CN100424176C - 人参液泡膜水孔蛋白基因、其编码的氨基酸序列和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人参液泡膜水孔蛋白基因、其编码的氨基酸序列以及该基因用于生产转基因植物的应用。该基因编码的蛋白具有水孔蛋白的功能，并且主要定位于液泡膜上。将该基因转入植物后得到的转基因植物的种子明显大于野生型植物的种子，种子中的脂肪酸含量也有很大的提高。

Description

人参液泡膜水孔蛋白基因、其编码的氨基酸序列和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，是关于一种人参液泡膜水孔蛋白基因、其编码的氨基酸序列以及该基因用于生产转基因植物的应用。

背景技术

自Maurel等1993年(Maurel等，EMBO J.，12：2241-2247，1993)首次报导了液泡膜内在蛋白行使水通道的功能后，许多植物水孔蛋白相继被发现。目前，对植物水孔蛋白研究得比较详尽的是拟南芥和玉米。在拟南芥中发现了35个水孔蛋白同源基因，在玉米中31个水孔蛋白基因也先后被报道(Chaumont等，Plant Physiol，125：1206-1215，2001)。根据在细胞中的定位，植物水孔蛋白主要分为质膜水孔蛋白(PIPs)和液泡膜水孔蛋白(TIPs)。水孔蛋白从结构上共有6个跨膜的α-螺旋，在跨膜区之间形成了5个环(A、B、C、D、E)，N端和C端都在膜内侧，其中在B环和E环各有一个非常保守的NPA(天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸)区域，两个NPA区域折入膜内并交叉重叠形成了狭窄的“漏斗”形的水通道(Jung等，J Biol Chem，269：14648-14654，1994)。Jauh等利用激光共聚焦技术发现拟南芥不同类型的液泡所含的TIP是不同的，如贮藏色素和受环境响应的液泡膜主要存在δ-TIP或δ-TIP和γ-TIP；蛋白贮藏型液泡膜主要存在α-TIP和δ-TIP或α-TIP、δ-TIP和γ-TIP；而含有许多蛋白水解酶的水解型液泡膜上仅单独存在γ-TIP(Jauh等，Plant Cell，11：1867-1882，1999)。

细胞生长与水分的跨膜运输是密切相关的，现已有一些报道初步证明了水孔蛋白与植物细胞和植株的生长有关。Ludevid等报道了拟南芥根和胚轴的γ-TIP的表达与其细胞的膨大同步(Ludevid等，Plant physiol，100：1633-1639，1992)。后来的研究又表明，拟南芥根和胚轴中的PIP1b(AthH2)基因主要在正在伸长的细胞中表达，这样的细胞具有较高的水导度有利于细胞与细胞间的水分供应(Kaldenhoff等，Plant J，7：87-95，1995；Maurel，Annu.Rev.Plant.Physiol.Plant Mol.Biol，48：399-429，1997)。番茄的果实成熟相关膜蛋白(TRAMP)被认为是一个功能性的水孔蛋白，转TRAMP反义基因的番茄果实的TRAMP表达量下降了94％，不过转基因番茄并没有表现与水分相关表型的明显差异，但其成熟果实有机酸和糖分的积累却有所改变。转TRAMP反义基因的番茄果实在成熟过程中，L-马来酸和柠檬酸显著提高而D[+]-葡萄糖和D[+]-果糖的含量却下降，另外，他们的研究还表明，过量表达TRAMP的转基因番茄的果实与对照相比并没有差异(Chen等，Planta，212：799-807，2001)。另外，有报导发现含羞草(Mimosa pudica)的成熟运动细胞在受到外界刺激时细胞膨压会发生变化，且含羞草在不成熟的叶枕细胞向成熟的运动器官转变的过程中，γ-TIP的丰度提高了3倍(Fleurat-Lessard等，Plant Physiol，114：827-834，1997)。这样的结果可能意味着水分跨液泡膜运动在细胞运动中起重要作用。总之，由于水孔蛋白家族参与了植物生命活动的各个方面，目前为止人们对其在生命活动中角色的了解仍然是比较肤浅的。随着研究手段的进步，越来越多的水孔蛋白及它们的生理功能会被人们发现和认识。

