내는 것은 장래 일어날 수 있다고 생각되는 식량위기 등을 고려하면 대단히 중요한 일이다.
한편 "식물의 수이동(水移動)"에 관계하고 있다고 생각하고 있는 단백질로서 수(水)채널 단백질(이하, WCH 단백질이라 하는 경우가 있다.)이 알려져 있다.
이와같은 식물의 WCH 단백질에는 세포막 국재형(細胞膜局在型) WCH 단백질과 액포막 국재형(液胞膜局在型) WCH 단백질이 있으며, 이들 단백질의 유전자에 대하여는 이미 몇가지의 보고예가 있다.
세포막 국재형 WCH 단백질의 유전자의 보고예로서는 완두콩 유래의 건조유도성 WCH 단백질의 cDNA 클로닝(Plant Molecular Biology 15, 11-26(1990)), 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래의 건조유도성 WCH 단백질의 cDNA 클로닝(Plant Cell Physiology 33, 217-224), 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래의 것(The Planturnal 6, 187-199(1994)), 토마토 유래의 것(Plant Molecular Biology, 24, 539-543(1994)), 애기장대(Arabidopsis thaliana)에 안티센스(antisense) 유전자를 도입하여 수채널로서의 기능을 증명한 것(The Plant Journal 7, 87-95(1995)), 솔잎채송화(Mesembryanthemum crystallinum) 유래의 것(The Plant Cell 7, 1129-1142(1995)) 등을 들 수 있으며, 그외 유전자 데이터베이스 등에 등록되어 있는 것으로서, 옥수수, 벼, 브라씨카 오레라세아(Brassica oleracea), 콩, 보리 등을 들 수 있다.
액포막 국재형 WCH 단백질의 유전자의 보고예로서는 담배유래의 것(Nucleic Acids Research 18, 7449(1990)), 강남콩 유래의 것(The Plant Cell 2, 525-532(1990)), 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래의 것(Plant Physiology 99, 561-570(1992))등을 들 수 있으며, 그외 유전자 데이터베이스 등에 등록되어 있는 것으로서 벼, 보리, 콩, 라파너스 사티바(Raphanus sativa), 클로버(Triforium repens), 자주개자리(Medicago sativa) 등을 들 수 있다.
상술한 바와 같이, 수분 스트레스에 대하여 내성을 가진 식물을 찾아내는 것은 긴급한 과제이지만, 이와 같은 수분 스트레스 내성을 가진 식물을 얻는 방법의 하나로서 유전자조작 등에 의해 식물의 수분함량을 조절하는 것에 의한 방법이 있다. 일반적으로 식물체의 수분함량을 증가시키므로써 즉, 식물의 수분유지능력을 증가시킴으로써 수분 스트레스 내성을 가진 식물을 얻을 수가 있다고 생각되고 있다.
이와같은 방법으로 수분 스트레스 내성식물을 얻는 방법으로서 트레할로스(trehalose)를 생합성하는 효소의 유전자를 식물체에 도입하여 식물체내에서 합성, 축적시켜 트레할로스가 가진 보수기능에 의해 수분손실을 막고, 식물체의 수분함량을 조절하여 수분 스트레스 내성을 가진 식물을 얻는 방법이 개시되어 있다(WO96/00789호 공보 및 Nature 379(22) 683-684(1996) 참조 : 개시내용은 본 명세서중에 원용한다).
그러나 이 방법에서는 광합성에 의해 고정된 탄소를 소비하지 않으면 안되고 에너지적으로 불리하며 또 트레할로스의 축적에 의해 생산물의 품질이나 대사계에 대한 예기치 않은 영향이 일어날 가능성이 있는 등의 여러 가지의 문제점이 있다.
한편 상술한 WCH 단백질이 식물체의 수이동에 관계하고 있다는 것은 예상하고 있으나, 이들 단백질을 사용하여 식물체의 수분함량을 조절할 수 있다고 하는 아이디어는 아직 제안되어 있지 않다.
발명의 개요
본 발명은 상기 실정을 감안하여 이루어진 것으로서, 식물 WCH 단백질 유전자를 식물에 도입하여 그 식물의 수분함량을 조절하는 방법을 제공한다.
본 발명은 더욱 상기 방법으로 제조된 수분함량이 조절된 식물을 제공한다.
본 발명은 또 수분함량에 의해 수분 스트레스 및/또는 염분 스트레스 내성이 높아진 식물을 제공한다.
발명의 상세한 설명
이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명은 식물에 식물 WCH 단백질 유전자를 도입하여, 도입된 형질전환식물의 수분함량을 조절하는 것을 특징으로 하는 것이다.
