CN105296502B - 梨己糖转运蛋白基因PbHT1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了梨己糖转运蛋白基因PbHT1及其应用。一种分离自‘鸭梨’果实的己糖转运蛋白PbHT1基因，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，其编码的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2所示。通过农杆菌介导遗传转化方法将PbHT1基因转化番茄，获得转基因植株，经生物学功能验证，表明本发明克隆的PbHT1基因具有花期推迟和提高果实己糖含量的功能。PbHT1基因的发现，为促进植物果实品质的分子育种提供新的基因资源。

Description

梨己糖转运蛋白基因PbHT1及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体涉及一种从梨(Pyrus bretschneideri)果实中分离、克隆得到一个编码己糖转运蛋白的基因PbHT1，还涉及一种梨己糖转运蛋白基因PbHT1在调节植株生长与果实糖分积累方面的应用。

背景技术

植物叶片光和作用产生的糖是植物生长发育的最基本营养与能量物质，它在植物源器官中合成后运输到各个库器官中贮存或吸收利用。同时，糖也具有多种多样的生物学功能，如为果实的细胞膨大提供渗透推动力，以及作为信号分子与激素等信号连成网络，其通过复杂的信号转导机制调节果实生长发育与基因表达等(Leon and Sheen,2003；陈俊伟等，2004)。植物叶片产生的光合运转糖需经短距离运输到韧皮部并装载入韧皮部，经筛管长距离运输后从韧皮部卸出；再由韧皮部后运输进入果实代谢和贮藏。库细胞中韧皮部后运输效率、糖代谢酶的种类与活力和糖的跨膜运输能力等因素决定了果实糖分的积累(Ruan and Patrick，1995)。因此，筛选果实单糖运输过程中的转运蛋白基因，有助于了解单糖转运蛋白参与的单糖运输的分子生理机制以及对果实糖分积累的影响机制，为利用基因工程的手段改善果实品质的研究提供新的基因资源。

植物体中的糖转运蛋白根据运输产物不同分为单糖转运蛋白和多糖转运蛋白，单糖转运蛋白介导多种糖的运输，如葡萄糖、果糖、麦芽糖、棉籽糖、糖醇等。所有的单糖转运蛋白都属于MFS超家族(Major Facilitator Superfamily)。植物的单糖转运蛋白(Monosaccharide transporter,MT)包括己糖转运蛋白(Hexose transporter,HT)和葡萄糖转运蛋白(Glucose transporter,GT)。在植物代谢库中单糖转运蛋白可将质外体中的己糖跨膜运输到薄壁细胞,然后经维管束运输到库。Sauer和Tanner(1989)采用差异筛选法获得了植物的第一个单糖转运蛋白CkHUP1(Sauer and Tanner，1989)。随着分子生物技术与基因组学的发展，更多的己糖转运蛋白被发现，如拟南芥中已获得了至少53个以上的单糖转运蛋白[monosaccharide transporter(-like)，MST](Johnson and Thomas,2007；Michael,2007；Klepek et al.，2005)；水稻中发现有65个单糖转运蛋白基因(Johnson andThomas,2007)；葡萄中有24个己糖转运蛋白基因VvHT1-24(Hayes et al，2007；Afoufa-Bastien et al，2010)；黄瓜中克隆得到3个己糖转运蛋白基因CsHT2,CsHT3和CsHT4(Chenget al,2015)

不同类型的单糖转运蛋白其功能上存在差异。如绿藻的3个单糖转运蛋白CkHUP1-3中,CkHUP1和CkHUP3运输D-葡萄糖，而CkHUP2运输D-半乳糖(Schubert et al,2010；Sauerand Stolz，1994)。拟南芥中的AtSTP1主要运输蔗糖，AtSTP1在各种组织都有表达，AtSTP2在花粉粒的短期发育中表达，AtSTP4在根尖和花粉粒中都有表达(Schulz et al,2011)。番茄LeHT2在叶片和花中大量表达，LeHT2为葡萄糖转运子(Michael et al,2000)，而葡萄的VvHT1转运葡萄糖，且与葡萄糖具有高的亲和力；但VvHT1不转运果糖、甘露糖、山梨醇和甘露醇(Vignault et al,2005)；VvTMT2基因在开始成熟和过熟的葡萄果实中大量表达(Cakir and Giachino,2102)。超表达STP13的拟南芥转基因幼苗能葡萄糖的吸收能力增强，体内蔗糖水平增加，能积累更多的总碳和生物量(Schofield et al,2009)；拟南芥单糖转运蛋白TMT1参与了单糖向液泡中的运输过程及对胁迫的响应,其在拟南芥的生长发育中起重要作用(Wormit et al.,2006；Wingenter et al.,2010)。抑制番茄果实己糖转运蛋白LeHT1、LeHT2和LeHT3的表达量80-90％的转基因植株，其果实中己糖的含量下降55％(David et al,2010)。VvHT1转化烟草植株后，部分转基因植株表现出矮化、小叶和短茎的形态变化(Leterrier et al,2003)。