发明内容

本发明的目的在于提供一种全新的人参液泡膜水孔蛋白基因(PgTIP)。

本发明的另一个目的在于提供一种由所述人参液泡膜水孔蛋白基因编码的蛋白PgTIP。

本发明的又一个目的在于提供一种所述液泡膜水孔蛋白基因用于转化植物以产生转基因植物的用途。

通过采用抑制差减杂交法(SSH)筛选激素依赖型和非依赖型两类人参细胞中的差异表达基因，本申请的发明人筛选到了一种在不含植物激素培养基上生长的人参细胞中表达很强，而在含有植物激素的培养基上生长的人参细胞中不表达的差异表达基因，并在人参cDNA库中克隆了它的全长cDNA。经过测序表明，该基因具有SEQ ID NO：1所示的编码区cDNA序列。该编码区cDNA的长度为753bp，编码的蛋白含有250个氨基酸。

对本发明的PgTIP基因的编码区序列的进一步的研究证明，该基因所编码的氨基酸序列具有水孔蛋白的功能，并且主要定位于液泡膜上，因而是一种液泡膜水孔蛋白基因。

本发明的人参液泡膜水孔蛋白基因所编码的蛋白PgTIP具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

通过将本发明的人参液泡膜水孔蛋白基因转入拟南芥中发现，产生的转基因拟南芥与野生型拟南芥相比，其种子的大小和重量都产生了明显的增加；进一步的研究发现，过表达PgTIP基因的拟南芥种子中脂肪酸的含量是野生型种子的1.85倍。因此，本发明的人参液泡膜水孔蛋白基因PgTIP适合用于生产转基因植物，并且具有非常重要的意义。

虽然现有技术的文献中有对于其他植物的液泡膜水孔蛋白基因的报道，但是它们的核苷酸序列与本发明的人参液泡膜水孔蛋白基因是有差异的，因此，本发明的人参液泡膜水孔蛋白基因(PgTIP)是本申请的发明人首次独立克隆到的一种全新的液泡膜水孔蛋白基因。而且发明人首次发现转有PgTIP的转基因拟南芥，其种子的体积和重量都明显增加，并且主要体现在脂肪酸总量的显著增加，这也是没有报道过的。

附图说明

图1为人参细胞系特异表达基因PgTIP的Northern分析结果示意图，其中A为激素自养型人参细胞，B为激素依赖型人参细胞。

图2为本发明的PgTIP的编码区cDNA序列与烟草液泡膜水孔蛋白基因NtAQP1、水稻液泡膜水孔蛋白基因OsTIP、玉米液泡膜水孔蛋白基因ZmTIP、拟南芥液泡膜水孔蛋白基因AtTIP的同源性比较的示意图。

图3A为本发明的PgTIP与NtAQP1、OsTIP、ZmTIP、AtTIP的蛋白质序列同源性比较的示意图；图3B显示了PgTIP与NtAQP1、OsTIP、ZmTIP和AtTIP蛋白质进化关系的分析。

图4显示了本发明的PgTIP在爪蟾卵母细胞中表达后引起卵母细胞水导度增加，其中水孔蛋白AQP2为阳性对照，H₂O为阴性对照。

图5显示了本发明的PgTIP与绿色荧光蛋白(GFP)融合后在洋葱表皮细胞中表达后作质壁分离的示意图，其中A～C：pCAMBIA-mGFP对照；D～F：pCAMBIA-PgTIP-mGFP融合质粒。

图6显示了以转PgTIP基因拟南芥的叶片为材料提取DNA作为PCR反应的模板进行PCR反应，并以PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳的结果示意图，其中A：分子量Marker；B：质粒阳性对照；C：转PgTIP株系2(L2)；D：转PgTIP株系8(L8)；E：转PgTIP株系20(L20)；F：野生型对照。

图7A显示了转PgTIP基因拟南芥株系2与野生型拟南芥种子大小的比较；其中1～3为野生型拟南芥小苗，4～6为转pgTIP株系2的小苗。

图7B显示了转PgTIP基因拟南芥与野生型拟南芥种子萌发一周后根的长度比较。

图8显示了PgTIP基因拟南芥与野生型拟南芥种子大小的比较；L2：2号转PgTIP基因株系的拟南芥种子；Wt：野生型拟南芥种子。

具体实施方式

通常情况下，植物外植体在植物激素的作用下诱发出愈伤组织细胞，这些愈伤组织细胞可以继续在含有植物激素的培养基上继代生长。而如果从培养基中去除外源植物激素，对很多种植物来说，细胞会出现停止生长的现象。