본 발명에 사용되는 식물 WCH 단백질에는 식물세포막 국재형의 것과 식물액포막 국재형의 것이 있다. 본 발명에서는 상기 두가지 중 어느 단백질을 코드하는 유전자나 모두 사용하는 것이 가능하지만, 식물세포막 국재형 WCH 단백질을 코드하는 유전자를 사용하는 것이 바람직하다.
이와같은 식물세포막 국재형 WCH 단백질을 코드하는 유전자로서는 상술한 바와 같이 완두콩, 애기장대(Arabidopsis thaliana), 토마토, 솔잎채송화(Mesembryanthemum crystallinum), 옥수수, 벼, 브라씨카 오레라세아, 콩, 보리 유래의 것 등 여러 가지의 것이 알려져 있으며, 본 발명에서는 이들 공지의 유전자를 사용하는 것도 가능하지만, 식물세포막 국재형 WCH 단백질을 코드하는 유전자이면 특별히 한정되는 것은 아니다.
이와같은 식물세포막 국재형 WCH 단백질유전자를 얻는 방법으로서는 예를들면 솔잎채송화(Mesembryanthemum crystallinum) 유래의 것을 얻는 방법에 대하여는 후술의 실시예에 기재되어 있다. 또 다른 식물 유래의 유전자를 얻기 위한 방법으로서는 이하의 문헌을 참조함으로써 얻어진다.
(1) 완두콩(Pisum sativum)(Plant Molecular Biology 15, 11-26(1990))
(2) 애기장대(Arabidopsis thaliana) (Plant Cell Physiology 33, 217-224(1992), Plant Molecular Biology 23, 1187-1198(1993), The Plant Journal 6, 187-199(1994))
(3) 토마토(Plant Molecular Biology 24, 539-543(1994))
본 발명에 사용되는 식물 WCH 단백질을 코드하는 유전자는 식물체에 센스방향으로 도입되어도 되고, 또 안티센스 방향으로 도입되어도 좋다.
본 발명에 있어서는 수분 스트레스 조건하에서 식물의 수분유지 능력을 증대시키는 목적의 경우에는 센스방향으로 도입하는 것이 바람직하나, 스트레스의 강도, 시기 혹은 성질에 따라서는 식물의 수이동을 억제함으로써 영향을 저감할 수 있는 경우도 있으며 이와같은 경우는 안티센스 방향으로 도입하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 식물 WCH 단백질을 코드하는 유전자를 센스방향으로 도입하는 경우의 도입하는 유전자로서는 염 스트레스 내성 혹은 건조 스트레스 내성의 식물유래의 것이 바람직하며, 특히 바람직하기는 솔잎채송화(Mesembryanthemum crystallinum) 유래의 것이다.
한편, 유전자를 안티센스 방향으로 도입하는 경우는 형질전환식물을 만들어내려고 하는 종(種)과 도입하는 유전자가 유래된 종이 근연(近緣)일수록 바람직하며, 특히 바람직하기는 동종의 것이다. 또 안티센스방향으로 도입하는 경우는 반드시 유전자 전체를 도입할 필요는 없고, 일부를 사용한 경우라도 충분한 효과가 나타날 경우도 있다. 따라서 본 발명에서 유전자를 안티센스 방향으로 도입하는 경우는 적어도 그 일부분을 사용하는 것을 필요로 하는 것이다.
본 발명에 사용되는 발현 프로모터로서는 전사력이 강하고 모든 세포에서 발현되는 것(35S, 19S, nos 등), 빛에 반응하는 것(rbc 등), 온도에 반응하는 것(hsp 등), 호르몬에 반응하는 것, 그리고 조직특이적으로 반응하는 것 등 종래부터 알려져 있는 것이라면 특별히 한정하지 않으나, 특히 바람직하기는 35S 프로모터 등의 강력한 프로모터를 들 수 있다.
본 발명에서 센스방향 혹은 안티센스 방향으로 WCH 단백질 유전자를 형질전환하는 식물에 도입하는 방법은 특별한 방법을 사용할 필요는 없고, 통상 식물을 형질전환할 때 사용하는 방법이면 어떠한 방법이라도 사용할 수가 있다. 일예로서 아그로박테리움속 균을 사용한 잎 디스크법을 사용한 경우에 대하여 설명한다.
