CN101250525A - 一种表达重组人生长激素的方法及其专用表达盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种表达重组人体生长激素的方法及其专用表达盒。该方法，是利用植物重组表达载体将可表达人生长激素的表达盒转入烟草中，筛选获得可表达重组人生长激素的烟草，培养该可表达重组人生长激素的烟草，得到含有具有活性的重组人体生长激素的烟草。所述可表达重组人生长激素的表达盒，包括依次串联的修饰的烟草叶绿体16s启动子，人生长激素基因和烟草叶绿体psbA终止子。本发明的方法将人生长激素在烟草叶绿体中定位，可获得有活性的人体生长素。

Description

一种表达重组人生长激素的方法及其专用表达盒

技术领域

本发明涉及一种表达重组人生长激素的方法及其专用表达盒。

背景技术

人生长激素(human growth hormone，hGH)是人脑垂体前叶分泌的一种含有191个氨基酸残基的单链蛋白质激素(GENBANK号为AAA98618)，相对分子质量约为22，000，是人体一个重要的合成激素，具有促进蛋白合成、加快组织修复等作用，在机体的生长、发育和代谢中发挥着重要作用，最主要的作用是刺激躯体的生长。

生长激素(GH)是体内促进蛋白质合成类激素，能有效地改善氮平衡，促进血浆蛋白质合成。可能机理为(1)GH能显著增加肝脏RNA的合成及其含量，注射GH后RNA聚合酶活性增加，mRNA增加，核糖体含量增多，蛋白质合成增加，肝脏许多酶如磷酸果糖激酶等活性也增加。近期研究也从分子水平揭示了rhGH(重组人生长激素)能直接刺激肝细胞蛋白质mRNA的表达，从而促进蛋白质合成；(2)国外通过临床检测血胰岛素样生长因子-1(IGF-1)及其主要结合蛋白-3，证实外源性生长因子可有效地改善肝硬化患者由于GH抵抗所致的蛋白代谢异常。外源性生长激素可克服肝硬化患者的生长激素抵抗，刺激IGF-1升高。IGF-1具有很强的合成代谢效应，可抑制蛋白分解，增加氨基酸摄取和细胞增生，促进白蛋白的合成；(3)刺激肝细胞再生。研究发现，rhGH能促进大鼠肝部分切除后残肝中肝细胞核分裂指数，肝细胞体积密度、新生肝细胞数目密度，并在术后1、2天的酮体比率明显增加，说明rhGH具有促进肝细胞再生和增加肝细胞能量代谢的作用。临床实践表明，生长激素直接参与代谢调理，促进蛋白质合成，减少蛋白质分解，提高糖营养物质利用及转换率，维持氮平衡。生长激素能改善肝硬化患者低蛋白血症，促进肝细胞蛋白合成。由于GH是体内主要的促进蛋白质合成的激素，肝细胞是生长激素的主要靶器官。近期研究已证实，肝硬化患者存在严重的生长激素抵抗现象，患者的血清GH水平升高，但刺激胰岛素样生长因子-1(IGF-1)及其结合蛋白-3(IGFBP-3)水平降低，而外源性rhGH可克服肝硬化患者GH抵抗，刺激IGF-1和IGFBR3升高，IGF-1具有很强的合成代谢效应，抑制蛋白质分解，增加氨基酸摄取和细胞增生。IGFBP-3具有上调IGF-1生物活性，从而促进合成代谢。近期研究也从分子水平揭示：hGH能直接刺激肝细胞蛋白质mRNA的表达，从而促进蛋白质合成，提高血清白蛋白水平(赵晓晨、张琳，生长激素治疗失代偿期肝硬化34例临床观察，实用肝脏病杂志，2007，10(3)：187-188)。研究报道r-hGH除可促进蛋白质合成，还可促进糖原异生，提高糖利用率，升高血糖，尤其在强烈应激时可出现不可控制的高血糖症(罗丽莎，重组人生长激素治疗肝硬化低蛋白血症临床疗效分析，武警医学院学报，2007，16(1)：71-72)。

另外，rhGH能较显著改善肝硬化低蛋白血症，且在停药后2周ALB仍能维持较高水平，但其起效较人血白蛋白治疗慢，故对于临床上严重低蛋白血症的肝硬化患者可考虑采取rhGH加人血白蛋白联合治疗。rhGH还可以改善细胞能量代谢障碍，促进肝细胞线粒体产生ATP，进一步提高肝细胞损伤的修复能力(冉江华、郭永章、李立等，重组人生长激素对肝脏缺血再灌注损伤中的能量代谢变化，中国临床医学.2007.14(3)：350-351)。

