CN107400671A

CN107400671A - 梨果实糖转运蛋白基因PbTMT4及其应用

Info

Publication number: CN107400671A
Application number: CN201710796215.2A
Authority: CN
Inventors: 张虎平; 张绍铃; 程瑞; 吴巨友; 程寅胜; 吴俊�; 王鹏; 齐开杰
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2017-04-25
Filing date: 2017-09-06
Publication date: 2017-11-28
Anticipated expiration: 2037-09-06
Also published as: CN107400671B

Abstract

本发明公开了梨果实糖转运蛋白基因PbTMT4及其应用。一种梨果实糖转运蛋白基因PbTMT4，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。过表达梨PbTMT4基因的番茄植株明显提前开花并结果，果实的含糖量显著高于野生型番茄。说明本发明所述的梨果实糖转运蛋白基因PbTMT4可在构建提早开花的转基因植物和提高植物果实糖含量中应用。

Description

梨果实糖转运蛋白基因PbTMT4及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及梨果实糖转运蛋白基因PbTMT4及其应用。

背景技术

糖是果实生长发育的基础物质，也是评价果实品质的重要指标。同时，糖作为一种信号分子，参与了多种代谢及激素通路(Ljung et al.,2015)，调控植物的生长发育及基因表达(Wind et al.,2010)。

液泡是植物糖分积累的重要器官。通常情况下，液泡积累的还原糖约占游离己糖的90％，仅有少量的己糖存在于细胞质中(Voitsekhovskaja et al.,2006)。液泡积累糖分的能力主要受定位于液泡膜的糖转运蛋白调控，目前模式植物拟南芥中己鉴定出的定位于液泡膜的糖转运蛋白主要有液泡膜单糖转运蛋白(TMT)(Wormit et al.,2006)和葡萄糖转运蛋白(vGT) (Wingenter et al.,2010)。其中液泡膜单糖转运蛋白(TMT)亚家族作为液泡膜上重要的糖转运蛋白载体，近年来一直是研究的热点。研究表明，AtTMT1和AtTMT2在拟南芥中定位于液泡膜，主要负责葡萄糖(Wormit et al.,2006)、蔗糖(Schulz et al.,2011)等在液泡中的积累，同时参与了低温、干旱等逆境条件下胞内糖的分配和积累(Wormit etal.,2006)。敲除拟南芥AtTMT1、AtTMT2能降低葡萄糖、果糖以及蔗糖在液泡中的积累(Wingenter et al., 2010；Schulz et al.,2011)。葡萄VvTMT1和VvTMT2在葡萄的果实中表达较高，与果实发育过程中糖的积累成正相关(Afoufa-Bastien et al.,2010；Zeng etal.,2011)。苹果MdTMT1 和MdTMT2对果糖和蔗糖有较高的转运能力，且参与了苹果成熟期糖分的积累(马新立等， 2014)。Cho等(2010)对水稻OsTMT进行研究表明，OsTMT在液泡葡萄糖积累过程中起重要作用。Zheng等(2014)从甜橙中鉴定出CsTMT基因家族成员，但未对其功能进行研究。

梨(Pyrus)是重要的大宗水果，果实的糖分积累水平直接影响果实的甜度和口感，目前对梨果实糖分积累机制尚不清楚。Zhang等(2013)对中国白梨果实蔗糖转运蛋白进行研究，克隆出蔗糖转运蛋白基因PbSUT1；Ito等(2012)对日本砂梨中的山梨醇转运蛋白PpSOT2 和PpSOT3进行研究，结果表明，糖含量的增加以及蔗糖合成酶和酸性转化酶活性增加都能促使PpSOT2的表达，山梨醇脱氢酶活性增加促进PpSOT3的表达。戴美松等(2015)在转录组水平上分析了砂梨果实山梨醇转运蛋白基因的表达。Li等(2015)从梨基因组中鉴定出175个糖转运蛋白基因，但它们的功能和作用机制不清楚。

液泡作为梨果实细胞中糖分贮藏的重要器官，定位在液泡膜上的糖转运蛋白对果实液泡中的糖分积累起关键性作用。TMT基因家族是液泡膜上重要的糖转运蛋白家族，拟南芥、水稻、葡萄和苹果等物种中已有相关报道，而对于梨中TMT的研究几乎没有见到报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供梨果实糖转运蛋白基因PbTMT4及其应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种梨果实糖转运蛋白基因PbTMT4，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明所述的梨果实糖转运蛋白基因PbTMT4编码的蛋白，氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

含有所述的梨果实糖转运蛋白基因PbTMT4的重组表达载体。

所述的重组表达载体优选将PbTMT4基因插入pBI121质粒的Xba I和Kpn I酶切位点之间所得。

含有本发明所述的梨果实糖转运蛋白基因PbTMT4的重组菌。

本发明所述的梨果实糖转运蛋白基因PbTMT4在构建提早开花的转基因植物中的应用。

本发明所述的梨果实糖转运蛋白基因PbTMT4在提高植物果实糖含量中的应用。

过表达梨PbTMT4基因的番茄植株明显提前开花并结果，果实的含糖量显著高于野生型番茄。说明PbTMT4不仅能提高果实糖分含量，还能促进植物的生殖生长。

有益效果：

(1)本发明克隆的梨PbTMT4基因与果实成熟过程中糖积累显著相关，其定位于液泡膜，能促进葡萄糖、果糖、蔗糖等进入液泡的运输，在提高果实品质的基因工程方面有重要的应用价值。

(2)本发明利用转基因技术得到的番茄植株提早开花40～50天，为植物花期调控提供了重要的基因资源。

附图说明

图1为本发明技术路线图。

图2为梨PbTMT基因在梨不同组织中的qRT-PCR分析。以‘鸭梨’为试材，采集根、茎、幼叶、成熟叶、花、幼果、成熟果和种子为样品，所有样品采后均放到冰盒中尽快带回实验室，处理后放到液氮中速冻，保存到-80℃冰箱中备用。每个样品的数据均由3个重复的平均值±SD 来评价。

