CN104694552B - GhEXLB2基因在增强植物抗旱性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一个GhEXLB₂基因在增强植物抗旱性中的应用。从棉花中克隆得到一个GhEXLB₂基因，对其进行了相关的功能验证及应用。GhEXLB₂基因cDNA序列如SEQ ID NO：1中第1‑1151位碱基对应的序列所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明还涉及构建一个超表达该基因的载体，通过遗传转化能提高棉花对干旱的耐受性。

Description

GhEXLB2基因在增强植物抗旱性中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一种GhEXLB₂基因在增强植物抗旱性中的应用。从棉花中克隆得到一种细胞壁蛋白基因GhEXLB₂，功能验证表明超表达GhEXLB₂基因能提高棉花对干旱的耐受性。利用本发明克隆的GhEXLB₂基因，通过遗传转化可应用于增强植物对干旱的耐受性。

背景技术

干旱是影响作物生长、限制作物产量的主要非生物胁迫因子。据统计,世界干旱、半干旱地区占地球陆地面积的三分之一(Salekdeh et al.2009)。我国干旱、半干旱地区占全国陆地面积的二分之一，干旱天气频繁出现，给我国作物生产带来极大的影响。

抗旱性是一个由多基因控制的复杂性状，涉及多种抗旱机制和信号传导途径。植物在遇到干旱胁迫后，植物细胞的形态结构、生理生化、代谢、基因表达等许多方面都产生一系列变化，以最大限度地减轻逆境造成的伤害(Bray 2007)。近些年来，通过同源发掘、基因克隆和遗传转化等方法发掘并验证了一些参与植物干旱胁迫响应相关的基因，根据基因蛋白产物功能的不同，将这些基因主要分为两大类(Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki2007)：一类是编码功能蛋白的基因，如渗透压调节物质(脯氨酸、甜菜碱、海藻糖等)合成代谢过程中的一些酶、过氧化物酶、糖和脯氨酸转运蛋白等，这些基因的产物可以直接保护植物组织细胞，使其免于外界胁迫环境造成的伤害(裴金玲et al.2012)。另一类是调控蛋白基因，包括转录因子及感受和传导胁迫信号的蛋白激酶及其参与的信号路径中的效应基因等，这类基因主要通过复杂的表达调控去调节下游保护性功能基因表达来实现植物对逆境的抵抗(Zhu 2002)。

膨胀素(EXPs)是一种细胞壁松弛蛋白，其主要作用方式是疏松植物细胞壁的组分，增加细胞壁的柔韧性(Cosgrove 2000)。编码EXPs的基因是一个多基因的家族，依据结构分为四个亚家族：两个膨胀素亚家族α-expansin(EXPAs)和β-expansin(EXPBs)；两个类膨胀素亚家族expansin-like A(EXLA)和expansin like B(EXLB)(Kende et al.2004)。不同家族的膨胀素蛋白之间只有20％-40％的相似性。早期的研究表明，EXP四个亚家族中，EXPA和EXPB亚家族的多数成员在体外都具有使细胞伸长的活性，EXPA主要存在于双子 叶和非禾本科单子叶植物中；EXPB主要存在禾本科单子叶植物中(Yennawar et al.2006)。

近年来的研究发现膨胀素除了参与植物生长发育的调控，还对植物抗非生物逆境有重要作用。在玉米中的研究表明，干旱胁迫条件下EXPs在维持生长过程中起着重要作用，其主要通过促使细胞壁更好的扩展来维持玉米初生根生长(Veselov et al.2008)；干旱条件下水稻根尖和侧根的快速生长主要是由于OsEXP2基因的表达(Yang et al.2004)；Li等(Li et al.2015)发现水分胁迫能够诱导小麦TaEXPB23的上调表达，在烟草中超表达TaEXPB23增强其根系对PEG渗透胁迫的耐受性。当植物处于逆境时，通过EXPs在细胞壁的积累表达可能增加了细胞壁的柔韧性，在一定程度上舒缓了逆境对植物细胞的张力威胁，增加了植物对逆境的适应性。

植物中关于EXPA和EXPB亚家族成员的研究较多，相对于EXP来说，EXL基因同样拥有EXP的两个结构域，但其氨基酸序列与EXPA和EXPB不同，它们缺少HFD基元，同时却含有更多的半胱氨酸残基，这样的结构性差异又带来什么样的功能变化，植物中EXLA和EXLB亚家族是否具有什么样的功能？我们基于棉花细胞壁重建的差减文库(Yang et al.2008)及DFCI棉花数据库(http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/cgi-bin/tgi/gimain.pl？gudb＝cotton)，通过同源序列法克隆到棉花中的GhEXLB₂基因。在枯草杆菌中分离到的膨胀素类似蛋白基因EXLX1(BsYoaJ)与植物EXP功能相似，能与多聚糖和肽聚糖结合，并增强纤维素酶的活性(Kerff et al.2008；Kim et al.2009)；来自普城沙雷菌的膨胀素类似蛋白基因HcEXLX2也行使相同功能(Lee et al.2010)。植物中对EXL亚家族的成员的功能研究较少，Lee和Kende(Lee and Kende 2002)发现Os-EXPL3基因与细胞的伸长有关，并受到GA的诱导表达。拟南芥基因组中存在三个EXLA和一个EXLB基因(http://homes.bio.psu.edu/expansins)，3个拟南芥AtEXLA基因在冷胁迫下都上调表达(Lee et al.2005)；最新研究发现AtEXLA2基因受盐和冷诱导表达，AtEXLA2基因的突变体对盐和ABA敏感(Abuqamar etal.2013)。我们研究发现棉花GhEXLB₂基因对盐、PEG和ABA均有响应，在棉花中超表达GhEXLB₂能够显著增强植株的抗旱性。