已有研究报道表明，重组人生长激素(recombinant human growth hormone，rhGH)能抑制某些炎症介质如肿瘤坏死因子(TNFa)的生成和释放，而且对肝硬化，胃癌以及身材矮小等都有辅助治疗效果。1985年应用重组DNA技术制备的重组人生长激素(rhGH)获得美国FDA的批准，最初用于侏儒症及伴有侏儒症的特殊综合征如帕＝魏二氏综合征(PWS)和肾病综合征(NS)的治疗，后来扩大到性腺功能不全综合征(Tumer综合征)、肾功能不全和艾滋病相关消耗综合征等。此外，重组人生长激素对于重度烧伤中的创伤修复、术后或创伤后的胃肠外营养、原发性扩张性心肌病以及慢性肝病和肝硬化的治疗等也有良好效果。重组人生长激素还可用于预防骨质疏松、抗衰老、改善脂肪聚集、维持正氮平衡和增进运动员体能等。目前，重组人生长激素已拥有十分广阔的市场需求开发前景。

人生长激素缺乏所致原垂体侏儒症是儿童身材矮小的原因之一，因身材矮小，往往使儿童的身心发育受到严重影响。以往此病是应用苯丙酸诺龙，绒毛膜促性腺激素等药物治疗，疗效并不理想。自从重组人生长激素问世以来该病的疗效有了很大提高(赵达亚、李晶、刘明月等，生长激素治疗垂体性侏儒症的疗效观察，中国优生与遗传杂志，2000，8(1)：99-100)。

众所周知雌激素缺乏导致骨质松的发生，雌激素替代疗法是国际上公认的治疗骨质疏松的首选疗法(唐成芳、郭三萍、李晓红等，生长激素雌激素对去势大鼠剩余牙槽骨内IGF-I表达的影响，中国骨质疏松杂志，2007，13(6)：393-397)。

陈登鸿等用改进单克隆抗体免疫亲合层析柱，分离纯化基因工程菌产生的有生物活性的重组hGH，特异性，操作简便，活性损失小产物回收率高，克服易污染、效率低、成本高的缺点(陈登鸿、严鼎，单克隆抗体亲合层析一步纯化重组人生长激素，中国免疫学杂志，2007，(12)：651)。

但是，目前临床使用的rhGH制剂普遍存在的半衰期短、给药频繁、有抗原性等缺点。为增加药物的稳定性、减小给药剂量、提高生物利用度、降低副作用已有许多研究和完善措施，李唐棣等通过制备rhGH的脂质体制剂来解决上述问题，并对其冻干工艺、粒径分布、包封率和载药等进行考察(李唐棣、梅兴国、赵应征等，重组人生长激素脂质体的制备及载药研究，中国生化药物杂志，2007，27(3)：133-136)。

目前国内使用的rhGH，都是从国外进口获得的，是通过在细菌上表达重组人生长素基因生产的人生长激素，而通过转基因植物定位表达生产重组人生长素基因生产重组的人生长激素载体，目前在国内外尚未检索到。

发明内容

本发明的目的是提供一种在烟草叶绿体表达重组人生长激素的方法及其专用表达盒。

本发明提供的可在烟草叶绿体中定位表达重组人生长激素的表达盒，包括依次串联的修饰的烟草叶绿体16s启动子，人生长激素基因和烟草叶绿体psbA终止子；所述修饰的烟草叶绿体16s启动子是在所述烟草叶绿体16s启动子的5′端添加细菌嗜菌体T7的10基因SD序列和DB区得到的启动子，所述人生长激素基因具有自GENBANK号为2688的5′端第59348295-59349930位核苷酸序列，所述烟草叶绿体psbA终止子具有自GENBANK号为3735101的5′端第535-1596位核苷酸序列。所述修饰的烟草叶绿体16s启动子是以烟草基因组为模板用核苷酸序列为序列表中序列1和序列表中序列2的引物对扩增得到的核苷酸片段。