目前有关植物单糖转运蛋白的功能研究主要集中拟南芥、水稻、葡萄等植物。梨是蔷薇科(Rosaceae)梨亚科(Pomaceae)梨属(Pyrus L.)植物，是世界及中国主栽果树之一，也是我国出口创汇的传统果品。果实品质是果树生产的关键，而果实内可溶性糖的组分和含量是衡量果实品质的重要参数。但对于梨单糖转运蛋白在果实糖分积累过程的功能作用和对果实品质的影响等都不清楚，也未见相关的研究报道。因此，本研究开展了梨单糖转运蛋白基因的克隆和功能研究，研究结果将对了解果实单糖转运的分子生理机制及品质育种研究具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种从梨(Pyrus bretschneideri)果实中分离克隆的己糖转运蛋白基因。

本发明的另一目的是提供该基因在果实品质方面的应用。

为了实现以上目的，本发明采用的技术方案如下：

申请人从梨(Pyrus bretschneideri)果实中分离克隆得到一个新基因PbHT1，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，编码区序列(CDS)长度为1557bp，编码519个氨基酸残基，氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，预测编码蛋白质含有12个跨膜结构域，分子量为57.03KD，等电点为9.20。

克隆本发明所述PbHT1基因cDNA序列的引物对，正向引物PbHT1-F1：5’-TCCCAAGAACCCTAACAATGCC-3’(SEQ ID NO.3)；反向引物PbHT1-R1：5’-TGGGAACAATAATATTCAGTGCTACC-3’(SEQ ID NO.4)。

含有本发明所述的己糖转运蛋白基因PbHT1的重组表达载体。

本发明所述的己糖转运蛋白基因PbHT1在延长植物营养生长期和推迟花期、提高净光合速率中的应用。

本发明所述的己糖转运蛋白基因PbHT1在提高植物果实己糖含量中的应用。

本发明所述的蛋白在延长植物营养生长期和推迟花期、提高净光合速率中的应用。

本发明所述的蛋白在提高植物果实己糖含量中的应用。

本发明所述的重组表达载体在延长植物营养生长期和推迟花期、提高净光合速率中的应用。

本发明所述的重组表达载体在提高植物果实己糖含量中的应用。

利用qRT-PCR技术分析了在鸭梨果实发育过程中PbHT1基因的表达模式，结果表明PbHT1在整个果实发育过程中都具有表达量，其相对表达量的最高峰出现在果实成熟前期，这与己糖的积累峰值相一致。

构建了PbHT1的亚细胞定位融合表达载体pCAMBIA1302-PbHT1-GFP，通过农杆菌介导转化洋葱表皮细胞，结果表明PbHT1定位于细胞膜上，属于膜己糖转运蛋白。

构建PbHT1基因的植物超表达载体，利用农杆菌介导的遗传转化方法将PbHT1基因转化番茄，获得的转基因植株经生物学功能分析，表明本发明克隆的PbHT1基因具有影响叶片形态、延迟番茄植物开花结实的功能，而且能促进成熟果实中己糖的显著积累，提高成熟果实中己糖的比例。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明利用转基因技术得到延迟开花和果实己糖含量提高的植株，突破了传统育种手段的障碍，为植物花期调控和果实品质基因工程提供了重要的基因资源。

附图说明

图1为本发明技术路线图。

图2梨PbHT1编码蛋白拓扑结构示意图。

图3为本发明克隆的梨PbHT1基因在鸭梨果实发育过程中的qRT-PCR分析和梨果实发育过程中糖分含量变化。a：PbHT1的相对表达量；b:鸭梨果实含糖量。

图4为本发明克隆的梨PbHT1基因亚细胞定位载体图。

图5为本发明克隆的梨PbHT1基因的亚细胞定位。明场(a，d),暗场(b，e),叠加(c，f)。(a，b和c)对照空载GFP表达情况；(d，e和f)PbHT1-GFP融合表达载体的定位图。