发明内容

本发明的目的在于从陆地棉中基于同源序列克隆到一个与细胞壁松弛相关的功能基因，我们将这个基因命名为GhEXLB₂基因，通过转化陆地棉YZ1，获得转基因陆地棉，以验证其在棉花抗非生物逆境中的功能，为细胞壁如何参与植物抗非生物逆境提供理论依据，并为棉花在逆境中提高产量提供参考。

本发明的技术方案如下所述：

(1)本发明从陆地棉中克隆一个与棉花抗逆相关的功能基因GhEXLB₂，它的核苷酸序列是序列表SEQ NO:1中第1-1151位碱基所示的序列，其中在该序列表中的第150-899位所示的序列是该基因的编码区(即CDS，其编码的蛋白质序列如SEQ NO:2所示)，其编码的蛋白与烟草TcEXLB₁编码的蛋白同源性较高(见图1)，序列一致性为89％，聚类分析表明该序列编码的蛋白属于类膨胀素家族蛋白。根据测序验证后的该基因全长cDNA序列信息构建了该基因的干涉表达载体和超表达载体，超量表达的序列是序列表SEQ NO:1中的第150-899位所示的DNA序列。

本发明的基因(SEQ ID NO:1)来源于棉花，其编码的蛋白质由750个碱基组成，该蛋白质编码249个氨基酸，是序列1自5’端第150位碱基到896位碱基组成。该基因在对逆境胁迫，激素以及棉花生长发育的影响上尚未有任何报道。通过不同的胁迫处理及激素处理野生型棉花，检测该基因的表达情况，发现该基因受PEG模拟的干旱、盐(NaCl)，茉莉酸(JA)和水杨酸(SA)等处理的诱导表达(见图2)。本发明分别构建了该基因的超量表达载体pCAMBIA2300(超量表达的DNA序列如SEQ ID NO:1所示的自5’端第150位碱基到899位碱基)和干涉载体pHELLSGATE4(干涉表达的DNA序列如SEQ ID NO:1所示的自5’端第847位碱基至970位碱基)(见图3)，将这两个载体分别转化到豫早1号陆地棉(YZ1)中，得到该基因的超表达和干涉转基因阳性株系，检测其表达量并选取具有合适表达量的2个超表达纯系和3个干涉纯系进行后续实验(见图4)。

当对超表达、YZ1以及干涉转基因萌发期进行PEG(水势为-0.7MPa)模拟干旱处理时，发现在正常棉花无菌苗培养基上，超表达系、YZ1和干涉系长势较一致，而在PEG存在的培养基上，超表达系植株的主根长和下胚轴长显著高于YZ1和干涉系植株(见图5A，5B和5C)，说明该基因的超量表达可以提高棉花对PEG的抗性。测定子叶中H₂O₂含量发现处理后H₂O₂含量呈上升趋势，处理后超表达系H₂O₂含量显著低于干涉系(见图5D)，表明超表达系清除干旱胁迫产生的活性氧能力较强。进一步对超表达株系、YZ1以及干涉株系两叶一心期幼苗进行PEG模拟干旱处理时，发现干涉系iB2-4、iB2-6、iB2-11和CK(YZ1)萎蔫程度较重，而超表达系萎蔫程度较轻，转入普通Hogland营养液中，超表达系恢复较快。测定叶片中H₂O₂含量和MDA含量发现干涉系中H₂O₂含量显著升高，MDA含量在超表达系和干涉系之间无显著差异(见图6)。

通过干旱处理沙质土培6周幼苗发现，超表达转基因植株的为萎蔫程度明显低于对照和干涉系植株。测定各系MDA含量发现，正常情况下超表达系和干涉系及对照MDA含量较一致， 但是植株受到干旱胁迫后，干涉系和对照植株MDA含量显著高于超表达系，说明超表达该基因能够在一定程度上减轻植株受到干旱胁迫后的膜脂过氧化程度，从而提高植株的耐旱性(见图7)。