센스방향 혹은 안티센스 방향으로 WCH 단백질 유전자를 적당한 식물 발현벡터에 삽입하여 이 벡터를 아그로박테리움속 균에 도입한다. 다음에 형질전환하고자하는 식물의 무균엽(無菌葉)에서 채취한 잎 디스크를 상기의 아그로박테리움균을 함유하는 배양액에 담군후 가골(calluses)을 형성시켜 형질전환이 일어난 것을 선발함으로써 형질전환식물을 얻을 수가 있다. 형질전환식물의 선발은 예를들면 가골을 형성시키는 배지에 적당한 항생물질을 첨가하여 그 내성을 가진 가골을 선발함으로써 행할 수가 있다. 또 아그로박테리움 균속에 의한 형질전환방법은 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽식물에도 적용할 수가 있다(본 명세서 중에서 참고문헌으로 원용하는 WO94/00977호 공보).
본 발명에 의해 형질전환되는 식물종 즉, 본 발명에 의해 식물체의 수분함량이 조절되는 식물로서는 특별히 한정하는 것은 아니나, 콩, 옥수수, 감자, 토마토 및 담배 등을 들 수 있으며, 그 중에서도 콩, 옥수수가 바람직하다.
본 발명에서 형질전환된 식물의 수분함량의 증가를 측정하는 방법으로서는 여러 가지의 방법을 생각할 수 있다. 그 한 방법으로서는 예를들면 소정의 크기까지 육성한 식물을 인공기상기(人工氣象機)등에 의해 스트레스환경하에서 일정기간 육성한다. 그리고 식물체의 지상부(地上部)를 수확하여 생중량을 측정하고 또 이들 식물을 60℃에서 수일간 건조시킨 후에 건조중량을 측정한다. 이 생중량과 건조중량의 비에 의해 수분함량을 측정할 수가 있다.
본 발명을 보다 상세히 설명하기 위하여 이하의 실시예를 기재하나, 본 발명은 그들에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1 : 솔잎채송화(Mesembryanthemum crystallinum) 유래의 세포막국재형 WCH 단백질 유전자의 분리
솔잎채송화(Mesembryanthemum crystallinum) 뿌리조직에서 추출한 전체 RNA 분획은 오스트렘 등의 방법(Ostrem et al., Plant Physiology 84, 1270-1275(1987)에 따라 행하였으나, 실시에 있어서 이하의 점을 개량하였다.
1) 400mM NaCl에 의해 염스트레스 처리를 한 식물체에서 전체 RNA를 추출하였다.
2) 마쇄한 식물체를 추출용 완충액과 페놀과 함께 얼음상에서 1시간 진탕 하였다.
3) 원심후의 상등액을 클로로포름과 함께 얼음상에서 1시간 진탕하였다.
폴리(A)+RNA의 정제는 올리고 dT 셀롤로오스 칼럼(oligo dT cellulose column)법에 의해 행하였다. WCH 단백질 유전자는 정제한 폴리(A)+RNA를 이용하여 ZAP-cDNA 합성 키트(ZAP-cDNA synthesis kit)에 의해 제조자의 설명서에 따라 작성한 cDNA 라이브러리의 디퍼렌셜 스크리닝을 행함으로써 얻었다. 디퍼렌셜 스크리닝에는 상기 폴리(A)+RNA로부터 합성한 단일 체인 DNA와, 염스트레스 처리를 하지 않은 식물에서 같은 방법으로 분리, 정제한 폴리(A)+RNA로부터 합성한 단일 체인 DNA의 2종류의 단일 체인 DNA를 프로우브로서 사용하였다. 이것에 의해 제한효소부위 EcoRⅠ/XhoⅠ에 솔잎채송화(Mesembryanthemum crystallinum) 유래의 WCH 단백질 유전자 McMipA를 함유하는 플라스미드 pBSK(STRATAGENE 사제)를 얻었다. 이 솔잎채송화(Mesembryanthemum crystallinum) 유래의 세포막 국재형 WCH 단백질을 코드하는 유전자의 배열을 배열번호 1로, 예상되는 아미노산 배열을 배열번호 2로 나타낸다. 배열번호 1에서 리딩프레임은 225-227번 위치의 개시 코돈(ATG)에서 1068-1070번 위치의 종료코돈까지의 범위이다. 디퍼렌셜 스크리닝의 상세한 내용은 "수채널 단백질을 코드하는 전사산물 패밀리 : 솔잎채송화에서의 조직특이적 발현" (Shigehiro Yamada, Maki Katsuhar a. Walter B. Kelly, Cristine B. Michalowski, and Hans J. Bohnert, The Plant Cell 7, 1129-1142, 1995)에 기재되어 있다.