发明人通过对人参细胞进行长时间的不依赖外源植物激素的适应性培养，获得了在不含植物激素的培养基上逐渐恢复了生长能力的细胞系。为了认识这个人参细胞系在不含植物激素的培养基上恢复生长能力的原因，发明人进而开展克隆在这个细胞系中特异表达的基因，也就是相对于在含有植物激素的培养基上生长的人参细胞而言，是特有表达的基因。利用抑制差减杂交法(SSH)来筛选激素依赖型和非依赖型两类细胞中的特异表达基因，并对其中一个在不含植物激素培养基上生长的人参细胞中表达很强，而在含有植物激素的培养基上生长的人参细胞中不表达的差异表达基因进行了系统研究，在人参cDNA库中克隆了它的全长cDNA。经过同源性比较发现，该基因与多种植物液泡膜水孔蛋白基因具有较高的同源性，是一种全新的人参液泡膜水孔蛋白基因。

在一个具体的实施例中，通过利用DNAStar软件将该基因的序列与其它植物的液泡膜水孔蛋白基因的序列进行同源性比较发现，本发明的人参液泡膜水孔蛋白基因(PgTIP)与烟草NtAQP1的同源性为74.5％，与拟南芥AtTIP的同源性为71.6％，与水稻OsTIP的同源性为71.7％，与玉米ZmTIP的同源性为65.7％。进而对其序列的分析结果也显示了它具有液泡膜水孔蛋白结构的特征性序列。

在另一个具体的实施例中，发明人进一步以克隆的人参液泡膜水孔蛋白基因(PgTIP)用国际上公认的“爪蟾卵母细胞中体外表达法”进行功能鉴定，证明了其编码的蛋白PgTIP具有水孔蛋白的功能。PgTIP与GFP(绿色荧光蛋白)融合后在洋葱表皮中瞬时表达进行细胞内定位分析表明，PgTIP主要定位于液泡膜上。

在另一个实施例中，将本发明的人参液泡膜水孔蛋白基因(PgTIP)转入拟南芥中，产生的转基因拟南芥与野生型拟南芥相比，其种子的大小和重量都产生了明显的增加。

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。

实施例1、激素自养型人参愈伤组织细胞的获得

人参(Panax Ginseng C.A.Meyer)愈伤组织细胞培养在0.8％琼脂固化的67V培养基上，培养基中添加2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)1.5mg/l，NAA(α-萘乙酸)0.1mg/l，IAA(3-吲哚乙酸)1.0mg/l，KT(激动素)0.25mg/l(Veliky和Martin，Can.J.Microbiol.，16：223-226，1970；朱蔚华等，药学学报，14：541-547，1979；李新兰和朱蔚华，中药材，16(6)：3-4，1993)。培养条件为：25℃，暗培养；每28天按1g的接种量转接传代。将添加了上述四种外源植物激素培养的人参细胞转接至去激素的培养基上，挑选能够在其上生长存活的细胞进行继代培养，培养条件与依赖外源激素的细胞系相同，通过不断筛选获得激素自养型人参愈伤组织细胞系。

实施例2、激素自养型人参细胞系特异表达的液泡膜水孔蛋白cDNA序列的获得

分别取激素依赖型和自养型人参细胞，以LiCl沉淀法提取两类细胞的总RNA(王关林和方宏筠，植物基因工程原理与技术，1998)，并按照Qiagen polyA⁺ RNA Purification Kit说明书进行mRNA的分离纯化。通过抑制差减杂交法(SSH)筛选两类细胞中的特异表达基因，得到正向差减杂交cDNA和反向差减cDNA的PCR扩增产物，具体操作依ClontechPCR-Select^TM cDNA Subtractive Kit说明书进行。

对通过SSH获得的正向差减和反向差减cDNA群体的PCR扩增产物以常规T/A克隆法构建差减cDNA文库。以杂交的方法对差减文库进行差示筛选，具体操作如下：

分别取正向差减杂交cDNA和反向差减杂交cDNA的PCR扩增产物40μl(含400～1600ng cDNA)，以PCR产物纯化试剂盒(上海华舜生物公司)回收后用Rsa I、Sma I和Eae I酶切消化去除cDNA分子两端的接头，PCR产物纯化试剂盒回收酶切产物作为差示筛选备用探针。探针标记采用随机引物DNA标记系统(Takana，Japan)。