所述修饰的烟草叶绿体16s启动子的5′端还连接有烟草叶绿体tenH-psbA基因片段；所述烟草叶绿体psbA终止子的3′端还连接有烟草叶绿体trnK-ORF509A基因片段；所述烟草叶绿体tenH-psbA基因具有自GENBANK号为3735183的5′端第5-79位核苷酸序列，烟草叶绿体trnK-ORF509A基因具有自GENBANK号为3735136的5′端第1811-4408位核苷酸序列。

所述人生长激素基因的5′端或3′端还连接有抗性筛选基因。

所述抗性筛选基因为抗壮观霉素aadA基因；所述抗壮观霉素aadA基因具有自GENBANK号为2538428的5′端第10755-11537位核苷酸序列。

所述人生长激素基因的3′端还连接有泛素蛋白基因，所述泛素蛋白基因具有自GENBANK号为164696479的5′端第1-509位核苷酸序列。

含有上述表达盒的植物重组表达载体也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的表达重组人体生长激素的方法，是利用上述的植物重组表达载体将上述的可表达人生长激素的表达盒转入烟草中，筛选获得可表达重组人生长激素的烟草，培养该可表达重组人生长激素的烟草，得到含有具有活性的重组人体生长激素的烟草。

本发明通过转基因烟草表达重组人生长素基因，在叶绿体中高表达，而在其它器官和细胞器表达量较少，这样由于烟草叶片产量丰厚，人生长激素基因在烟草叶片表达后，可以通过收获烟草叶片，从烟草叶片中大量提取重组人体生长激素，从而较经济和方便的获得大量重组人体生长激素。这种通过植物生物技术方法生产药物的方法是环保的，绿色无污染，杜绝了用细菌或动物生产可能存在的潜在的感染和抗原性等缺点。该方法可以通过构建可食用转人体生长素基因的植物使人体得到人体生长激素的补充，或者在转基因植物器官中提取纯化具有活性的重组人体生长激素表达蛋白。

本发明将人生长激素基因，并通过修饰的烟草叶绿体特异表达的16S启动子，将重组人生长素基因特异地在烟草叶绿体中高效表达获取具有活性的重组人生长素蛋白，实现了在植物中表达人基因的技术跨越，真正能够给病患者提供所需的简单方便和廉价安全的医药。

本发明的方法，表达量高，没有利用其他动物脏器产生的生长素来源的潜在交叉感染和排斥等危险，也比通过在细菌中表达提取要经济方便，生产更加容易，临床应用危险性和副作用都要小。

附图说明

图1为可表达人生长素的载体构建示意图；图中，A为含有人生长素基因HGH用于烟草转基因的经修饰的烟草叶绿体特异表达启动子MPrrn驱动人生长素基因的表达载体pSTg1H结构示意图，B为用于烟草转基因经修饰的烟草叶绿体特异表达启动子MPrrn驱动人生长素基因，并与泛素基因(UbH)连接形成人生长素-泛素融合表达载体pSTg1UbH结构示意图。

图2为可表达人生长激素的转基因烟草培养过程照片；图2中，A为利用基因枪转基因后的烟草叶片在壮观霉素抗性培养基上经抗性筛选后，绿色叶片转变为白色并形成愈伤组织，B为在愈伤组织边缘形成绿色生长点(红色箭头处)，C为绿色生长点长成幼苗(红色箭头处)，D为取幼苗叶片，切成0.5mm×0.5mm小块，并放入壮观霉素进行第二轮抗性筛选的再生幼苗。

图3为可表达人生长激素转基因烟草再生植株照片

图4为转UbH基因植株表达的人生长素蛋白检测SDS-PAGE蛋白电泳图和Western检测照片

图5为转UbH基因烟草植株中表达的人生长素蛋白活性检测照片

具体实施方式

实施例1、在烟草叶绿体中表达生产重组人生长激素

一、表达重组人生长激素重组载体的构建

1、构建人生长激素基因烟草叶绿体表达载体

1)修饰的烟草叶绿体16s启动子序列(烟草叶绿体16s基因序列号：11799)MPrrn启动子的制备：

用引物1(5’-CCC 

GCT CCC CCG CCG TCG TT，(序列表中序列1，双下划线表示的是Bgl III酶识别位点序列))和引物2(5’-CCC

 CCC TCCCTAC AAC TGT ATC CAA GCG CTT CGT ATT CGC CCG GAG TTC G)(序列表中序列2，双下划线表示的是Hind III酶识别位点序列；单下划线处为细菌嗜菌体T7的10基因SD序列和DB区，其中斜体表示的是SD序列)，以烟草(大烟草(Nicotiana tabacumvar.dayanyie)，中国农业科学院烟草研究所)叶绿体提取的基因组为模板，PCR扩增出16SrDNA基因5’启动子区150bp片段。