图3为梨PbTMT在梨果实发育过程中的qRT-PCR分析和果实发育过程中可溶性糖含量变化。A：PbTMT的相对表达量；B：果实含糖量。每个样品的数据均由3个重复的平均值±SD来评价。

图4为本发明克隆的梨PbTMT4基因的琼脂糖凝胶电泳图。1：本发明克隆的梨PbTMT4基因；2：Marker。

图5为本发明克隆的梨PbTMT4基因编码蛋白拓扑结构示意图。跨膜结构利用在线工具 TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)进行分析，跨膜模型利用软件TMRPRES2d 构建。

图6为本发明克隆的梨PbTMT4基因重组表达载体构建流程。

图7为本发明克隆的梨PbTMT4基因转基因植株PCR鉴定结果。1：质粒(阳性对照)；2： H₂O(阴性对照1)；3：野生型番茄(阴性对照2)；4～6：阳性转基因株系；7：Marker。

图8为本发明克隆的梨PbTMT4基因在转基因番茄植株中的表达量分析。1：阳性转基因株系；2：野生型番茄(对照)。

图9为本发明克隆的梨PbTMT4基因在番茄植株中过量表达对植株生长的影响。A：转基因番茄开花状；B：转基因番茄结果状。

图10为本发明克隆的梨PbTMT4基因在番茄植株中过量表达对果实糖含量的影响。**表示差异达极显著水平(P＜0.01)，*表示差异达显著水平(P＜0.05)。

图11为本发明克隆的梨PbTMT4基因酵母互补功能验证。A：野生型酵母菌株CEN.PK2-1C； B：pYES2.0-PbTMT4转入酵母突变体EBY.VW4000中；C：空载pYES2.0转入酵母突变体 EBY.VW4000中；D：酵母突变体EBY.VW4000。(Ⅰ)葡萄糖；(Ⅱ)果糖；(Ⅲ)蔗糖；(Ⅳ)山梨醇；(Ⅴ)麦芽糖；从左往右菌液浓度稀释倍数依次为1:10:100:1000。

图12为亚细胞定位载体p1300-35S-GFP-BS2图谱。

图13为本发明克隆的梨PbTMT4基因亚细胞定位。A：绿色荧光蛋白GFP在拟南芥原生质体的荧光图像；B：PbTMT4-GFP在拟南芥原生质体的荧光图像；C：红色区域代表叶绿体自发荧光；D：拟南芥原生质体明场图像；E：B、C、D叠加后的图像。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1梨TMT家族基因筛选及信息分析

以拟南芥AtTMT1(At1g20840)、AtTMT2(At4g35300)、AtTMT3(At3g51490)的蛋白序列为模板分别在拟南芥基因组数据库和梨基因组数据库(http://peargenome.njau.edu.cn/)中进行Blastp，获得同源基因序列。将获得的同源序列分别与各物种同源序列利用软件MEGA6.0 构建系统进化树进行聚类分析，与拟南芥TMT家族基因聚为一类的为候选基因。通过Pfam数据库(http://pfam.xfam.org/)分析所有候选基因保守结构域，移除与TMT家族基因保守结构域不一致的序列，并在NCBI保守结构数据库CCD(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)中进一步验证保守结构域，最后获得6个梨的TMT基因并进行命名(表1)。

表1梨TMT基因基本信息

实施例2梨PbTMT基因表达模式分析

以‘鸭梨’为试材，采集根、茎、幼叶、成熟叶、花、幼果(盛花后30d)、成熟果(盛花后150d)和种子为样品，提取总RNA并反转录，所得的第一链cDNA用于扩增PbTMT基因。

利用CTAB法(CTAB提取缓冲液包括2％CTAB、2％PVP K-30、0.05％亚精胺、10mMTris·HCl (pH＝8.0)、25mM EDTA、2M NaCl)提取总RNA，取1μg RNA样品，经1U DNase I(购自 Fermentas公司)37℃孵育30min，结束后立即置于冰上5min，加入1μL EDTA(25mM) 65℃孵育30min。第一链cDNA的合成用One-Step RT-PCR SuperMix反转录试剂盒(购自北京全式金生物技术有限公司)，按照试剂盒说明书操作。

用梨Tubulin(No.AB239681)为内参基因，引物的核苷酸序列如下：

正向引物TUB-F：5’-TGGGCTTTGCTCCTCTTAC-3’(SEQ ID NO.5)，反向引物TUB-R：5’-CCTTCGTGCTCATCTTACC-3’(SEQ ID NO.6)。

利用软件Primer premier 5.0在PbTMT1～PbTMT6的开放阅读框内特异的区间序列设计 qRT-PCR引物对分别如下：

正向引物PbTMT1-F：5’-TAGTCAGGATCCGGCTGACA-3’(SEQ ID NO.7)，反向引物PbTMT1-R： 5’-TACCATGCTTCCTTGGCGAG-3’(SEQ ID NO.8)；

正向引物PbTMT2-F：5’-GCCAAGTTGGAGGTTGATGC-3’(SEQ ID NO.9)，反向引物PbTMT2-R： 5’-CTTCCACGCAGCCTCTGTAG-3’(SEQ ID NO.10)；

正向引物PbTMT3-F：5’-GCCAAGTTGGAGGTTGATGC-3’(SEQ ID NO.11)，反向引物PbTMT3-R： 5’-CTTCCACGCAGCCTCTGTAG-3’(SEQ ID NO.12)；

正向引物PbTMT4-F2：5’-TGAGCAAATCGGCTCTGTACT-3’(SEQ ID NO.13)，反向引物PbTMT4-R2：5’-CATGCTTCACTCCGGGTTCA-3’(SEQ ID NO.14)；

正向引物PbTMT5-F：5’-AGGAGGGTGCACTTGAGTCT-3’(SEQ ID NO.15)，反向引物PbTMT5-R： 5’-CTTTCCTTCTCCGCGATGC-3’(SEQ ID NO.16)；

正向引物PbTMT6-F：5’-CCTTAGTTCCACCTCTTCATCT-3’(SEQ ID NO.17)，反向引物PbTMT6-R：5’-AGTCAGCAACAGCGACCTTC-3’(SEQ ID NO.18)。

qRT-PCR采用LightCycler 480SYBR Green I Maste试剂盒(购自Roche公司)，按照试剂盒操作说明书操作。20μL qRT-PCR反应体系包括：10μL SYBR Green I Master，0.4μL 正向引物，0.4μL反向引物，1μL cDNA，8.2μL无菌双蒸水。使用96孔qRT-PCR板(购自Roche公司)，运用qRT-PCR仪(型号：LightCycler 480Ⅱ，Roche公司)进行PCR。qRT-PCR 反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸20s，共55个循环；72℃10min；20℃10min。每个cDNA样品重复3次，计算出每个cDNA样品的Ct值，通过采用2^-ΔΔCt法得出这些基因的相对表达量。