在第一轮差示筛选中，将正向和反向差减文库所有克隆的插入片段的PCR产物10倍稀释后用Biomek2000HDRT自动点样装置(Beckman)点印于尼龙膜上，变性后80℃烘干，保存在干燥器中备用(注：将两组PCR产物分别点在同一张膜的左右两个半边，制备两套重复拷贝膜)。取约300ng正向或反向差减cDNA群体标记探针，分别用来杂交同一张点有两组PCR产物的膜。

在第二轮差示筛选中，取正向cDNA文库中第一轮筛选为阳性的克隆，分别抽提质粒，操作依分子克隆实验指南进行(Sambrook等，1998)，百倍稀释后点印于尼龙膜上，用300ng正向或反向差减cDNA群体标记探针，分别用来杂交同一张点有正向库质粒的两套重复膜。杂交、洗膜条件参见文献(Sambrook等，1998，分子克隆实验指南)。

对通过SSH获得并经差示筛选验证为阳性的cDNA克隆进行Northern杂交分析以进一步确定差异表达基因：取抽提的去激素和添加激素培养人参细胞总RNA各30μg，甲醛凝胶电泳，转膜。随机挑取10个在差示筛选中表现阳性的cDNA，用放射性同位素标记探针进行Northern杂交，具体操作按文献(Sambrook等，1998，分子克隆实验指南)进行。Northern分析的结果如图1所示，其中A为激素自养型人参细胞，B为激素依赖型人参细胞。由图1的结果可见，通过上述步骤筛选得到的基因在转录水平上是激素自养型人参细胞系中特异表达的。

对Northern杂交显示为阳性的cDNA采用自动测序法测序，测序结果表明上述筛选得到的基因的编码区序列如SEQ ID NO：1所示，该编码区cDNA的长度为753bp，编码的蛋白含有250个氨基酸，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

用BLAST软件搜索，将SEQ ID NO：1所示的本发明的基因的编码区cDNA序列及其编码的SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列与GenBank中的序列进行同源性比较，比较结果如图2和图3所示。

图2显示了本发明的基因的编码区cDNA序列与GenBank中同源序列的比较结果，该结果显示本发明的基因与烟草NtAQP1的同源性为74.5％，与拟南芥AtTIP的同源性为71.6％，与水稻OsTIP的同源性为71.7％，与玉米ZmTIP的同源性为65.7％。

图3A(利用DNAStar软件进行分析)显示了本发明的基因的编码区cDNA序列所编码的蛋白与NtAQP1、OsTIP、ZmTIP、AtTIP的蛋白质序列同源性比较结果，该结果显示本发明的基因编码的蛋白具有水孔蛋白的特征性NPA区域，图中A～F标明了6个跨膜区。

图3B为本发明的蛋白与NtAQP1、OsTIP、ZmTIP和AtTIP蛋白质进化关系的分析。由图3B的结果可见PgTIP在遗传进化上与NtAQP1、OsTIP、ZmTIP和AtTIP的距离由近及远依次为NtAQP1、OsTIP、AtTIP、ZmTIP。

以上的结果表明，本发明所筛选得到的基因为一种新的人参水孔蛋白基因。

实施例3、PgTIP在爪蟾卵母细胞中体外表达进行功能鉴定

在PgTIP cDNA两端引入BglII酶切位点后将上述本发明的基因的编码区cDNA用BglII酶切，连接到以相同酶切回收的爪蟾卵母细胞表达载体pXBG-evl(Li L等，Plant Sci.154(1)：43-51，2000)。用In Vitro Transcription Kit(Boehringer Mannheim)进行体外转录得到PgTIP的mRNA，具体操作见产品说明书，以DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水溶解稀释至1μg mRNA/μl用于微注射。

爪蟾用碎冰冷冻失去知觉后，在下腹部开一约1cm的小口，用镊子取出足量的卵母细胞置于含2mg/ml胶原酶(Collagenase 1A，Sigma)的Bath溶液(含88mmol/L NaCl，1mmol/L KCl，0.82mmol/L MgSO₄，0.41mmol/L CaCl₂，0.33mmol/L Ca(NO₃)₂，2.4mmol/LNaHCO₃，10mmol/L HEPES，pH7.4，200mOsm/kg水，氨卞青霉素10μg/ml，链霉素10μg/ml)中，20℃下酶解约2～4h以去除卵母细胞外的滤泡膜，然后用Bath溶液清洗3～4次后用于微注射。