用BglIII、HindIII双酶切上述PCR扩增得到的片段，插入到pSK(pBluescriptSK(M13)；苏宁、孙萌、李轶女等，水稻叶绿体16S启动子克隆改造、载体构建与转化研究，植物学通报，2003，20(3)：295-301)的Bam HI、Hind III位点，构建测序载体质粒，进行序列测定，将经测序表明含有修饰后的16S烟草叶绿体核糖体RNA启动子序列(命名为MPrrn)的重组质粒命名为p16S。

2)烟草叶绿体psbA终止子(具有自GENBANK号为3735101的5′端第535-1596位核苷酸序列)的获得：

人工合成烟草叶绿体psbA终止子(具有自GENBANK号为3735101的5′端第535-1596位核苷酸序列)，合成时在烟草叶绿体psbA终止子(具有自GENBANK号为3735101的5′端第535-1596位核苷酸序列)的5′端引进Nco I酶切位点序列，3′端引进Kpn I酶切位点序列，得到含有烟草叶绿体psbA终止子的片段。

3)同源片段：烟草叶绿体trnH-psbA基因(具有自GENBANK号为3735183的5′端第5-79位核苷酸序列)和trnK-ORF509A基因(具有自GENBANK号为3735136的5′端第1811-4408位核苷酸序列)的获得

通过GenBANK搜寻到已发表公开的烟草叶绿体trnH-psbA基因和trnK-ORF509A基因，设计PCR引物，在trnH引物设计时，正向引物5′端引进Nsi I酶切位点序列，反向引物5′端引进BamH I酶切位点序列，在trnK-ORF509A引物设计时，正向引物5′端引进Bgl II酶切位点序列，反向引物5′端引进SnaB I酶切位点序列。以大烟草(Nicotiana tabacum var.Dayanyie)(中国农业科学院烟草研究所)叶片提取的烟草基因组DNA为模板DNA，分别扩增得到5′端引进NsiI酶切位点序列、3′端引进BamH I酶切位点序列的烟草叶绿体trnH-psbA基因(具有自GENBANK号为3735183的5′端第5-79位核苷酸序列)片段和5′端引进Bgl II酶切位点序列、3′端引进SnaB I酶切位点序列的trnK-ORF509A基因(具有自GENBANK号为3735136的5′端第1811-4408位核苷酸序列)

4)筛选基因：壮观霉素抗性基因aadA基因(具有自GENBANK号为2538428的5′端第10755-11537位核苷酸序列)的获得

人工合成壮观霉素抗性基因aadA基因(具有自GENBANK号为2538428的5′端第10755-11537位核苷酸序列)，合成时在其5′端引进KpnI酶切位点序列、3′端引进SacI酶切位点。

5)人生长激素(HGH)(具有自GENBANK号为2688的5′端第59348295-59349930位核苷酸序列)的获得

在GenBank中获得人生长素(HGH)基因序列，人工合成完整的全长人生长素基因，合成时在使全长人生长素基因两端带有Hind III和Sal I酶切位点序列。

6)泛素基因(Ubiquitin)(具有自GENBANK号为164696479的5′端第1-509位核苷酸序列)构建成融合基因(UbH)

人工合成泛素基因(Ubiquitin)(具有自GENBANK号为164696479的5′端第1-509位核苷酸序列)，合成时在其5′端和3′端引进Sal I酶切位点序列。

2、表达重组人生长激素的重组载体(pSTg1H)的构建：

pSTg1H是在用于转化烟草的pTRV2载体(pTRV2载体的GenBank Accesion number为AF406991)的基础上，在这个载体大框架下，填加和改造了一些元件，并插入了人生长素基因(HGH)。

pTRV2载体的GenBank Accesion number为AF406991，是在pCASS2(Journal ofGeneral Virology(1997)，78：1181-1185)载体的基础上在pCASS2的StuI-SacI位点之间克隆入用烟草响尾病毒(tobacco rattle virus(TRV))的RNA(PpK20RNA)(GenBank Z36974)的cDNA两片段1-1646和3470-3855，然后在该载体的HindIII-EcoRV处，克隆进pCAMBIA0390T-DNA载体的Hind III-Hpa I片段得到的载体(The Plant Journal(2002)30(4)：415-429)。