실시예 2. 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)을 형질전환하기 위한 도입유전자의 구성
실시예 1에서 얻은, 제한효소부위 EcoRⅠ/XhoⅠ에 솔잎채송화 유래의 WCH 단백질 유전자 McMipA를 함유하는 플라스미드(pBSK)를 제한효소(XbaⅠ)로 소화하여 McMipA 유전자 단편을 분리하였다. 이 유전자 단편을 바이너리벡터(pBⅠ121)(Clontech 사제)의 XbaⅠ 부위에 35S 프로모터에 의해 정방향의 mRNA가 전사되는 방향으로 삽입하여 구축 유전자(pBI4C)를 얻었다. pBI 121에 함유되어 있던 베타·글루쿠로니다제(Bata-glueuronidase) 유전자는 제한효소(SmaⅠ)와 (SacⅠ)에 의해 제거하였다.
실시예 3. 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)의 형질변환
시험관내에서 무균적으로 생육한 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)의 녹엽을 1㎝ 각(角) 정도의 크기로 잘라 얻은 조직편을 실시예 2에서 얻은 유전자 pBI4C를 가진 아그로박테리움균(Agrobacterium tumefaciens LBA 4404)을 현탁한 배양액(Murashige and Skoog basal medium with Gamborg's vitamins(시그마 사제))에 담구어 어두운 곳에 2일간 두고 아그로박테리움균(A. tumefaciens)을 감염시켰다. 그후 이 조직편을 항생물질(100㎎/L 카나마이신(Kanamycin), 250㎎/L 세포탁심(cefotaxime)과 식물호르몬(0.5㎎/L 6-벤질 아미노푸린(6-benzylaminopurine))을 함유하는 한천배지(0.8% 한천을 함유하는 상기 배양액)에 이식하여 재분화개체(再分化個體)를 얻었다. 이렇게 하여 얻은 재분화개체의 경엽을 항생물질(100㎎/L 카나마이신(Kanamycin), 250㎎/L 세포탁심(cefotaxime))을 함유하는 상기 한천배지에 이식하여 뿌리가 자라게 하였다. 뿌리가 난 개체를 폐쇄된 온실내에서 화분에 넣어 형질전환체의 자식 후대종자(自殖後代種子)를 얻었다.
실시예 4. 스트레스 조건하에서의 생체 수분함량 변화의 측정
실시예 3에 의해 얻은 형질전환종자를 100㎎/L 카나마이신(Kanamycin)을 함유하는 상기 한천배지상에서 발아시켜 본엽(本葉)이 2매정도 날때까지 생육시켰다. 이 시점에서 백화(白化)되어 있지 않은 식물을 폐쇄 온실내에서 식목화분에 이식하였다. 본엽이 4배정도 날때까지 육성하여 그후 함수규산염과 하이드로볼의 등량혼합물에 이식하였다. 이 상태에서 1/4 농도의 호글랜드(Hoagland) 용액(시그마)을 1일 50㎖ 관수하여 2주간 육성하였다. 그리고 식물을 인공기상기(人工氣象機)(온도 23℃, 습도 70%, 12시간 명기(明氣)/12시간 암기(暗期))로 이동하여 수일간 생육하여 인공기상기내의 환경에 적응시킨 후, 스트레스처리를 하였다. 염스트레스 처리구의 식물에는 250mM NaCl을 함유하는 1/4 농도의 호글랜드(Hoagland) 용액(시그마)을 첫날에 100㎖, 2일째부터 50㎖를 관수하고, 건조스트레스 처리구의 식물은 관수를 정지하였다. 실험기간 종료후 식물체 지상부를 수확하여 생중량을 측정하였다. 그후 이들 식물을 60℃에서 수일간 건조시킨 후에 건조중량을 측정하였다. 이들의 결과를 근거로 스트레스 하에서의 각 식물의 수분함량을 구하였다.
표 1 염스트레스처리
건조중량/생산량 비 율 * 수분함량(%)
대조구 0.1505380 1.000 84.92
개체 No.1 0.1287313 0.854 87.12
개체 No.2 0.1215596 0.808 87.84
* 조절 식물에서의 건조중량/생중량을 계산하여 그 값을 1로 한 경우의 각형질 전환체의 건조중량/생중량의 비율
표 2 건조스트레스처리
건조중량/생산량 비 율 * 수분함량(%)
대조구 0.1602564 1.000 83.97
개체 No.1 0.1274725 0.795 87.25
개체 No.2 0.1349073 0.842 86.51
* 표 1과 같음
표 1 및 2의 결과는 WCH 단백질 유전자로 형질전환된 식물의 수분 함량은 조절 식물에 비하여 유의차 있게 높은 것을 나타내고 있다.