按照显微注射仪(WPI，USA)的操作步骤，用毛细管针头取3μl待注射的mRNA注射入卵母细胞中，每个细胞的注射剂量相同(每个细胞40ng/40nl)，每组注射至少50个卵母细胞。随后将卵母细胞置于20℃下保温，约48～72h后转入1/5的Bath溶液中，立即于摄影显微镜下拍照，每10sec摄一次，每组测定100sec。同样实验重复至少三次。摄影照片用LabWork软件(Ultra-Violet Products Ltd.，UVP，Inc.)处理以获得卵母细胞的体积大小。以照片拍摄时间与卵母细胞体积作曲线图，根据曲线公式获得卵母细胞的初始膨胀率[d(V/V₀)/dt]并将数据代入下列公式计算细胞的水导度(P_f)：

P_f＝V₀[d(V/V₀)/dt]/[S×V_w×(OSM_in-OSM_out)]

V₀：初始细胞体积；S：初始细胞表面积；V_w：水分子的偏摩尔体积(18cm³/mol)；V：细胞膨胀后的体积；OSM_in：细胞内渗透势(200mOsm/kg水)；OSM_out：细胞外渗透势(40mOsm/kg水)。

结果如图4所示，可见本发明的水孔蛋白基因在爪蟾卵母细胞中表达后引起卵母细胞透水性增强，水导度比阳性对照水孔蛋白AQP2增加了约1.35倍(H₂O为阴性对照)，证明了本发明的基因所编码的蛋白确实具有水孔蛋白的功能。

实施例4、PgTIP与GFP融合后在洋葱表皮中瞬时表达进行细胞内定位分析

绿色荧光蛋白(GFP)基因从发光水母成功分离后，是近年来新兴的一种报告分子。该蛋白具有荧光强度高、不需要底物(或辅助因子)、无种属特异性、相对分子量小、易与其它蛋白融合、对细胞无伤害、易于检测、可在活细胞实时观察等特点。因GFP分子量相对较小，仅有27KD左右，它能与多种不同的蛋白质N端或C端融合而保持其天然蛋白的特性，因此是一种直观性很强的遗传标记物，通过与某单一序列的融合，可特异地进行线粒体、内质网等细胞器的定位，目前已经在现代生物学的研究中得到了广泛的应用。构建含编码PgTIP-GFP融合蛋白序列的pCAMBIA-PgTIP-mGFP融合质粒载体(Kai P.

等，Planta 217(6)：858-67，2003)。DNA的金粉包埋按照Biolistic PDS-1000/HeParticle Delivery System的方法(安千里等，植物学报43，6：558-564，2001)，具体如下：

取金粉悬液50μl(60g/l)，依次加入5μl质粒DNA(1μg/μl)，50μl 2.5M CaCl₂和20μl 0.1M亚精胺；振荡3分钟，10000rpm离心10～20秒，弃上清；加250μl无水乙醇，振荡重悬，10000rpm离心10～20秒，弃上清；用60μl无水乙醇定容；取10μl点于微粒载膜中央，使其平铺，晾至完全干燥。

采用PDS-1000/He基因枪(Bio-Rad)进行轰击，样品室真空度26Pa，压力1300psi，洋葱(约1cm×1cm的小块)放在0.8％琼脂固化的MS培养基上，至可裂膜距离为6cm，转化后继续培养16-24h，制片，于ZEISS激光共聚焦荧光显微镜(LSM 510 META，Germany)下观察细胞中的绿色荧光。结果如图5所示，其中A～C为pCAMBIA-mGFP对照；D～F为pCAMBIA-PgTIP-mGFP融合质粒轰击洋葱表皮细胞并做质壁分离后在激光共聚焦显微镜下观察到的结果，由图5可以看到本发明的水孔蛋白基因主要定位于液泡膜上，证明本发明筛选得到的基因为人参液泡膜水孔蛋白基因PgTIP。