图6为本发明克隆的梨PbHT1基因在转基因番茄成熟果实中的表达量分析图。WT：成熟果实；OE20、OE42：阳性转PbHT1基因番茄株系。

图7为本发明克隆的梨PbHT1基因的植物超表达载体构建流程图。

图8为本发明克隆的梨PbHT1基因在番茄植株中过量表达对植株生长的影响。WT：野生型番茄植株；OE20、OE42：阳性转PbHT1基因番茄株系。a:转基因植株延迟开花；b：转基因植株叶片形态；c：转基因植株的花。

图9为本发明克隆的梨PbHT1基因在番茄植株过量表达对叶片净光合速率的影响。WT：野生型番茄植株；OE20、OE42：阳性转PbHT1基因番茄株系。不同小写字母表示转PbHT1基因株系与野生对照的植株叶片净光合速率的差异达到显著差异(P≤0.05)。

图10.为本发明克隆的梨PbHT1基因在番茄植株过量表达对果实可溶性糖含量的影响。WT：野生型番茄植株；OE20、OE42：阳性转PbHT1基因番茄株系。(a)：蔗糖含量(mg·g^{- 1}FW)；(b)：己糖含量(mg·g^-1FW)。不同小写字母表示转PbHT1基因株系与野生对照的植株果实含糖量的差异达到显著差异(P≤0.05)。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下描述和实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1梨PbHT1基因的克隆

以盛花后40-100d的‘鸭梨’果肉为试材，提取总RNA并反转录，所得的第一链cDNA用于扩增PbHT1基因。利用CTAB法(CTAB提取缓冲液:2％CTAB、2％PVP K-30、0.05％亚精胺、10mM Tris·HCl(pH＝8.0)、25mM EDTA、2M NaCl)提取总RNA，取1μg RNA样品，经1U DNaseI(购自TaKaRa公司)37℃孵育30min后，加入1μL EDTA(25mM)65℃孵育10min。第一链cDNA的合成用TOYOBO反转录试剂盒(购自TakaRa公司，按照试剂盒说明书操作。扩增引物为：正向引物PbHT1-F1：5’-TCCCAAGAACCCTAACAATGCC-3’(SEQ ID NO.3)；反向引物PbHT1-R1：5’-TGGGAACAATAATATTCAGTGCTACC-3’(SEQ ID NO.4)。25μL PCR反应体系包括：1×PCR缓冲液(购自TakaRa公司)，2.5mM MgCl₂(购自TakaRa公司)，0.25mM dNTPs(购自TakaRa公司)，0.5μM正向引物PbHT1-F1，0.5μM反向引物PbHT1-R1，100ng cDNA，1U Taq DNA聚合酶(购自TakaRa公司)。PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；循环完成后72℃延伸10min，10℃延伸10min。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，将产生的目的条带，按照AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒说明书操作回收。回收纯化的PCR产物与pMD19-T Vector(购自宝生物工程大连有限公司即TaKaRa公司)进行连接反应，连接反应体系包括：3.0μL回收纯化的PCR产物，1.0μLpMD19-T Vector，1.0μL ddH₂O和5.0μL Solution I(购自TakaRa公司)。采用热击法(参照《分子克隆实验手册》第三版，科学出版社，2002)转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L氨苄霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆，挑取5个阳性克隆测序(由上海英俊生物技术有限公司完成)。测序结果表明，本发明扩增的目的片段长度为1557bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，通过序列比对分析，确定该序列是本发明需要的目的基因，将这个基因命名为PbHT1。

PbHT1基因包括1557bp的开放阅读框，编码519个氨基酸，氨基酸序列如序列表SEQID NO.2所示，预测编码蛋白质含有12个跨膜结构域，分子量为57.03KD，等电点为9.20。PbHT1通过TMHMM2.0分析蛋白质氨基酸序列和特性表明：PbHT1编码的氨基酸多肽具有12个跨膜区和一个中央胞质环，属于主要易化子超家族(Major facilitator superfamily，MFS)中的一员(Schulze WX et al.，2003)，该蛋白其跨膜区位置分别位于第21-43、82-104、111-130、136-158、171-193、203-222、283-305、320-342、349-371、386-408、429-448、453-475位氨基酸，第223-282位氨基酸的中央胞质环、蛋白的N端和C端均位于胞质内(图2)。在NCBI上进行Blastp分析，发现与烟草NtMST1(CAA4732)和番茄LeHT1(NP_001234849)蛋白的氨基酸序列相似性分别为79％和78％。由此证明扩增出来的基因为梨己糖转运蛋白基因。