보다 많은 물을 확보하는 능력 또는 보다 많은 수분이용효율을 가진 식물은 가뭄에 대한 저항력이 크다고 생각된다(예를들면, Lincoln Taiz and Eduardo Zeiger, Plant Physiology, Chapter 14 Stress Physiology, The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc.).
또 건조지역 또는 염분이 많은 지역의 모든 생물이 안고 있는 문제는 수분함량의 유지인 것이 알려져 있다(예를들면, Kent F. McCue 등, TIBTECH-December 8, 358-362). 따라서, 식물의 수분 유지능력을 높여 염스트레스 및 건조스트레스에 대한 내성을 주기 위하여 종래는 식물체내에 삼투압보호제(osmoprotectant)를 축적시키는 방법이 주목되고 있었다(상기 Kent F. McCue 등). 트레할로스를 생합성하는 효소의 유전자를 식물체에 도입하는 시도도 그 연장선상이다.
이에 대하여 본 발명은 WCH 단백질 유전자의 이용이라고 하는 전혀 다른 접근으로 식물의 수분유지능력을 높인 점에 특징이 있다. 본 발명에 의해 수분유지능력이 증대된 식물은 염스트레스 및 건조스트레스에 대한 내성이 원래의 식물에 비하여 클 것으로 기대된다.
실시예 5. 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)에서의 세포막 국재형 WCH 단백질 유전자의 분리
니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 녹엽조직에서 추출된 전체 RNA 분획은 오스트렘 등의 방법(Ostrem et al., Plant Physiology 84, 1270-1275(1987))에 따라 하였으나, 실시에 있어 이하의 점을 개량하였다.
1) 마쇄한 식물체를 추출용 완충액과 페놀과 함께 얼음상에서 1시간 진탕을 하였다.
2) 원심후의 상등액을 클로로포름과 함께 얼음상에서 1시간 진탕하였다.
폴리(A)+RNA의 정제는 퀵 프레프 mRNA 정제 키트(QuickPrep mRNA purification Kit(파마시아 사제))를 사용하여 제조자의 설명서에 따라 행하였다.
WCH 단백질을 코드하는 cDNA를 분리하기 위한 프라이머를 실시예 1에 기재되어 있는 솔잎채송화(Mesembryanthemum crystallinum) 유래의 WCH 단백질 cDNA의 염기배열(배열번호 1)을 참고로 하여 DNA 합성장치(Applied Biosystems사제)를 사용하여 제작하였다. 그 배열을 이하에 기재한다.
프라이머 -1 GAAGATCTATGATCTTTGCCCTTGTTTACTGC (배열번호 4)
프라이머 -2 GTCAGATCTAGCACGCGACTTGAATGGAATAGCC (배열번호 5)
역전사 폴리머라제 연쇄반응(RT-PCR)에 사용하는 주형 cDNA의 합성은 스틀라타 스클립트(상표) RT-PCR + 키트(StrataScriptTM, RT-PCR+Kit(STRATAGENE사제))를 사용하여 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)에서 추출 정제한 폴리(A)+RNA 50ng, 프라이머로서 올리고 dT 프라이머를 사용하여 제조자의 설명서에 따라 행하였다.
RT-PCR 반응은 주형으로서 상기 cDNA, 프라이머로서 상기 프라이머-1 및 2를 각 20pmol, dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP를 각 200μmol, 1×PCR 완충액(타카라슈조오 사제), 및 25U 앰플리택(AmpliTag) DNA 폴리머라제(타카라슈조오 사제)를 사용하여 전체 용량 100㎕로 행하였다. 반응은 1분간에 걸쳐 91℃, 1분간에 걸쳐 42℃, 2분간에 걸쳐 72℃의 주기를 32회 반복하였다. PCR 산물을 1% 아가로스겔 상에서 분리하여 에티듐브로마이드로 염색하였더니 약 550bp의 위치에 산물이 검출되었다.
PCR 단편을 겔에서 잘라내어 TA 클로닝 키트(TA Cloning Kit (Invitrogen사제))를 사용하여 제조자의 설명서에 따라 pCRII 플라스미드 중에 서브클로닝하였다.
얻어진 PCR 단편의 염기배열의 결정은 DNA 서열 모델 373A(Applied Biosystems 사제)를 사용하여 반응에는 택 다이 터미네이터 사이클 서열 키트(Tag Dye Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems 사제))를 사용하여 제조자의 설명서에 따라 행하였다. 이 실시예에서 배열번호 3에 나타낸 염기배열을 가진 세포막 국재형 WCH 단백질 유전자의 부분 cDNA 단편을 얻었다.