实施例5、将PgTIP基因转入拟南芥后对PgTIP生理功能的初步研究

在PgTIP cDNA的翻译起始密码前和终止密码后分别引入HindIII和Xba I酶切位点，而后将本发明的基因PgTIP的编码区cDNA用HindIII和Xba I酶切，连接到以相同酶切后回收的pHB质粒载体(中科院上海植物生理生态研究所杨洪全研究员构建，具体方法如下：将PCR扩增的潮霉素磷酸转移酶II片段插入质粒pCAMBIA3301(CAMBIA，Australia)的Nco I和BstE II酶切位点之间，取代其上的β-葡萄糖醛酸酶cDNA片段。然后将两个CaMV 35S启动子及多克隆位点(MCS)和多聚腺嘌呤(polyA)插入pCAMBIA3301的EcoR I和HindIII酶切位点构建成pHB质粒载体)，构建成PgTIP基因的重组表达质粒。

野生型拟南芥种子播种在蛭石∶草炭土∶珍珠岩(7∶2∶1)的混合土壤中，光照16h/d，温度23℃日/18℃夜条件下生长，并按照Clough和Bent(Clough和Bent，Plant J.，16：735-743，1998)的方法进行根癌农杆菌介导的遗传转化。

转PgTIP基因的拟南芥种子在含有50mg/l潮霉素的MS培养基(Murashige和Skoog，Physiol Plant 15：473-497，1962)上萌发，筛选具有潮霉素抗性的转基因小苗，转入土壤与野生型拟南芥在相同条件下培养。以转基因植株的叶片为材料提取DNA作为PCR反应的模板进行分子检测(王关林和方宏筠，植物基因工程原理与技术，1998)，PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图6所示，其中A：分子量Marker；B：质粒阳性对照；C：转PgTIP株系2(L2)；D：转PgTIP株系8(L8)；E：转PgTIP株系20(L20)；F：野生型对照。PCR反应为阳性的株系L2、L8和L20为阳性转PgTIP拟南芥株系。

以2、8、20三个株系为例分别对转基因与野生型拟南芥种子的体积和重量进行比较，结果如图8和以下表1所示，可见转PgTIP后种子的体积和重量都明显增加(是野生型对照的1.5-2倍)。将种子萌发于含MS培养基的垂直平板上，发现转PgTIP基因的拟南芥小苗根的长度明显比野生型拟南芥小苗长，见于图7A和7B。

表1、转PgTIP株系2，8，20的种子大小、重量与野生型种子的比较

	野生型	L2	L8	L20
					种子长度(μm)n，SE种子宽度(μm)n，SE千颗种子重量(mg)n，SE	470151，40275151，21173，1	577148，42320148，23343，1	573115，27329115，15343，1	560160，28318160，17273，1

为了进一步分析转基因拟南芥种子的变化，比较了野生型和过表达PgTIP拟南芥2号株系(L2)成熟的干种子内脂肪酸和糖类的含量，种子内脂肪酸和糖类的提取分析参照Fiehn等(Nature Biotechnol，2000，18：1157-1161)的方法，具体操作简述如下：

分别称取0.33g野生型和L2转PgTIP拟南芥的成熟干种子，于液氮中研磨成粉，迅速移入2ml离心管中，加入1.4ml甲醇，终止酶活；加入50μl核糖醇储存液(0.2mg核糖醇/1ml水)和50μl十九酸甲酯储存液(2mg十九酸甲酯/1ml氯仿)；加入50μl水，混匀，测pH(约5-6)；70℃振荡15min；14,000g离心3min；上清移入6ml玻璃瓶，沉淀加入1ml氯仿，37℃振荡5min，14,000g离心3min，合并上清；加入1.4ml纯水和1ml氯仿，振荡混匀，4,000rpm离心15min。

取脂相100μl，加1ml甲醇/硫酸(97∶3)，100℃甲酯化反应4h；加入4ml水，振荡，4,000rpm离心，弃去水相；加无水硫酸钠干燥过夜；用氮吹仪浓缩至约80μl；加10μl吡啶和10μl MSTFA，37℃放置30min后取2μl进GC/MS(6890N GC System/5973MSSelective Detector)检测。

取极性相500μl于1.5ml离心管中，在LNG-T98冷冻浓缩离心干燥器中干燥过夜；在干燥碎片中加25μl甲氧胺酸盐(20mg/ml吡啶)，摇晃共培90min；加40μl MSTFA，37℃放置30min后转入25℃放置2h；取2μl进GC/MS检测。