实施例2梨果实发育过程中PbHT1基因表达量和糖含量变化

1、梨PbHT1基因在梨果实发育过程中的qRT-PCR分析

梨果肉总RNA的提取、cDNA合成的方法同实施例1。用梨β-tubulin(AB239681)作为内对照，引物的核苷酸序列如下：正向引物TUB-F：5’-TGGGCTTTGCTCCTCTTAC-3’(SEQ IDNO.5)，反向引物TUB-R：5’-CCTTCGTGCTCATCTTACC-3’(SEQ ID NO.6)。利用Primer Premier5.0在PbHT1基因的开放阅读框内设计基因特异的qRT-PCR引物对，引物的核苷酸序列如下：正向引物PbHT1-F2：5’-CCTCTGCGTGGCAATCGTCAT-3’(SEQ ID NO.7)，反向引物PbHT1-R2：5’-TTCTCCAGGGTTCCCATCCAC-3’(SEQ ID NO.8)。

qRT-PCR采用SYBR Green试剂盒(购自TaKaRa公司，按照试剂盒说明书操作)。20μLqRT-PCR反应体系包括：10μL 2×SYBR Premix ExTaq，0.4μL正向引物，0.4μL反向引物，1μLcDNA，8.2μL无菌双蒸水。使用96孔qRT-PCR板(购自Roche公司)，运用qRT-PCR仪(型号：LightCycler 480，Roche公司)进行PCR。qRT-PCR反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸20s，40个循环。每个cDNA样品重复3次，计算出每个cDNA样品的平均Ct值，通过计算2^-ΔΔCt得出PbHT1基因的相对表达量。

2梨果实发育过程中可溶性糖含量变化

可溶性糖的提取步骤如下：准确称取2.0g组织样品于预冷的研钵，加入8mL 80％乙醇，充分研磨匀浆后转入10mL离心管，37℃水浴30min，超声波15min，12000rpm离心15min，上清液转入25mL容量瓶中，重复提取3次，合并上清液并定容。取2mL提取液，用旋转蒸发器(型号：RE-3000，上海亚荣生化仪器厂)蒸干，然后用1mL无菌双蒸水溶解，最后用0.45μm的水系滤器过滤，滤液即用于测定可溶性糖的含量。可溶性糖含量的测定采用高效液相色谱法(HPLC)，高效液相色谱仪为Waters1525系统，采用碳水化合物柱(TransgenomicCOREGET-87C；7.8×300mm，5μm)，外加保护柱(Transgenomic CARB Sep Coregel 87Ccartridge)，检测器为Waters2414示差检测器，参比池温度为35℃，柱温为85℃，流速为1.0mL·min^-1，流动相为脱气后的超纯水(18.2MΩ·cm)，进样量为5μL。根据样品峰面积和各碳水化合物的标准曲线计算其含量。

qRT-PCR技术分析鸭梨果实发育过程中PbHT1基因的相对表达量见图3a，鸭梨果实发育过程中果实的可溶性糖含量见图3b。梨果实中己糖含量在幼果期很低，盛花后60d其己糖含量开始快速积累，至盛花后140d己糖含量达到最高值，此时PbHT1基因的相对表达量也出现了最高峰。结果表明，PbHT1的表达与己糖的积累规律具有相似性。