首先将步骤1的步骤3)获得的烟草叶绿体trnH-psbA基因用Nsi I和BamH I双酶切，插入到pTRV2的Nsi I和BamH I酶识别位点之间，得到含有烟草叶绿体同源片段trnH-psbA的重组载体，将该重组载体经过酶切和测序验证，将酶切和测序验证表明正确的含有烟草叶绿体同源片段trnH-psbA的pTRV2的重组载体命名为pTRV2-trnH。将烟草叶绿体同源片段trnK-ORF509A基因用Bgl II和SnaB I双酶切后，插入到pTRV2-trnH的Bgl II和SnaB I酶识别位点之间，得到含有烟草叶绿体同源片段trnK-ORF509A基因的重组载体，将该重组载体经过酶切和测序验证，将酶切和测序验证表明正确的含有烟草叶绿体同源片段trnK-ORF509A基因的pTRV2-trnH的重组载体命名为pTRV2-trnH-trnK。

将步骤1的步骤1)得到的含有MPrrn启动子的质粒p16S经EcoRI、Xba I双酶切切出经修饰的16S启动子MPrrn，插入到pTRV2-trnH-trnK的EcoR I和XbaI酶识别位点之间(即插入到pTRV2-trnH-trnK载体的trnK-ORF509A和trnH-psbA基因之间)，得到含有MPrrn启动子的重组载体，将该重组载体经过酶切和测序验证，将酶切和测序验证表明正确的trnK-ORF509A和trnH-psbA基因之间插入了MPrrn启动子的pTRV2-trnH-trnK的重组载体命名为pTRV2-trnHK-MPrrn。

将步骤1中步骤2)得到的烟草叶绿体psbA终止子用Nco I和Kpn I双酶切，回收烟草叶绿体psbA终止子片段，插入到pTRV2-trnHK-MPrrn的Nco I和Kpn I酶识别位点之间，得到含有烟草叶绿体psbA终止子的重组载体，将该重组载体经过酶切和测序验证，将酶切和测序验证表明正确的含有烟草叶绿体psbA终止子的pTRV2-trnHK-MPrrn的重组载体命名为pTRV2-trnHK-MPrrn-psbA。

将步骤1中步骤4)得到的壮观霉素抗性基因aadA用Kpn I和Sac I双酶切，回收壮观霉素抗性基因aadA片段，插入到pTRV2-trnHK-MPrrn-psbA的Kpn I和SacI酶识别位点之间，得到含有壮观霉素抗性基因aadA的重组载体，将该重组载体经过酶切和测序验证，将酶切和测序验证表明正确的含有壮观霉素抗性基因aadA的pTRV2-trnHK-MPrrn-psbA的重组载体命名为pTRV2-trnHK-MPrrn-psbA-aadA。

将步骤1中步骤5)得到的人生长激素(HGH)片段用Hind III和SalI双酶切后，回收人生长激素(HGH)片段，插入到pTRV2-trnHK-MPrrn-psbA-aadA的Hind III和SalI酶识别位点之间，得到在启动子Mprrn之后，烟草叶绿体终止子(TpsbA)之前插入了人生长素基因HGH的重组载体，将该重组载体经过酶切和测序验证，将酶切和测序验证表明正确的含有人生长素基因HGH的pTRV2-trnHK-MPrrn-psbA-aadA的重组载体命名为pSTg1H，其结构简图如图1中的A所示。

3、人生长素基因HGH与泛素蛋白基因(Ubiquitin)融合表达的叶绿体表达载体(pSTg1UbH)

将步骤1的步骤6)得到的得到的泛素蛋白基因(Ubiquitin)用Sal I酶切后，插入到pSTg1H的Sal I酶识别位点，测序确定正确插入方向后，得到含有人生长素基因HGH与泛素蛋白基因(Ubiquitin)的重组表达载体，将其命名为pSTg1UbH，其结构简图如图1中的B所示。