测定结果显示，L2株系的种子中多糖含量在转基因后没有明显变化，但脂肪酸含量却达到了野生型拟南芥种子的1.85倍(表2)。

表2、野生型和过表达PgTIP拟南芥种子中脂肪酸总量和组成成分的比较

以上结果表明，利用本发明的人参液泡膜水孔蛋白基因生产的转基因植物与野生型相比具有非常明显的优势，种子中的脂肪酸含量得到大幅提高，因此用于生产转基因植物具有非常重要的应用前景。

虽然以上仅以拟南芥为例验证了本发明的人参液泡膜水孔蛋白基因的功能及其用于生产转基因植物的效果，但是本领域的技术人员可以通常本技术领域的常规手段将其转入其它植物，例如大豆、油菜、烟草、水稻和玉米等，同样可以获得类似的效果。这对于本领域的技术人员来说是显而易见的，因此同样应当属于本发明的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>人参液泡膜水孔蛋白基因、其编码的氨基酸序列和应用

<130>061226N

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>753

<212>cDNA

<213>Panax ginseng

<220>

<221>exon

<222>(1)..(753)

<400>1

atg ccg att cac gaa att gcc gtc ggt agg tac gaa gag ttc cgc cac    48

Met Pro Ile His Glu Ile Ala Val Gly Arg Tyr Glu Glu Phe Arg His

1               5                   10                  15

ccg ggt gcc ctt aag gcc gcg gcg gca gag ttc ttc agt acc ctc att    96

Pro Gly Ala Leu Lys Ala Ala Ala Ala Glu Phe Phe Ser Thr Leu Ile

            20                  25                  30

ttt gtt ttt gcc ggc caa ggc tca ggc ttg gca ttt agc aag ctc act   144

Phe Val Phe Ala Gly Gln Gly Ser Gly Leu Ala Phe Ser Lys Leu Thr

        35                  40                  45

gac ggc ggt gcc act act ccg tct ggc ctt gtc tcc gct gcg ttg gcc   192

Asp Gly Gly Ala Thr Thr Pro Ser Gly Leu Val Ser Ala Ala Leu Ala

    50                  55                  60

cac gca ttc ggg ttg ttt gtg gca gtc tct gtc gga gcc aac atc tcc    240

His Ala Phe Gly Leu Phe Val Ala Val Ser Val Gly Ala Asn Ile Ser

65                  70                  75                  80

ggc ggc cat gtt aac cct gcc gtt aca ttc ggc gcc ttt atc ggt ggt    288

Gly Gly His Val Asn Pro Ala Val Thr Phe Gly Ala Phe Ile Gly Gly

                85                  90                  95

aac ctt aca ctg atc agg gga att ttg tac att att gct cag ttg ctt    336

Asn Leu Thr Leu Ile Arg Gly Ile Leu Tyr Ile Ile Ala Gln Leu Leu

            100                 105                 110

ggc tca act gtt gct tgc ctt ctc ctt agt ttc gca act ggt gga tcg    384

Gly Ser Thr Val Ala Cys Leu Leu Leu Ser Phe Ala Thr Gly Gly Ser

        115                 120                 125

cca att tcg gca ttc gct ttg tcc gga gta tcg gtg tgg agc gcc ttt    432

Pro Ile Ser Ala Phe Ala Leu Ser Gly Val Ser Val Trp Ser Ala Phe

    130                 135                 140

gtg ttc gag att gtc atg acc ttt ggg ctg gtt tac acc gtt tac gca    480

Val Phe Glu Ile Val Met Thr Phe Gly Leu Val Tyr Thr Val Tyr Ala

145                 150                 155                 160

acc gcc atc gac cca aag aag gga gaa ctg ggc ata att gca ccc att    528

Thr Ala Ile Asp Pro Lys Lys Gly Glu Leu Gly Ile Ile Ala Pro Ile

                165                 170                 175

gca att ggg ttg att gtg gga gct aac att ctt gct ggt ggt gcc ttc    576

Ala Ile Gly Leu Ile Val Gly Ala Asn Ile Leu Ala Gly Gly Ala Phe

            180                 185                 190

acc ggg gca tca atg aac cca gct gtt tca ttt ggc cca gct ttg gtc    624

Thr Gly Ala Ser Met Asn Pro Ala Val Ser Phe Gly Pro Ala Leu Val

        195                 200                 205

agc tgg gac tgg acc aac cac tgg gtg tac tgg gcc ggc cct att gtt    672

Ser Trp Asp Trp Thr Asn His Trp Val Tyr Trp Ala Gly Pro Ile Val