qRT-PCR分析梨PbTMT基因在不同组织中的相对表达量见图2，结果表明，梨PbTMT4基因在成熟果实中有较高的表达丰度，且明显高于其他PbTMT基因。

实施例3梨PbTMT基因表达及与果实糖积累的关系

1、梨PbTMT基因在梨果实发育过程中的qRT-PCR分析

以‘鸭梨’为试材，从盛花后10d开始采集果实样品，每20d采一次样直至果实成熟，果肉样品用液氮处理，-80℃保存。

梨果肉总RNA提取、cDNA合成的方法，以及梨PbTMT每个基因的qRT-PCR所用引物和反应条件均同实施例2。

qRT-PCR分析梨果实发育过程中PbTMT基因的相对表达量见图3A。

2、梨果实发育过程中可溶性糖含量变化

可溶性糖的提取步骤如下：准确称取2.0g果肉组织于预冷的研钵中，加入液氮充分研磨成粉末。将粉末转入10mL的离心管中，加入7mL 80％的乙醇，37℃水浴30min，超声波提取15min，12000rpm离心15min，上清液转入25mL的容量瓶中，重复提取3次，合并上清液并定容。取25mL提取液，用旋转蒸发仪(型号：RE-3000，上海亚荣生化仪器厂)蒸干，然后用1mL超纯水超声波洗涤溶解，最后用0.45μm Sep-Pak水系微孔滤膜过滤，滤液即用于测定可溶性糖的含量。可溶性糖含量的测定采用高效液相色谱柱法(HPLC)，高效液相色谱仪为Waters1525系统，采用碳水化合物柱(Transgenomic COREGET-87C；7.8×300mm，5μm)，外加保护柱(Transgenomic CARB Sep Coregel 87C cartridge)，检测器为Waters2414示差检测器，参比池和色谱柱的温度分别控制在35℃和85℃。流动相为脱气后、经0.45μm Sep-Pak水系微孔滤膜过滤超纯水，流速为1.0mL·min^-1，进样量为5μL。根据样品峰面积和各碳水化合物的标准曲线计算其含量。标准样品均购自Sigma化学制品公司(St,Louis,MO,USA)。

梨果实发育过程中果实的可溶性糖含量见图3B。

基因表达量和果实糖含量之间的相关性通过Pearson相关性分析方法计算得来，统计分析使用SPSS 16.0软件和Excel来完成。相关性分析结果表明PbTMT4基因的相对表达量与葡萄糖、果糖、蔗糖、山梨醇、总糖含量均呈显著正相关，其中与葡萄糖相关系数最大(表2)，表明本发明克隆的梨PbTMT4基因与糖分积累高度相关，是梨果实中糖转运蛋白重要候选基因。

表2梨果实发育过程中PbTMT4基因表达与可溶性糖含量的相关性分析

**表示差异达极显著水平(P＜0.01)，*表示差异达显著水平(P＜0.05)。

实施例4梨果实PbTMT4基因的克隆

以盛花后30天的‘鸭梨’果实为试材，提取果肉总RNA并反转录，所得的第一链cDNA用于扩增PbTMT4基因。

梨果肉总RNA提取、cDNA合成及引物设计方法同实施例2。扩增引物为：正向引物PbTMT4-F1：5’-ATGAGTGGAGCTGTTCTTGTTG-3’(SEQ ID NO.3)；反向引物PbTMT4-R1： 5’-TTAATTGTTCTTGGCAGCTGAAGC-3’(SEQ ID NO.4)。50μL反应体系包括：10μL 5×Phusion HFfor GC Buffer(购自NEB公司)，1μL 10mM dNTPs，2.5μL PbTMT4-F1，2.5μL PbTMT4-R1，0.5μL Phusion高保真DNA聚合酶(购自NEB公司)，1μL cDNA。PCR反应程序为：98℃预变性30s；98℃变性10s，65℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；循环完成后72℃延伸10min；4℃保存10min。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，将产生的目的条带(图4)，用凝胶试剂盒进行回收。胶回收试剂盒购买于北京康为世纪生物科技有限公司，具体操作步骤根据说明书进行。回收纯化的PCR产物与pMD19-T载体(购自TaKaRa公司)进行连接反应，连接反应体系包括：3μL回收纯化的PCR产物，1μL pMD19-T载体，1μL ddH₂O和5μL Solution I(购自TaKaRa公司)。采用热击法(参照《分子克隆实验手册》第三版，科学出版社，2002)转化大肠杆菌DH5α，在含有100mg/mL Kan的液体LB培养基中于37℃摇床振荡培养6-8h，直至菌液出现菌丝；取1μL菌液，用PbTMT4克隆引物进行PCR检测，并将阳性克隆菌液送公司测序(由苏州金唯智公司完成)。测序结果表明，本发明扩增的目的片段长度为2211bp，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，通过序列比对分析，确定该序列是本发明需要的目的基因，申请人将这个基因命名为PbTMT4。

PbTMT4基因包括2211bp的开放阅读框，编码736个氨基酸，氨基酸序列如序列SEQID NO.2 所示，预测编码蛋白质含有11个跨膜结构域和两个明显的糖转运区域，分子量为78.3kDa，等电点为5.20。通过TMHMM2.0分析表明：该PbTMT4编码的氨基酸多肽存在典型的11个α-helices跨膜区和一个中央胞质环，属于主要易化子超家族(Major facilitatorsuperfamily，MFS)中的一员(图5)，这是植物糖转运蛋白生物学功能所必需的。