重组载体pSTg1H和pSTg1UbH是环状的，通常在细菌中存在的质粒DNA，转基因用的环状质粒DNA，含有可以自主将一段DNA(T-DNA)，从环状质粒DNA上断裂，并转移整合到植物基因组上的特性，利用这一特性，通过基因枪轰击，将这个载体送入烟草原生质体细胞，获得含有这个质粒烟草细胞，而后T-DNA断裂，并自主整合到烟草基因组中。

重组载体pSTg1H和pSTg1UbH中，烟草叶片叶绿体中表达的启动子和人体生长激素基因片段连接在T-DNA区段，使的这个在烟草叶片叶绿体中表达的启动子驱动人体生长素基因。这样当T-DNA片段整合到烟草基因组中后，在烟草叶片叶绿体中，由只在烟草叶片叶绿体中特异表达启动子驱动的人体生长激素基因就表达产生人体生长激素。同时在这个质粒上还含有抗壮观霉素的基因，这个基因和人体生长激素基因一同转化进入烟草细胞，这样在转化后，通过在含有壮观霉素抗生素的培养基上培养的转化后的烟草细胞，或者在含有壮观霉素的培养基质中生长转化后的烟草幼苗时，T-DNA没有整合进入烟草基因组的细胞和幼苗，在壮观霉素的抑制下，都会停止生长，并最终死亡。通过这个过程，T-DNA整合进入烟草基因组的需要的转基因烟草细胞和由此细胞发育生长成的幼苗，就为转基因幼苗。这些幼苗的成长的植株的叶片就能表达生产人体生长激素。

二、可表达重组人生长激素的转基因烟草的获得

将人生长激素基因表达盒插入到烟草基因组中，使人生长激素基因表达在烟草叶绿体中表达，具体方法如下所述：

1)基因枪转化：

取培养4-6叶期的野生型大烟草(Nicotiana tabacum var.dayanyie)无菌苗叶片进行基因枪转化，分别将上述构建好的重组载体pSTg1H或pSTg1UbH转化烟草外植体。参照(Daniell H，In the methods in enzymology，Academic Press，London，New York，1993，217，536-554)的方法制备金粉-载体DNA子弹；采用美国Bio-rad公司的PDS-100/He型号基因枪(Model PDS100/He Biolistic particle deliverysystem)轰击烟草叶片；采用参数为：真空度in.Hg(1in＝2.45cm)，轰击距离为9cm可裂膜为110psi(1psi＝0.155cm)、金粉颗粒直径1μm；取生长于MS无菌烟草幼苗叶片(直径约3cm)作为外植体，放于MS培养基中央，进行轰击(苏宁，孙萌，杨波等，双价抗虫基因叶绿体共转化植株抗虫性及其后代表型分析，遗传，2002，24(3)：288-292)。

2)过渡培养和筛选培养：

经基因枪轰击的叶片分别在MS培养基中过渡培养，将叶片置于光照培养箱(25℃)2天后，切成5mm²见方的小片，放在选择分化培养基(MS+0.15mg/L 6-BA+500mg/L壮观霉素)上培养，经选择分化培养基培养2周小叶块开始逐渐由绿变白(图2中A)，继续培养约5-8周，在叶块边缘长出绿色小芽(生长点，图2中B)，待绿芽长大后切下，移入选择生根培养基(MS+500mg/L壮观霉素)中，约3-4周后，可长成小植株(图2中C)，练苗后，移入温室培养。

按照上述方法进行第二轮抗性筛选生根培养得到再生幼苗(图2中D)。图2中，A为利用基因枪转基因后的烟草叶片在壮观霉素抗性培养基上经抗性筛选后，绿色叶片转变为白色并形成愈伤组织，B为在愈伤组织边缘形成绿色生长点(红色箭头处)，C为绿色生长点长成幼苗(红色箭头处)，D为取幼苗叶片，切成0.5mm×0.5mm小块，并放入壮观霉素进行第二轮抗性筛选的再生幼苗。

按照上述方法进行3-4轮壮观霉素抗性筛选培养，得到用带有人生长素基因的质粒pSTg1H转化烟草后获得的转人生长激素基因(HGH)的烟草植株和用带有人生长素基因与泛素融合表达载体pSTg1UbH转化烟草后获得的转人生长激素基因和泛素基因(Ubiquitin)的融合基因(UbH)的烟草植株，将转人生长激素基因(HGH)烟草植株和转人生长激素基因和泛素基因(Ubiquitin)的融合基因(UbH)烟草植株转入温室生长。