    210                 215                 220

ggt ggt ggg gtt gct gca gtt gtc tac gag ctc atc ttc atc agc agc    720

Gly Gly Gly Val Ala Ala Val Val Tyr Glu Leu Ile Phe Ile Ser Ser

225                 230                 235                 240

agt cac gag cca ttg cct gtc gct gat tac tag                        753

Ser His Glu Pro Leu Pro Val Ala Asp Tyr

                245                 250

<210>2

<211>250

<212>PRT

<213>Panax ginseng

<220>

<221>protein

<222>(1)..(250)

<223>

<400>2

Met Pro Ile His Glu Ile Ala Val Gly Arg Tyr Glu Glu Phe Arg His

1               5                   10                  15

Pro Gly Ala Leu Lys Ala Ala Ala Ala Glu Phe Phe Ser Thr Leu Ile

            20                  25                  30

Phe Val Phe Ala Gly Gln Gly Ser Gly Leu Ala Phe Ser Lys Leu Thr

        35                  40                  45

Asp Gly Gly Ala Thr Thr Pro Ser Gly Leu Val Ser Ala Ala Leu Ala

    50                  55                  60

His Ala Phe Gly Leu Phe Val Ala Val Ser Val Gly Ala Asn Ile Ser

65                  70                  75                  80

Gly Gly His Val Asn Pro Ala Val Thr Phe Gly Ala Phe Ile Gly Gly

                85                  90                  95

Asn Leu Thr Leu Ile Arg Gly Ile Leu Tyr Ile Ile Ala Gln Leu Leu

            100                 105                 110

Gly Ser Thr Val Ala Cys Leu Leu Leu Ser Phe Ala Thr Gly Gly Ser

        115                 120                 125

Pro Ile Ser Ala Phe Ala Leu Ser Gly Val Ser Val Trp Ser Ala Phe

    130                 135                 140

Val Phe Glu Ile Val Met Thr Phe Gly Leu Val Tyr Thr Val Tyr Ala

145                 150                 155                 160

Thr Ala Ile Asp Pro Lys Lys Gly Glu Leu Gly Ile Ile Ala Pro Ile

                165                 170                 175

Ala Ile Gly Leu Ile Val Gly Ala Asn Ile Leu Ala Gly Gly Ala Phe

            180                 185                 190

Thr Gly Ala Ser Met Asn Pro Ala Val Ser Phe Gly Pro Ala Leu Val

        195                 200                 205

Ser Trp Asp Trp Thr Asn His Trp Val Tyr Trp Ala Gly Pro Ile Val

    210                 215                 220

Gly Gly Gly Val Ala Ala Val Val Tyr Glu Leu Ile Phe Ile Ser Ser

225                 230                 235                 240

Ser His Glu Pro Leu Pro Val Ala Asp Tyr

                245                 250

Claims (10)

1. 一种人参液泡膜水孔蛋白基因，其特征在于，该基因编码具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白质。

2. 如权利要求1所述的人参液泡膜水孔蛋白基因，其特征在于，该基因具有SEQ IDNO：1所示的编码区cDNA序列。

3. 一种人参液泡膜水孔蛋白，其特征在于，该蛋白质具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

4. 如权利要求1或2所述的人参液泡膜水孔蛋白基因用于生产转基因植物的应用。

5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，用于提高植物种子中的脂肪酸含量。

6. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述生产转基因植物是通过将人参液泡膜水孔蛋白基因的编码区cDNA序列与适当的载体构建重组表达质粒，然后转化植物而实现。

7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述人参液泡膜水孔蛋白基因的编码区cDNA序列如SEQ ID NO：1所示。

8. 如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述载体为pHB质粒。

9. 如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述转化植物的方法为根癌农杆菌介导的遗传转化。

10. 如权利要求4～9中任一项所述的应用，其特征在于，所述植物包括但不限于：拟南芥、大豆、油菜、烟草、水稻和玉米。

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