实施例5梨果实PbTMT4基因超表达分析

1、构建梨PbTMT4基因的植物超表达载体

载体构建过程如图6所示。

对pBI121载体的多克隆位点和梨PbTMT4基因的核苷酸序列进行了分析，设计的正反引物的5’分别加上酶切位点Xba I和Kpn I，即得到相应的引物正向引物PbTMT4-F3和PbTMT4-R3，用于构建表达载体pBI121-PbTMT4，其引物核苷酸序列如下所示：

正向引物PbTMT4-F3：5’-gcTCTAGAATGAGTGGAGCTGTTCTTGTTG-3’(SEQ ID NO.19)，

反向引物PbTMT4-R3：5’-ggGGTACCTTAATTGTTCTTGGCAGCTGAAGC-3’(SEQ IDNO.20)。

小写字母为保护碱基。下划线为酶切位点，TCTAGA为Xba I酶切位点，GGTACC为KpnI 酶切位点。

用含有100mg/L氨苄青霉素的液体LB培养基悬浮培养pMD19-T-PbTMT4重组质粒的大肠杆菌DH5α，37℃、220rpm振荡培养12h。提取pMD19-T-PbTMT4重组质粒作为模板进行PCR扩增，25μL反应体系包括：1×LA PCR Buffer II(Mg²⁺free)(购自TaKaRa公司)，2.5mMMCl₂，0.4mM dNTPs，0.4μM正向引物PbTMT4-F1，0.4μM反向引物PbTMT4-R1，100ng 重组质粒，1.25U TaKaRa LA Taq聚合酶(购自TaKaRa公司)。PCR反应程序为：94℃预变性 5min；94℃变性30s，59℃退火40s，72℃延伸2min，35个循环；循环完成后72℃延伸 10min。目的片段的回收纯化、目的片段与pMD19-T载体的连接、阳性克隆的获得与测序，均同实施例3。测序正确的结果包括上游酶切位点Xba I、PbTMT4基因和下游酶切位点Kpn I。最终获得含有酶切位点Xba I和Kpn I的重组质粒pMD19-T-PbTMT4。

分别提取含酶切位点和目的基因的重组质粒和pBI121的质粒进行双酶切。40μL双酶切体系包括：质粒10μL，10×Buffer(购自TaKaRa公司)4μL，Xba I和Kpn I各1μL，无菌水24μL。37℃孵育2h后，通过1％凝胶电泳纯化回收目的基因和pBI121载体。连接反应体系包括：pBI121载体2μL，PbTMT4基因6μL，10×T4DNA连接缓冲液(购自TaKaRa公司)1μL， T4DNA连接酶(购自TaKaRa公司)1μL。37℃孵育14-16h。取10μL连接产物，采用热击法转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L卡那霉素的固体LB平板中筛选阳性克隆，进行测序(由苏州金唯智公司完成)。测序正确的结果包括上游酶切位点Xba I、PbTMT4基因和下游酶切位点Kpn I，且无核苷酸变异。同时提取pBI121-PbTMT4重组载体进行双酶切验证，双酶切体系同上。获得含有插入PbTMT4基因的重组载体，将其命名为“pBI121-PbTMT4”重组载体，应用冻融法将重组载体“pBI121-PbTMT4”导入到农杆菌GV3101中。

2、番茄的遗传转化和转化植株分子鉴定

根癌农杆菌介导的番茄遗传转化方法参考王保全博士毕业论文(2012)，野生型番茄选择‘小汤姆’，具体遗传转化方法如下：

(1)M1的准备：按培养基配方配置培养基，培养基具体配方如表3，121℃高温高压灭菌 20min。

(2)番茄种子的播种：先用70％乙醇处理番茄种子30s，然后用无菌水洗涤3遍；再用 2.5％次氯酸钠处理5min，最后用无菌水洗涤4遍；用镊子夹取种子置于M1上。

(3)播种后一周左右准备如下东西：4个含有50mg·L^-1Kan和100mg·L^-1Rif的固体LB平板，6个M2，4瓶M3，4份大滤纸和4份小滤纸，6个M4，12瓶无菌水(三角瓶)，2 个空三角瓶，20个M5左右，手术刀和镊子，均经过高温高压灭菌。

(4)单克隆的培养：待2片子叶完全展开(需9天左右)，取-80℃冰箱中保存的pBI121-PbTMT4农杆菌表达载体，融化后，在含有50mg·L^-1Kan和100mg·L^-1Rif的固体LB平板上划线，28℃培养1天左右。

(5)大量菌体的培养：挑取单克隆菌落，在含有50mg·L^-1Kan和100mg·L^-1Rif 的固体LB平板上划“井”字线，28℃培养1天半左右。

(6)子叶的预培养：待番茄子叶相对厚实饱满，在超净工作台中切子叶，置于M2上，正面朝上，盖一张小滤纸，组培室黑暗培养1天。

(7)菌液的制备：用手术刀刮取收集菌体(5)中的菌落于M3悬浮，28℃、100rpm悬浮。

(8)侵染：悬浮期间，可先取三皿预培养的子叶置于无菌空三角瓶中，空三角瓶可事先倒入些许M3，为了保持子叶的水分。超净工作台上先取1个基因的悬浮菌液测定OD值，0.3-0.8 范围可做侵染。将OD值适宜的菌液导入盛有子叶的三角瓶，浸泡侵染8-10min，期间不断振荡。