실시예 6. 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)을 형질전환하는 유전자의 구성
실시예 5에서 얻은 유전자 단편을 사용하여 담배(Nicotiama tabacum)에 도입하는 안티센스 유전자의 구축을 하였다. pCrII 플라스미드 중에 서브클로닝된 PCR 단편을 제한효소(Sacl)와 (Xbal)에 의해 소화하여 정제하였다. 이 단편을 pBI 121플라스미드의 Sacl와 Xbal의 소화에 의해 생긴 부위에 답입하여 구축 유전자(pA 121)를 얻었다.
실시예 7. 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)의 형질전환
실시예 3과 거의 같은 방법을 사용하여 pA 121을 사용하여 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)의 형질전환을 하였다.
본 발명은 식물에 식물 수채널 단백질 유전자를 도입함으로써, 식물체의 수분함량을 조절하는 방법이므로, 광합성에 의해 고정한 탄소를 소비하는 등의 에너지적으로 불리한 면이나, 당류의 축적에 의해 생산물의 품질이나 대사계에 대한 예기치 않은 영향이 생기는 가능성이 있는 등의 문제점이 없이 식물체의 수분함량을 조절하여 수분 스트레스 내성을 가진 식물을 만들어 낼 수가 있다.
배열표
배열번호 : 1
배열의 길이 : 1272 염기
배열의 형 : 핵산
체인의 수 : 이중 체인
형 상 : 직쇄상
분자의 형 : cDNA
기원
생물명 : Mesembryanthemum crystallinum
성질 : 세포막 국재형 수채널 단백질 cDNA
배열
배열번호 : 2
배열의 길이 : 284 아미노산 잔기
배열의 형 : 아미노산
체인의 수 : 단일 체인
형 상 : 직쇄상
분자의 형 : 단백질
기원
생물명 : Mesembryanthemum crystallinum
성질 : 세포막 국재형 수채널 단백질 cDNA
배열
배열번호 : 3
배열의 길이 : 587 염기쌍
배열의 형 : 핵산
체인의 수 : 이중 체인
형 상 : 직쇄상
분자의 형 : cDNA
기원
생물명 : Nicotiana tabacum
성질 : 세포막 국재형 수채널 단백질 cDNA
배열
배열번호 : 4
배열의 길이 : 32 염기쌍
배열의 형 : 핵산
체인의 수 : 단일 체인
형 상 : 직쇄상
배열
GTCAGATCTA GCACGCGACT TGAATGGAAT AGCC 34
배열번호 : 5
배열의 길이 : 34 염기쌍
배열의 형 : 핵산
체인의 수 : 단일 체인
형 상 : 직쇄상
배열
GTCAGATCTA GCACGCGACT TGAATGGAAT AGCC 34
본 출원은 1996년 10월 24일 미국특허청에 출원된 US SN 08/736,287호의 일부계속출원이다. 본 발명은 염 스트레스 혹은 건조 스트레스 등의 수분 스트레스에 내성을 가진 식물 및 그와 같은 식물을 얻기 위한 식물체내의 수분을 조절하는 기술에 관한 것이다.

Claims (11)

  1. 식물에 식물 수채널 단백질을 코드하는 유전자를 기능 가능하도록 도입하는 것을 특징으로 하는 식물체 수분함량을 조절하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 식물 수채널 단백질 유전자가 식물세포막 국재형인 것을 특징으로 하는 식물체 수분함량을 조절하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 식물 수채널 단백질 유전자의 식물로의 도입이 센스방향의 도입인 것을 특징으로 하는 식물체 수분함량을 조절하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 식물 수채널 단백질 유전자가 염스트레스 내성 식물 또는 건조스트레스 내성 식물 유래인 것을 특징으로 하는 식물체 수분함량을 조절하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 식물 수채널 단백질 유전자가 솔잎채송화(Mesembryanthemum crystallinum) 유래인 것을 특징으로 하는 식물체 수분함량을 조절하는 방법.
  6. 식물 수채널 단백질 유전자를 기능 가능하도록 도입하여, 그 유전자를 도입하지 않은 원래의 식물에 비하여 동일 생육조건하에서 생육했을 때 식물체내의 수분함량이 증가 또는 저하되도록 한 식물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 식물 수채널 단백질 유전자가 식물세포막 국재형인 것을 특징으로 하는 식물.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 식물 수채널 단백질 유전자가 센스방향으로 도입된 것을 특징으로 하는 식물.
  9. 제8항에 있어서, 식물 수채널 단백질 유전자가 염스트레스 내성 식물 또는 건조스트레스 내성 식물 유래인 것을 특징으로 하는 식물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 식물 수채널 단백질 유전자가 솔잎채송화(Mesembryanthemum crystallinum) 유래인 것을 특징으로 하는 식물.