实施例3 PbHT1基因亚细胞定位

本实施例利用洋葱表皮研究PbHT1基因的亚细胞定位，所用的表达载体为pCAMBIA1302，该表达载体上具有GFP基因(图4)。利用RT-PCR扩增出PbHT1基因整个ORF，设计扩增包括ORF序列并去除终止密码子的扩增引物，再在其正反引物的5’端分别加上BglⅡ和SpeI两个酶切位点，即得到带酶切位点的扩增引物：正向引物PbHT1-F3核苷酸序列为：5’-GAAGATCTATGCCTGCTGTTGGTAT-3’(SEQ ID NO.9)，反向引物PbHT1-R3核苷酸序列为:5’-GGACTAGTTGGGAACAATAATATTCAGTGCTACC-3’(SEQ ID NO.10)。下划线为酶切位点，AGATCT为BglⅡ酶切位点，ACTAGT为SpeI酶切位点。首先将扩增产物装在pMD19-T载体上，从而得到重组载体PMD19-T_B/S-PbHT1。同时用BglⅡ和SpeI去切pCAMBIA1302和PMD19-T_B/S-PbHT1，回收产物并连接，获得重组载体pCAMBIA1302-PbHT1-GFP。在确认序列无误后，将pCAMBIA1302-PbHT1-GFP重组载体及对照载体pCAMBIA1302用热击法分别转入农杆菌GV3101。农杆菌侵染洋葱表皮方法详见黄小三博士毕业论文(2011)。亚细胞定位结果表明：含对照载体的农杆菌转化的洋葱表皮细胞中GFP荧光充满整个细胞(图5a-c)，而含PbHT1基因载体的农杆菌浸染的洋葱表皮中GFP荧光只在细胞膜上(图5d-f)，证明PbHT1是膜定位蛋白。

实施例4构建梨PbHT1基因的植物超表达载体

对pBI121载体的多克隆位点和梨PbHT1基因的核苷酸序列进行了分析，设计的正反引物的5’端分别加上酶切位点XbaΙ和KpnI，即得到相应的引物PbHT1-F4和PbHT1-R4，用于构建表达载体pBI121-PbHT1，其引物核苷酸序列如下所示：正向引物PbHT1-F4：5’-GCTCTAGATCCCAAGAACCCTAACAATGCC-3’(SEQ ID NO.11)；反向引物PbHT1-R4：5’-GGGGTACCTGGGAACAATAATATTCAGTGCTACC-3’(SEQ ID NO.12)。下划线为酶切位点，TCTAGA为XbaΙ酶切位点，GGTACC为KpnI酶切位点。

用含有100mg·L^-1氨苄青霉素的液体LB培养基悬浮培养‘pMD19-T-PbHT1’重组质粒的大肠杆菌DH5α，37℃、220rpm培养12h。提取‘pMD19-T-PbHT1’重组质粒作为模板进行PCR扩增，25μL PCR反应体系包括：1×LA PCR Buffer II(Mg²⁺free)(购自TakaRa公司)，2.5mM MgCl₂，0.4mM dNTPs，0.4μM正向引物PbHT1-F4，0.4μM反向引物PbHT1-R4，100ng重组质粒，1.25 U TakaRa LA Taq聚合酶(购自TakaRa公司)。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，59℃退火40s，72℃延伸2min，35个循环；循环完成后72℃延伸10min。目的片段的回收纯化、目的片段与pMD19-T载体的连接、阳性克隆的获得与测序，均同实施例1。测序正确的结果包括上游酶切位点XbaΙ、PbHT1基因和下游酶切位点KpnI。最终获得含有酶切位点XbaΙ和KpnI的重组质粒pMD19-T-PbHT1。

分别提取含酶切位点和目的基因的重组质粒和pBI121的质粒进行双酶切。40μL双酶切体系包括：质粒10μL，10×M缓冲液(购自TakaRa公司)4μL，XbaΙ和KpnI各2μL，无菌双蒸水22μL。37℃酶切4h后分别纯化回收PbHT1基因和pBI121载体。连接反应体系包括：pBI121载体2μL，PbHT1基因6μL，10×T4DNA连接缓冲液(购自TakaRa公司)1μL，T4DNA连接酶(购自TakaRa公司)1μL。16℃孵育14-16h。取10μL连接产物，采用热击法转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg·L^-1卡那霉素的固体LB平板中筛选阳性克隆，进行测序(由英潍捷基公司完成)。测序正确的结果包括上游酶切位点XbaΙ、PbHT1基因和下游酶切位点KpnI，且无核苷酸变异。同时提取‘pBI121-PbHT1’重组载体进行双酶切验证，双酶切体系同上。获得含有插入PbHT1基因的重组载体，将其命名为‘pBI121-PbHT1’重组载体，应用冻融法将重组载体‘pBI121-PbHT1’导入到农杆菌GV3101中。植物超表达载体‘pBI121-PbHT1’的构建完整图见图7。