(9)共培养(即暗培养)：将侵染后的子叶置于无菌滤纸上吸附子叶表面的大滴菌液，然后接种于M4上(正面朝上)，再盖一张小滤纸，组培室暗培养2天。

(10)筛选培养A：共培养2d后，用含有400mg·L^-1Cef的无菌水洗一遍，然后用无菌水洗3-5遍，最后置于于M5上(正面朝上)，组培室培养15d左右。

(11)筛选培养B：M5培养15d后，随后的继代培养一律用M6，每15d换一次培养基。

(12)生根培养：待子叶分化出的不定芽有明显伸长的节间，将其切下并扦插于M7中进行生根诱导。

表3番茄遗传转化体系所用的培养基

按照上述方法得到的转PbTMT4基因的番茄植株，采用小量法提取DNA的方法进行番茄遗传转化阳性鉴定。步骤如下：

(1)设计特异性引物对：引物序列同实施例4。

(2)提取番茄叶片总DNA：取适量的番茄叶片于1.5mL离心管，加适量液氮充分研磨；加入700μL 65℃预热的DNA提取缓冲液[提取缓冲液组成为：100mM Tris·HCl(pH＝8.0)， 1.5M NaCl，50mM EDTA(pH＝8.0)，2％十六烷基三乙基溴化铵，1％聚乙烯吡咯烷酮，4％(体积)β-巯基乙醇]，65℃水浴90min，每15min上下轻轻颠倒混匀；10000rpm离心10min，取上清，加600μL氯仿：异戊醇(24:1)，轻轻颠倒5min后静置3min；10000rpm离心15 min，取上清450μL，加入900μL预冷的无水乙醇和34μL 5M NaCl，轻轻颠倒混匀后，-20℃放置30min；10000rpm离心10min；弃上清，用1mL 75％乙醇洗涤沉淀2次，无菌风吹干，加20μL无菌双蒸水溶解。

(3)PCR扩增：反应程序为94℃3min；94℃3s,60℃30s，72℃3min，共30循环；72℃10min；4℃10min。

(4)1％琼脂糖凝胶电泳检测，能扩增出目的条带的再生番茄植株被初步鉴定为阳性转基因番茄株系。

(5)鉴定为阳性植株移栽后独立收货种子(T1代种子)，T1代种子播种后，对幼苗再次进行阳性鉴定，将不同株系鉴定为阳性的植株用于相关分子与生理指标分析。

番茄遗传转化琼脂糖凝胶电泳检测如图7所示，有目的条带的株系为阳性转PbTMT4基因番茄植株。

3、梨PbTMT4基因在番茄植株中过量表达及对植株生长的影响

本研究采用半定量RT-PCR分析转基因番茄果实中外源基因PbTMT4的表达量。转基因株系果实RNA提取和cDNA合成方法同实施例2。利用Primer Premier 5.0软件在PbTMT4基因的开放阅读框内设计基因特异的半定量RT-PCR引物对，其引物的核苷酸序列为：

正向引物PbTMT4-F4：5’-TGAGCAAATCGGCTCTGTACT-3’(SEQ ID NO.21)，

反向引物PbTMT4-R4：5’-CATGCTTCACTCCGGGTTCA-3’(SEQ ID NO.22)。

用番茄β-actin作内参基因，其引物的核苷酸序列为：

正向引物actin-F：5’-ATGGCAGACGGAGAGGATATTCA-3’(SEQ ID NO.23)，

反向引物actin-R：5’-GCCTTTGCAATCCACATCTGCTG-3’(SEQ ID NO.24)。

反应程序：94℃预变性3min，94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec， 35个循环，循环完成后72℃延伸10min。半定量PCR分析结果如图8所示，目的基因在转基因株系三个发育阶段均超量表达，野生型番茄中几乎未检测到表达量。由此可见，目的基因已经整合到了番茄植株中。通过移栽观察，转梨PbTMT4基因能促进番茄植株提前开花40～50 天(图9)，表明本发明克隆的梨PbTMT4基因参与调控植株生长发育，具有促进植株提早结果的应用价值。

4、梨PbTMT4基因在番茄植株中过量表达对可溶性糖含量的影响

为了进一步研究本发明克隆的梨PbTMT4基因对果实糖积累的影响，申请人以野生型番茄植株为对照，测定了转PbTMT4基因番茄植株果实不同成熟阶段的含糖量(图10)。测定方法采用蒽酮比色法，具体步骤参考张龙翔等编著的生化实验方法和技术一书(北京：人民教育出版社，1981)。分析结果表明，转梨PbTMT4基因能明显提高番茄果实的含糖量，与野生型番茄植株比较差异显著。

实施例6酵母互补实验

大量的研究结果表明，植物TMT载体对葡萄糖和果糖等单糖有强的转运功能。为了鉴定本发明克隆的梨PbTMT4基因对不同糖的吸收转运能力，本实施例利用酵母功能缺失互补实验进行了验证，所用的表达载体为pYES2.0，糖转运蛋白敲除的酿酒酵母突变体为EBY.VW4000(仅对麦芽糖有吸收能力)。

利用RT-PCR扩增出PbTMT4基因整个ORF，设计扩增包括ORF序列并去除终止密码子的扩增产物，再在其正反引物的5’端分别加上Kpn I和Xba I两个酶切位点，即得到带酶切位点的扩增引物：

正向引物PbTMT4-F5：5’-ggGGTACCATGAGTGGAGCTGTTCTTGTTG-3’(SEQ ID NO.25)，

反向引物PbTMT4-R5：5’-gcTCTAGATTAATTGTTCTTGGCAGCTGAAG-3’(SEQ IDNO.26)。

小写字母为保护碱基。下划线为酶切位点，GGTACC为Kpn I酶切位点，TCTAGA为XbaI 酶切位点。

首先将扩增产物装在pMD19-T载体上，从而得到重组载体pMD19-T-PbTMT4。同时使用Kpn1 和Xbal1对pYES2.0和pMD19-T-PbTMT4进行双酶切，目的基因和空载的双酶切产物分别通过 1％凝胶电泳纯化回收。回收产物PbTMT4与pYES2.0经T4-DNA连接酶连接，获得酵母表达载体pYES2.0-PbTMT4。将pYES2.0-PbTMT4、pYES2.0转入酵母突变体EBY.VW4000。转化成功后进行菌落PCR鉴定是否为阳性。