3)同质化幼苗选择：

由于每个植物叶片细胞中含有3000-12,000个叶绿体拷贝，因此经上述抗性培养基筛选获得的幼苗被转化的叶绿体拷贝只占少数，幼苗为异质化(转化与未转化叶绿体组成的嵌合体)的叶绿体转化植株，即转化叶绿体和未被转化的野生型叶绿体同时存在(嵌合体)(苏宁，孙萌，杨波等，双价抗虫基因叶绿体共转化植株抗虫性及其后代表型分析，遗传，2002，24(3)：288-292)。

目前通常采用在抗性培养基中多次筛选的方法来实现同质化(所有叶绿体都是转基因的)。

将上述过渡培养和筛选培养的初次筛选获得的pSTg1H转化烟草后的转人生长激素基因(HGH)的烟草植株和pSTg1UbH转化烟草后的转人生长激素基因和泛素基因(Ubiquitin)的融合基因(UbH)的烟草植株幼苗叶片再次切割成0.5mm×0.5mm的小叶块，放于选择分化培养基(MS+0.15mg/L 6-BA+500mg/L壮观霉素)中进行继代培养，继代培养的条件为培养温度28℃，光培养，诱导生成愈伤，将愈伤组织上产生的小芽放入选择生根培养基(MS+500mg/L壮观霉素)中在培养温度28℃的条件下，继续光照培养得到增加了叶绿体同质化程度的幼苗。第一次继代培养获得的第一代转化再生植株，如图3中A所示，将第一代叶片继续按照上述方法进行第二代继代抗性筛选(图3中B)。然后按照上述方法进行第三次继代抗性筛选，依此类推。转基因植株筛选到第四代，进行同质化程度检测，经4-6轮抗性筛选，获得同质化的转UbH烟草植株(用pSTg1UbH转化得到的表达人生长激素基因的烟草)和同质化的转HGH烟草植株(用pSTg1H转化得到的表达人生长激素基因的烟草)。图3中A为第一次继代培养后的转基因植株在生根培养基中的生根培养，图3中B为将第一代转基因植株叶片剪成0.5mm×0.5mm小块，进行第二次继代抗性筛选。

三、转基因烟草中重组人生长素蛋白检测

提取步骤二中获得的同质化的转UbH植株或转HGH烟草植株叶片分别提取可溶性总蛋白，进行蛋白电泳，以未转基因野生型大烟草植株(Nicotiana tabacum var.dayanyie)为对照，结果表明，转UbH基因植株和转HGH烟草植株均显示出很显著的目标蛋白(30kD)表达带，而对照的未转基因植株没有这个转基因植株的特异表达带。其中，转UbH基因植株的SDS-PAGE蛋白电泳图如图4中A所示，图4中A中泳道M为Marker，泳道wt为未转基因烟草植株可溶性总蛋白，其他泳道为不同同质化的转UbH植株的可溶性总蛋白。

对同质化的转UbH植株和同质化的转HGH烟草植株表达的蛋白进行Western检测，结果表明所有同质化得到的转UbH植株和转HGH烟草植株均得到人生长素(HGH)表达蛋白的抗体反应条带。其中，同质化得到的转UbH植株表达蛋白的抗体反应条带大小为30kD(图4中B)。图4中B中，泳道M为Marker，泳道wt为未转基因烟草植株，其他泳道为不同同质化的转UbH植株。

四、转基因烟草中重组人生长素蛋白生物活性检测

以生长激素具有增加细胞数量的生物功能为依据，进行了表达蛋白活性检测试验。

取含有80微克同质化的转UbH植株(8号植株)的可溶性总蛋白的蛋白提取液、或含有80微克野生型植株叶片可溶性总蛋白的蛋白提取液分别处理NIH/3T3纤维脊索细胞(fibroblast cells)，待处理NIH/3T3纤维脊索细胞(fibroblast cells)初始细胞个数相同，24小时后由细胞自动记数议检测细胞数量。并取相同体积蛋白提取液处理细胞做为对照(目的是为了消除蛋白提取液对细胞生长产生可能影响)。