  11. 제10항에 있어서, 콩, 옥수수, 감자, 토마토 및 담배로 이루어지는 그룹에서 선택되는 식물.
KR1019980704862A 1996-10-24 1997-10-23 식물체 수분함량 조절 방법 KR19990076740A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US73628796A 1996-10-24 1996-10-24
US8/736,287 1996-10-24
PCT/JP1997/003828 WO1998017803A1 (fr) 1996-10-24 1997-10-23 Procede pour controler la teneur en eau d'une plante

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR19990076740A true KR19990076740A (ko) 1999-10-15

Family

ID=24959291

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019980704862A KR19990076740A (ko) 1996-10-24 1997-10-23 식물체 수분함량 조절 방법

Country Status (7)

Country Link
US (1) US6229069B1 (ko)
EP (1) EP0905242A4 (ko)
KR (1) KR19990076740A (ko)
CN (1) CN1112444C (ko)
AU (1) AU4722797A (ko)
CA (1) CA2239766A1 (ko)
WO (1) WO1998017803A1 (ko)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0411182B1 (pt) * 2003-05-22 2019-08-20 Evogene Ltd. Método para aumentar a tolerância de uma planta ao estresse salino e construto deácido nucleico
US7554007B2 (en) 2003-05-22 2009-06-30 Evogene Ltd. Methods of increasing abiotic stress tolerance and/or biomass in plants
AU2005234725B2 (en) 2003-05-22 2012-02-23 Evogene Ltd. Methods of Increasing Abiotic Stress Tolerance and/or Biomass in Plants and Plants Generated Thereby
WO2007049275A2 (en) 2005-10-24 2007-05-03 Evogene Ltd. Isolated polypeptides, polynucleotides encoding same, transgenic plants expressing same and methods of using same
EP2336330B1 (en) 2004-06-14 2018-01-10 Evogene Ltd. Polynucleotides and polypeptides involved in plant fiber development and methods of using same
CN100424176C (zh) * 2005-06-03 2008-10-08 中国科学院上海生命科学研究院 人参液泡膜水孔蛋白基因、其编码的氨基酸序列和应用
MX349479B (es) 2006-12-20 2017-07-31 Evogene Ltd Polinucleotidos y polipeptidos involucrados en el desarrollo de fibra vegetal y metodos de uso.
BR122020016899B1 (pt) 2007-04-09 2021-06-22 Evogene Ltd Método para aumentar o teor de óleo, taxa de crescimento, biomassa, vigor e/ou rendimento de uma planta, e, construção de ácido nucleico isolado
CA3133548A1 (en) 2007-07-24 2009-01-29 Evogene Ltd. Polynucleotides, polypeptides encoded thereby, and methods of using same for increasing abiotic stress tolerance and/or biomass and/or yield in plants expressing same
MX357387B (es) * 2007-12-27 2018-07-06 Evogene Ltd Polipeptidos, polinucleotidos aislados utiles para modificar la eficacia en el uso de agua, eficacia en el uso del fertilizante, la tolerancia al estres biotico/abiotico, el rendimiento y biomasa en plantas.
BRPI0908666B1 (pt) 2008-05-22 2021-06-15 Evogene Ltd Método de aumento do teor do óleo, do rendimento de sementes, da taxa de crescimento e/ou da biomassa de uma planta quando comparada a uma planta nativa, e, construção de ácido nucleico isolado
AR073076A1 (es) 2008-08-18 2010-10-13 Evogene Ltd Polipeptidos y polinucleotidos aislados utiles para mejorar la eficacia en el uso de nitrogeno, tolerancia al estres abiotico, rendimiento y biomasa en plantas.
BRPI0914522B1 (pt) 2008-10-30 2019-04-02 Evogene Ltd Método para aumentar o rendimento, a biomassa, a taxa de crescimento, o vigor, oteor de óleo, e/ou a eficiência da utilização do nitrogênio de uma planta
EP3460062B1 (en) 2009-03-02 2021-05-05 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides, and methods of using same for increasing plant yield and/or agricultural characteristics
MX339869B (es) 2009-06-10 2016-06-15 Evogene Ltd Polinucleotidos y polipeptidos aislados, y metodos para utilizarlos para mejorar la eficacia en el uso de nitrogeno, rendimiento, tasa de crecimiento, vigor, biomasa, contenido de aceite y/o tolerancia al estres abiotico.