在液体的SD-Ura培养基中培养鉴定为阳性的酵母菌、酵母突变株EBY.VW4000(阴性对照)、野生型酿酒酵母菌株CEN.PK2-1C(阳性对照)直到OD600＝1.0(摇床，30℃，1d左右)；吸取1mL酵母菌液于1.5mL离心管中，快速离心，去上清；加入1mL无菌水，混匀后，再稀释成1:10、1:100和1:1000；最后吸取10μL稀释液滴到加入了不同碳源(蔗糖、葡萄糖、果糖、山梨醇、麦芽糖)的SD-Ura固体培养基中；30℃暗培养3-5天后检测对酵母生长的影响。

酵母功能互补结果表明，将本发明克隆的梨PbTMT4基因转入糖转运蛋白敲除的酿酒酵母突变体EBY.VW4000(仅对麦芽糖有吸收能力)后，酵母突变株EBY.VW4000对糖的转运功能恢复，可以在培养基上生长，对不同糖的吸收能力是：葡萄糖>果糖>蔗糖>山梨醇(图11)，证明梨PbTMT4对单糖的转运功能较强。

实施例7梨果实PbTMT4亚细胞定位

本实施例利用拟南芥原生质体转化法研究梨PbTMT4基因的亚细胞定位，载体构建流程如图6所示，所用的表达载体为p1300-35S-GFP-BS2(图12)。

利用RT-PCR扩增出PbTMT4基因整个ORF，设计扩增包括ORF序列并去除终止密码子的扩增产物，再在其正反引物的5’端分别加上Xba I和BamH I两个酶切位点，即得到带酶切位点的扩增引物：

正向引物PbTMT4-F6：5’-tgcTCTAGAATGAGTGGAGCTGTTCTTGTTG-3’(SEQ IDNO.27)，

反向引物PbTMT4-R6：5’-cgcGGATCCATTGTTCTTGGCAGCTGAAGC-3’(SEQ ID NO.28)。

小写字母为保护碱基。下划线为酶切位点，TCTAGA为Xba I酶切位点，GGATCC为BamH I 酶切位点。

首先将扩增产物装在pMD19-T载体上，从而得到重组载体pMD19-T-PbTMT4。同时使用Xba I和BamH I对p1300-35S-GFP-BS2和pMD19-T-PbTMT4进行双酶切，目的基因和空载的双酶切产物分别通过1％凝胶电泳纯化回收。回收产物PbTMT4与p1300-35S-GFP-BS2经T4-DNA连接酶连接，获得重组载体p1300-35S-PbTMT4-GFP-BS2。在确认序列无误后，通过PEG介导法，将融合载体p1300-35S-PbTMT4-GFP-BS2以及空载体转化拟南芥叶肉细胞原生质体。具体方法详见如下：

(1)选取在培养箱中短日照(8h光照，16h黑暗)条件下生长4周左右未抽薹的拟南芥叶片，利用蓝吉列手术刀片切掉两端后切成1mm的细丝，可以一边切一边从植株上摘取约6-8片，放入酶解液中(8.7mL的酶解液包含0.4M甘露醇，1％纤维素酶，0.3％离析酶，0.1％果胶酶，20mM KCl，20mM MES(pH＝5.8)，0.01％BSA，10mM CaCl₂)，在室温、黑暗条件下震荡4-6h，50rpm。

(2)酶解液经过100目的细胞筛过滤去除杂质后，用剪过的蓝枪头将液体转移10mL离心管中，室温离心10min，600rpm，弃去上清。

(3)用剪过的蓝枪头加入3mL W5溶液(含154mM NaCl，125mM CaCl₂，5mM KCl，2mMMES)，先沿着管壁加入1mL W5，轻轻地将原生质体晃起来直至无沉淀，接着再加入2mL W5，轻轻混匀；室温离心4min，600rpm，弃去上清。

(4)加入3mL MaMg溶液(含0.4M甘露醇；15mM MgCl₂；4mM MES(pH 5.8))，方法同步骤3，先加1mL MaMg轻轻地将原生质体晃起来直至无沉淀；接着再加入2mL MaMg，轻轻混匀，室温离心4min，600rpm，弃去上清；再加入1mL MaMg溶液，轻轻摇晃置于冰上，冰浴30min，室温离心4min，600rpm，弃去上清。

(5)加入0.5-1mL MaMg溶液轻轻地晃起原生质体，恢复至室温后，将100μL的原生质体分别分装到10mL的离心管中，加入10μg的目的基因质粒(质粒浓度需调至1μg/μL)，然后加入等体积的40％PEG(含40％PEG4000(m/v)，200mM甘露醇，100mM CaCl₂，KOH调节pH至7.5-8.0)，室温静置20min。PEG加入时要格外的小心，需一滴一滴缓慢加入，并且充分混匀，否则会使原生质体聚集成团。

(6)加入3mL W5溶液，方法同步骤3，室温离心4min，600rpm，弃去上清后再加入3mL W5溶液同步骤3；用锡箔纸将10mL离心管包住，于22℃培养箱中暗培养16-18h。使用激光共聚焦显微镜(Leica confocal microscope)观察荧光情况前，室温离心4min，600rpm，弃去上清，剩余约100～200μL。

亚细胞定位结果表明，对照中GFP绿色荧光充满整个原生质体，PbTMT4的融合蛋白绿色荧光呈现不规则圆形，图像中能明显看到有叶绿体自发荧光位于PbTMT4的融合蛋白绿色荧光外侧，证明PbTMT4定位在液泡膜上(图13)。

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序列表

<110> 南京农业大学

<120> 梨果实糖转运蛋白基因PbTMT4及其应用

<150> 2017102773826

<151> 2017-04-25

<160> 28

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2211

<212> DNA

<213> 梨(pear)