实施例5番茄的遗传转化和转化植株分子鉴定

根癌农杆菌介导的番茄遗传转化具体步骤参照王保全博士毕业论文(2012)。按照上述方法得到转PbHT1基因的番茄植株，采用小量法提取DNA的方法进行番茄叶片总DNA的提取。阳性植株鉴定步骤如下：设计特异性引物用对(PbHT1-F5和PbHT1-R5)，正向引物PbHT1-F5：5’-ATGCCTGCTGTTGGTATCCCCG-3’(SEQ ID NO.13)；反向引物PbHT1-R5：5’-GGCCGAGAATCAACATCCAG-3’(SEQ ID NO.14)。对上述提取的DNA进行PCR扩增鉴定阳性苗。鉴定为阳性植株移栽后独立收获种子(T1代种子)，T1代种子播种后，对幼苗再次进行阳性鉴定，将不同株系鉴定为阳性的植株用于相关分子与生理鉴定分析。

实施例6半定量RT-PCR检测PbHT1基因在转基因番茄植株中的超表达

本研究采用半定量RT-PCR分析转基因番茄果实中外源基因PbHT1的表达量，根据T1代幼苗的DNA鉴定结果，选择了株系OE20和OE42为PbHT1超表达量分析材料。转基因株系果实RNA提取与反转录方法同实施例1。利用Primer Premier 5.0在PbHT1基因的开放阅读框内设计基因特异的半定量RT-PCR引物对，其引物的核苷酸序列为：PbHT1-F6：5’-GGCGTTGATGATGTTAGGGAG-3’(SEQ ID NO.15)，PbHT1-R6:5’-GCTGCTGAAAGAAGGGAATGA-3’(SEQ ID NO.16)。用番茄β-actin作内参基因，actin-F：5’-ATGGCAGACGGAGAGGATATTCA-3’(SEQ ID NO.17)，actin-R：5’-GCCTTTGCAATCCACATCTGCTG-3’(SEQ ID NO.18)。反应程序：94℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸30s，35个循环，循环完成后72℃延伸10min。半定量PCR分析结果如图6所示，目的基因在转基因株系OE20和OE42中超量表达，野生型中未检测到表达量。由此可见，目的基因已经整合到了番茄植株中。

实施例7转PbHT1基因番茄植株的生长发育观察与生理鉴定

1梨PbHT1基因在番茄植株中过量表达对植株生长的影响

与野生型番茄植株相比，转PbHT1基因番茄植株的营养生长受到一定程度的影响，主要表现为植株矮化，茎粗度增加，花期推迟，营养生长期延长(图8a)；叶片光泽度增加，叶片褶皱明显，且叶色浓绿(图8b)；花朵数量增多(图8c)。以上结果表明，本研究克隆的梨PbHT1基因可延长植物的营养生长期，推迟植物开花结实。

2梨PbHT1基因在番茄植株中过量表达对叶片净光合速率的影响

净光合速率是指光合作用产生的糖类减去呼吸作用消耗的糖类(即净光合作用产生的糖类)的速率。采用LI-6400XT便携式光合仪(美国LI-COR)测定叶片的净光合速率。测定分析结果表明，转基因两个番茄株系的植株叶片的净光合速率都显著高于野生型植株叶片(图9)。

3梨PbHT1基因在番茄植株中过量表达对可溶性糖含量的影响

大量的研究结果已表明部分己糖转运蛋白具有转运糖分的功能。为进一步研究本发明克隆的梨PbHT1基因对果实糖分积累的影响，因此，以野生型番茄植株为对照，测定了转PbHT1基因番茄植株成熟果实的可溶性糖含量(图10)。可溶性糖的提取步骤如实施例2。结果分析表明，与野生型番茄植株为对照，2个转基因番茄株系成熟果实的己糖(果糖+葡萄糖)含量显著高于野生型植株番茄成熟果实，但转基因番茄果实中蔗糖含量与野生型果实无显著差异。

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Claims (3)

1.己糖转运蛋白基因PbHT1在延长植物营养生长期和推迟花期、提高净光合速率中的应用,所述的己糖转运蛋白基因PbHT1核苷酸序列如 SEQ ID NO.1 所示。

2.己糖转运蛋白基因PbHT1编码的蛋白在延长植物营养生长期、推迟花期、提高净光合速率中的应用, 所述的蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

3.含有己糖转运蛋白基因PbHT1的重组表达载体在延长植物营养生长期、延迟花期、提高净光合速率的应用, 所述的己糖转运蛋白基因PbHT1核苷酸序列如 SEQ ID NO.1 所示。