AU2010337936B2 (en) 2009-12-28 2016-06-23 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides and methods of using same for increasing plant yield, biomass, growth rate, vigor, oil content, abiotic stress tolerance of plants and nitrogen use efficiency
BR122021002353B1 (pt) 2010-04-28 2022-08-16 Evogene Ltd Método de aumento de produção, biomassa, taxa de crescimento, vigor, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência de uso de nitrogênio de uma planta, e, construto de ácido nucleico isolado
AR082530A1 (es) 2010-08-30 2012-12-12 Evogene Ltd Polinucleotidos y polipeptidos aislados, y metodos para utilizarlos para aumentar la eficacia en el uso de nitrogeno, rendimiento, tasa de crecimiento, vigor, biomasa, contenido de aceite y/o tolerancia al estres abiotico
BR122020018456B1 (pt) 2010-12-22 2021-10-19 Evogene Ltd. Método para aumentar a tolerância ao estresse abiótico, rendimento, biomassa, taxa de crescimento, vigor, e/ou eficiência de uso de nitrogênio de uma planta, e, construto de ácido nucleico isolado
WO2012150598A2 (en) 2011-05-03 2012-11-08 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides and methods of using same for increasing plant yield, biomass, growth rate, vigor, oil content, abiotic stress tolerance of plants and nitrogen use efficiency
CN103130886B (zh) * 2013-03-21 2014-02-19 中国热带农业科学院橡胶研究所 一种橡胶树水通道蛋白及其编码基因与应用
CN104726463A (zh) * 2013-12-24 2015-06-24 先锋海外公司 Dn-dtp1多肽基因应用的载体和方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9106713D0 (en) * 1991-03-28 1991-05-15 Ici Plc Dna,dna constructs,cells and plants derived therefrom
FI943133A0 (fi) * 1994-06-29 1994-06-29 Alko Ab Oy Transgena vaexter

Also Published As

Publication number Publication date
CN1112444C (zh) 2003-06-25
EP0905242A4 (en) 2001-11-07
CN1212014A (zh) 1999-03-24
WO1998017803A1 (fr) 1998-04-30
EP0905242A1 (en) 1999-03-31
CA2239766A1 (en) 1998-04-30
US6229069B1 (en) 2001-05-08
AU4722797A (en) 1998-05-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR19990076740A (ko) 식물체 수분함량 조절 방법
ES2154624T3 (es) Regulacion de la expresion de la quinolato fosforribosil transferasa.
JP6103607B2 (ja) 高密度植栽に好適な植物体およびその利用
CN110256544B (zh) NsNHX1蛋白质及其相关生物材料在培育耐逆型杨树中的应用
CN104725495B (zh) 棉花GhWRKY51转录因子及其编码基因与应用
CN101333535A (zh) 具有改进形态发生的植物及其制备方法
US20050172361A1 (en) Regulation of gene expression in plant cells
CA3038869A1 (en) Growing strawberry plug plants at low elevation without the need for conditioning
JP2002512035A (ja) 増加した数の気孔を有する植物を産生する方法におけるポリヌクレオチド配列およびその使用
ES2344877B1 (es) Planta con resistencia a estres por bajas temperaturas y metodo de produccion de la misma.
CN113832170B (zh) 玉米ZmHSMT3基因及其在降低水稻籽粒镉积累中的应用
JPH10512451A (ja) グルタチオンｓ−トランスフェラーゼをコードするデオキシリボ核酸およびその使用
CN107827963B (zh) 拟南芥idd14基因在提升植物干旱胁迫耐性中的应用
JP5804420B2 (ja) 植物の生育促進およびバイオマス量の増加に関与する遺伝子ならびにその利用方法
KR101775789B1 (ko) 고추 유래의 건조 저항성 관련 단백질 ｍａｆ1 및 이의 용도
CN116121298B (zh) 抑制hsrp1基因的表达在提高植物耐热性中的应用
CN111424040B (zh) 一种春兰CgWRKY21基因及其应用
CN113136389B (zh) 基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D的基因工程应用
KR20190043394A (ko) 식물체의 건조 스트레스 내성 증진 단백질, 이 단백질을 암호화하는 유전자 및 이 유전자로 형질전환된 식물체
JPH09201190A (ja) 分子育種法による高鉄含量植物およびその作出方法
JP2004329210A (ja) 塩ストレス耐性を付与する遺伝子
AU5449301A (en) Method for controlling water content of plant
CN117737116A (zh) 紫花苜蓿MsSAP26基因及用途
CN116987163A (zh) 抗逆相关蛋白MsWRKY2G及其编码基因与应用
KR100965422B1 (ko) ＡＰ２ (Ａｐｅｔａｌａ 2) 도메인의 유전자에 의해형질전환된 스트레스 저항성 식물

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application