<400> 1

atgagtggag ctgttcttgt tgccgttgct gctgcaattg gtaacctgtt gcagggatgg 60

gacaacgcta ctatcgcagc ttctgttttg tacataaaga gggaattcaa cttggaaagc 120

gaaccagcta tggaagggct gatcgtggcc atgtcgctta tcggggcaac tgtggttaca 180

ttttgttctg gagctgtagc agactggcta ggccgccgtc ctacgctgat agtctcttct 240

gtcctttact ttcttagtgg tcttgtaatg ctgtggtctc ccaatgttta tatccttctc 300

ttggcacggc ttttagatgg atttggaatc ggtttggcgg ttaccttggt tccgctttat 360

atatctgaga cagccccgcc tgaaataagg ggatcgttga atacccttcc gcagtttctt 420

ggctctggtg ggatgttctt gtcatattgc atggtttttg ggatgtcgtt gacagagtcc 480

gcaagttgga ggttgatgct tgggattctc tctattcctt ctcttgttta tattatattg 540

actgtgttct tcttgcctga gtctccacga tggcttgtga gtaagggacg gatgcttgag 600

gctaagcaag ttttgcagag gctacgtggc agagaagatg tcgctggtga gatggcttta 660

cttgttgagg gtcttggagt tgggggtgaa acgtattttg aggagtacat aattggccca 720

gcagacgact ccgctgatga ccacgattta tctgctgaaa aggatgaaat cagattatat 780

gggcctgaac aaggacaatc ctgggttgcc aaacctgtca ccaggcaaag cactcttgga 840

cttgtgtctc gacatgcaag catggtaaat caaagtgggc ttgttgatcc tctggtctcg 900

ctctttggca gtatacatga gaagctcccc gacacaggaa gcaagggaag tatgcttttt 960

ccgcactttg gcagcatgtt cagcgtggga gggaatcagc ctagacatga agagtgggac 1020

gaggagagtg ttgccagaga aggagagggt tacgcatctg atgcagccgg tggtgattct 1080

gatgacaatt tgcacagtcc attgatctcg cgtcagacaa caagcattga aaagaacgtg 1140

ggcccacctc cccagggaag ccttgctggc atgagaaacg gcagtctcat tggtggagag 1200

ggagctagta gcaccgatat tggtggcggt tggcagctgg cgtggaaatg gtctgagaga 1260

gaaggccaag atggacacaa ggaaggaggg tttaaaagaa tttatttgca ccaggagggt 1320

gtccctgcat ctcgccatgg atctattgtt tcgatacctg gtggcgatgt accgaacgac 1380

ggtgagttca tccaggctgc tgctttggtg agcaaatcgg ctctgtactc acgtgaactt 1440

atgaatcagc atccagttgg accggcaatg gttaacccag ctgcaacttc tgcaaaaggg 1500

ccaagttgga gtgatctttt tgaacccgga gtgaagcatg ccttggctgt tggggtggga 1560

atgcagatac ttcagcagtt ttccggtata agtggggttc tctactacac gcctcaaatt 1620

cttgagcagg cgggcgttgg catccttctt tcgaacttgg gcattagttc agcttcttcg 1680

tctctgctta tcagtgcagt gacaaccttg ctgatgcttc ctagtatagc aattgccatg 1740

aggctcatgg atatagccgg cagaaggagc ttgctgcttg gcacaatccc tgtcttgata 1800

gtgtctcttg tcatcctagt cctcggaagc cttgtgaata tgggcagtgt tgtaaatgca 1860

tcagtttcga ctgtcagcgt tgtgctctac ttctgtttct ttgttatggg gtttggtcca 1920

atccccaaca tactctgtgc agaaatcttc cccaccagag ttcgaggcct ctgcattgcc 1980

atctgcgccc tcacgttttg gattggcgac atcattgtca cctactcact tccagtgatg 2040

ctcaaatctg ttggccttgc tggtgtcttt ggcatgtatg cagttgtgtc cgtcatagcg 2100

tttatcttca ttttcttgaa agttccggag accaaaggta tgccccttga agtgattacc 2160

gagtttttct ctgttggtgc gaagcaggct tcagctgcca agaacaatta a 2211

<210> 2

<211> 736

<212> PRT

<213> 梨(pear)