结果表明经转UbH植株(8号植株)叶片可溶性总蛋白处理NIH/3T3纤维脊索细胞细胞24小时后的NIH/3T3纤维脊索细胞细胞数量为每200ul培养液有3691个细胞，野生型烟草叶片可溶性总蛋白处理细胞24小时后细胞数目为每200ul培养液有2685个细胞，用相同体积蛋白提取溶液(对照)处理细胞24小时后细胞数目为每200ul培养液有2859个细胞，结果表明经转UbH植株(8号植株)叶片可溶性总蛋白处理比野生型植株叶片可溶性总蛋白处理细胞的细胞数量增加37.4％，经野生型植株总蛋白处理的细胞比单独用提取液的细胞数量有所降低，可能与烟草自身蛋白或酚类物质有关。从活性检测结果可以看出，烟草叶绿体表达的UbH融合蛋白具有生长激素所共有的能促进细胞生长的生物活性。

图5中，A为相同体积蛋白提取液处理细胞24小时后，自动记数仪记录细胞数量的显示结果，B为野生型烟草叶片可溶性总蛋白(TSP)(80ug)处理细胞24小时后，自动记数仪记录细胞数量的显示结果，C为同质化转UbH基因烟草植株第8号植株叶片可溶性总蛋白(80ug)处理细胞24小时后，自动记数仪记录细胞数量的显示结果。

表1.转UbH基因烟草植株中表达的人生长素蛋白活性检测

	对照	转UbH植株	野生型烟草
				可溶性总蛋白(TSP)	0ug	80ug	80ug
细胞数量(个/200ul)	2859	3691	2685

提取转HGH植株的可溶性总蛋白，含有80微克同质化的转HGH植株的可溶性总蛋白的蛋白提取液按照上述方法处理NIH/3T3纤维脊索细胞(fibroblast cells)，结果表明转HGH植株的可溶性总蛋白也具有生长激素所共有的能促进细胞生长的生物活性。

序列表

<160>2

<210>1

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

cccagatctg ctcccccgcc gtcgtt                                     26

<210>2

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

cccaagcttc cctccctaca actgtatcca agcgcttcgt attcgcccgg agttcg    56

Claims (8)

1. 可在烟草叶绿体中定位表达重组人生长激素的表达盒，包括依次串联的修饰的烟草叶绿体16s启动子，人生长激素基因和烟草叶绿体psbA终止子；所述修饰的烟草叶绿体16s启动子是在所述烟草叶绿体16s启动子的5′端添加细菌嗜菌体T7的10基因SD序列和DB区得到的启动子，所述人生长激素基因具有自GENBANK号为2688的5′端第59348295-59349930位核苷酸序列，所述烟草叶绿体psbA终止子具有自GENBANK号为3735101的5′端第535-1596位核苷酸序列。

2. 根据权利要求1所述的表达盒，其特征在于：所述修饰的烟草叶绿体16s启动子是以烟草基因组为模板用核苷酸序列为序列表中序列1和序列表中序列2的引物对扩增得到的核苷酸片段。

3. 根据权利要求1或2所述的表达盒，其特征在于：所述修饰的烟草叶绿体16s启动子的5′端还连接有烟草叶绿体tenH-psbA基因片段；所述烟草叶绿体psbA终止子的3′端还连接有烟草叶绿体trnK-ORF509A基因片段；所述烟草叶绿体tenH-psbA基因具有自GENBANK号为3735183的5′端第5-79位核苷酸序列，烟草叶绿体trnK-ORF509A基因具有自GENBANK号为3735136的5′端第1811-4408位核苷酸序列。

4. 根据权利要求3所述的表达盒，其特征在于：所述人生长激素基因的5′端或3′端还连接有抗性筛选基因。

5. 根据权利要求4所述的表达盒，其特征在于：所述抗性筛选基因为抗壮观霉素aadA基因；所述抗壮观霉素aadA基因具有自GENBANK号为2538428的5′端第10755-11537位核苷酸序列。

6. 根据权利要求5所述的表达盒，其特征在于：所述人生长激素基因的3′端还连接有泛素蛋白基因，所述泛素蛋白基因具有自GENBANK号为164696479的5′端第1-509位核苷酸序列。

7. 含有权利要求1-6中任意一项所述表达盒的植物重组表达载体。

8. 一种表达重组人体生长激素的方法，是利用权利要求5所述的植物重组表达载体将权利要求1-6中任意一项所述的可表达人生长激素的表达盒转入烟草中，筛选获得可表达重组人生长激素的烟草，培养该可表达重组人生长激素的烟草，得到含有具有活性的重组人体生长激素的烟草。

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