<400> 2

Met Ser Gly Ala Val Leu Val Ala Val Ala Ala Ala Ile Gly Asn Leu

1 5 10 15

Leu Gln Gly Trp Asp Asn Ala Thr Ile Ala Ala Ser Val Leu Tyr Ile

20 25 30

Lys Arg Glu Phe Asn Leu Glu Ser Glu Pro Ala Met Glu Gly Leu Ile

35 40 45

Val Ala Met Ser Leu Ile Gly Ala Thr Val Val Thr Phe Cys Ser Gly

50 55 60

Ala Val Ala Asp Trp Leu Gly Arg Arg Pro Thr Leu Ile Val Ser Ser

65 70 75 80

Val Leu Tyr Phe Leu Ser Gly Leu Val Met Leu Trp Ser Pro Asn Val

85 90 95

Tyr Ile Leu Leu Leu Ala Arg Leu Leu Asp Gly Phe Gly Ile Gly Leu

100 105 110

Ala Val Thr Leu Val Pro Leu Tyr Ile Ser Glu Thr Ala Pro Pro Glu

115 120 125

Ile Arg Gly Ser Leu Asn Thr Leu Pro Gln Phe Leu Gly Ser Gly Gly

130 135 140

Met Phe Leu Ser Tyr Cys Met Val Phe Gly Met Ser Leu Thr Glu Ser

145 150 155 160

Ala Ser Trp Arg Leu Met Leu Gly Ile Leu Ser Ile Pro Ser Leu Val

165 170 175

Tyr Ile Ile Leu Thr Val Phe Phe Leu Pro Glu Ser Pro Arg Trp Leu

180 185 190

Val Ser Lys Gly Arg Met Leu Glu Ala Lys Gln Val Leu Gln Arg Leu

195 200 205

Arg Gly Arg Glu Asp Val Ala Gly Glu Met Ala Leu Leu Val Glu Gly

210 215 220

Leu Gly Val Gly Gly Glu Thr Tyr Phe Glu Glu Tyr Ile Ile Gly Pro

225 230 235 240

Ala Asp Asp Ser Ala Asp Asp His Asp Leu Ser Ala Glu Lys Asp Glu

245 250 255

Ile Arg Leu Tyr Gly Pro Glu Gln Gly Gln Ser Trp Val Ala Lys Pro

260 265 270

Val Thr Arg Gln Ser Thr Leu Gly Leu Val Ser Arg His Ala Ser Met

275 280 285

Val Asn Gln Ser Gly Leu Val Asp Pro Leu Val Ser Leu Phe Gly Ser

290 295 300

Ile His Glu Lys Leu Pro Asp Thr Gly Ser Lys Gly Ser Met Leu Phe

305 310 315 320

Pro His Phe Gly Ser Met Phe Ser Val Gly Gly Asn Gln Pro Arg His

325 330 335

Glu Glu Trp Asp Glu Glu Ser Val Ala Arg Glu Gly Glu Gly Tyr Ala

340 345 350

Ser Asp Ala Ala Gly Gly Asp Ser Asp Asp Asn Leu His Ser Pro Leu

355 360 365

Ile Ser Arg Gln Thr Thr Ser Ile Glu Lys Asn Val Gly Pro Pro Pro

370 375 380

Gln Gly Ser Leu Ala Gly Met Arg Asn Gly Ser Leu Ile Gly Gly Glu

385 390 395 400

Gly Ala Ser Ser Thr Asp Ile Gly Gly Gly Trp Gln Leu Ala Trp Lys

405 410 415

Trp Ser Glu Arg Glu Gly Gln Asp Gly His Lys Glu Gly Gly Phe Lys

420 425 430

Arg Ile Tyr Leu His Gln Glu Gly Val Pro Ala Ser Arg His Gly Ser

435 440 445

Ile Val Ser Ile Pro Gly Gly Asp Val Pro Asn Asp Gly Glu Phe Ile

450 455 460

Gln Ala Ala Ala Leu Val Ser Lys Ser Ala Leu Tyr Ser Arg Glu Leu

465 470 475 480

Met Asn Gln His Pro Val Gly Pro Ala Met Val Asn Pro Ala Ala Thr

485 490 495

Ser Ala Lys Gly Pro Ser Trp Ser Asp Leu Phe Glu Pro Gly Val Lys

500 505 510

His Ala Leu Ala Val Gly Val Gly Met Gln Ile Leu Gln Gln Phe Ser

515 520 525

Gly Ile Ser Gly Val Leu Tyr Tyr Thr Pro Gln Ile Leu Glu Gln Ala

530 535 540

Gly Val Gly Ile Leu Leu Ser Asn Leu Gly Ile Ser Ser Ala Ser Ser

545 550 555 560

Ser Leu Leu Ile Ser Ala Val Thr Thr Leu Leu Met Leu Pro Ser Ile

565 570 575

Ala Ile Ala Met Arg Leu Met Asp Ile Ala Gly Arg Arg Ser Leu Leu

580 585 590

Leu Gly Thr Ile Pro Val Leu Ile Val Ser Leu Val Ile Leu Val Leu

595 600 605

Gly Ser Leu Val Asn Met Gly Ser Val Val Asn Ala Ser Val Ser Thr

610 615 620

Val Ser Val Val Leu Tyr Phe Cys Phe Phe Val Met Gly Phe Gly Pro

625 630 635 640

Ile Pro Asn Ile Leu Cys Ala Glu Ile Phe Pro Thr Arg Val Arg Gly

645 650 655

Leu Cys Ile Ala Ile Cys Ala Leu Thr Phe Trp Ile Gly Asp Ile Ile

660 665 670

Val Thr Tyr Ser Leu Pro Val Met Leu Lys Ser Val Gly Leu Ala Gly

675 680 685

Val Phe Gly Met Tyr Ala Val Val Ser Val Ile Ala Phe Ile Phe Ile

690 695 700

Phe Leu Lys Val Pro Glu Thr Lys Gly Met Pro Leu Glu Val Ile Thr

705 710 715 720

Glu Phe Phe Ser Val Gly Ala Lys Gln Ala Ser Ala Ala Lys Asn Asn

725 730 735

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgagtggag ctgttcttgt tg 22

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttaattgttc ttggcagctg aagc 24

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgggctttgc tcctcttac 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccttcgtgct catcttacc 19

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tagtcaggat ccggctgaca 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

taccatgctt ccttggcgag 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gccaagttgg aggttgatgc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cttccacgca gcctctgtag 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gccaagttgg aggttgatgc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cttccacgca gcctctgtag 20

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tgagcaaatc ggctctgtac t 21

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

catgcttcac tccgggttca 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

aggagggtgc acttgagtct 20

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ctttccttct ccgcgatgc 19

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ccttagttcc acctcttcat ct 22

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

agtcagcaac agcgaccttc 20

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gctctagaat gagtggagct gttcttgttg 30

<210> 20

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ggggtacctt aattgttctt ggcagctgaa gc 32

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tgagcaaatc ggctctgtac t 21

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

catgcttcac tccgggttca 20

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

atggcagacg gagaggatat tca 23

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gcctttgcaa tccacatctg ctg 23

<210> 25

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ggggtaccat gagtggagct gttcttgttg 30

<210> 26

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gctctagatt aattgttctt ggcagctgaa g 31

<210> 27

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

tgctctagaa tgagtggagc tgttcttgtt g 31

<210> 28

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

cgcggatcca ttgttcttgg cagctgaagc 30

Claims

1.一种梨果实糖转运蛋白基因PbTMT4，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的梨果实糖转运蛋白基因PbTMT4编码的蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求1所述的梨果实糖转运蛋白基因PbTMT4的重组表达载体。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于所述的重组表达载体是将PbTMT4基因插入pBI121质粒的Xba I和Kpn I酶切位点之间所得。

5.含有权利要求1所述的梨果实糖转运蛋白基因PbTMT4的重组菌。

6.权利要求1所述的梨果实糖转运蛋白基因PbTMT4在构建提早开花的转基因植物中的应用。

7.权利要求1所述的梨果实糖转运蛋白基因PbTMT4在提高植物果实糖含量中的应用。