本发明具体操作步骤如下：

1)通过常规的RACE(rapid-amplification of cDNA ends)方法扩增出GhEXLB₂的5’和3’端，将序列拼接后得到GhEXLB₂的cDNA序列全长，根据测序的序列设计超表达和干涉载体的引物，以棉花cDNA为模板，扩增其全长，获得DNA片段，其cDNA序列全长如SEQ ID NO:1(1-1151bp)所示，扩增该基因的引物序列如下所示：

GhEXLB₂5r-1：5'-AGCTGCATCTTTTGTCTGAGCCATCC-3'

Gh EXLB₂5r-2：5'-GAGTTTGGGTAGTAAGCTGCTCGCGA-3'

Gh EXLB₂3r-1：5'-GGTGCACCAACAGCCACTATTGCTCAGAC-3'

Gh EXLB₂3r-2：5'-GGATGGCTCAGACAAAAGATGCAGCT-3'

GhEXLB₂-F：5'-ATGGCTCTTTCTATTCAATCCCT-3'

GhEXLB₂-R：5'-CTCTGGTGCAGATATCTAGATATCA-3'

2)将步骤1)中扩增得到的全长ORF片段及表达载体酶切位点分布设计引物进行PCR扩增，回收PCR产物后利用利用SacⅠ和PstⅠ(购自NEB公司，美国)对回收产物和pCAMBIA2300空载体(pCAMBIA2300空载体由CAMBIA实验室惠赠，澳大利亚)分别进行双酶切，酶切后进行凝胶电泳，对目标片段和pCAMBIA2300空载体大片段挖胶回收，利用T4DNA连接酶对回收的目标片段和pCAMBIA2300空载体酶切产物进行连接，再通过热激转化大肠杆菌感受态细胞TOP10中，获得GhEXLB₂超表达转化载体(p35s-GhEXLB₂，由申请人自行制备，武汉)。同时设计引物用于非保守区干涉，通过BP-LR反应，将该片段先后连接到中间载体pDONR^TM221(由CSIRO Plant Industry惠赠，澳大利亚)和干涉载体pHELLSGATE 4(由CSIROPlant Industry惠赠，澳大利亚)上，再通过热激转化大肠杆菌感受态细胞TOP10中，获得GhEXLB₂干涉表达载体(pHELLSGATE 4-GhEXLB₂，由申请人自行制备，武汉)。利用农杆菌介导的转基因方法，将所述的载体转化陆地棉YZ1(来源于中国农业科学院棉花研究所，安阳)下胚轴，通过组织培养，获得超量表达和干涉表达GhEXLB₂转基因植株。所用引物序列如下：

GhEXLB₂OE-F：5’-ACGAGCTCACCATGGCTCTTTCTATTCAATCC-3’

GhEXLB₂OE-R：5’-ACCTGCAGTCTAGACTAGATATCAATTTGTACTCCTGTG-3’

GhEXLB₂Ri-F：

5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAGAAAATTGGAAAGCTGGAGAGAC-3’GhEXLB₂Ri-R：

5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGAAGAAACCTAGAAACTTATTCTTT-3’

M13-F：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCAAAAATGATGATCGGAGA-3’M13-R：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTCATTTCACCAACTCAGATAC-3’

具体步骤如下所述：

1)借助卡那霉素筛选及分离比统计的方法获得转基因阳性纯合植株，通过RT-PCR的方法，检测转基因植株的表达量。

2)用干旱、高盐、冷以及各种激素处理野生型棉花品种YZ1两叶一心的幼苗，检测GhEXLB₂对不同逆境胁迫处理的应答；

3)GhEXLB₂超表达和干涉植株生长不同时期进行逆境胁迫，观察其表型，并测定PEG处理和干旱胁迫下相关指标及基因的表达。

本发明的优点

棉花是重要的经济作物，在其生长发育过程中经常遭受各种不良环境的胁迫,如干旱、高盐、低温等，在这些因素中，干旱造成的危害相当于其它自然灾害的总和。棉花原产于热带和亚热带，是一种相对耐旱的作物，然而水资源的短缺及棉区土壤的盐碱化也逐渐成为制约棉花产量和品质的重要因素。因此，提高棉花的综合抗旱、耐盐、耐瘠能力，有效应对棉花生长发育进程中的各种逆境，是当前棉花育种的重要任务。

本发明克隆的GhEXLB₂基因来源于DFCI棉花EST数据库，在细胞壁再生过程中特异表达，可能与细胞壁松弛相关，对GhEXLB₂进行研究能够为细胞壁参与植物抗逆提供理论参考。在棉花中超量表达GhEXLB₂基因，能够有效提高萌发期、幼苗期及成株期转基因植株对干旱的耐受性，因此能够利用基因工程技术有目的提高作物耐干旱的能力。

附图说明

序列表SEQ ID NO:1是本发明分离克隆GhEXLB₂基因的cDNA序列全长(1-1151bp)，在该序列的150-899bp是该基因的编码区(CDS)，编码249个氨基酸。

序列表SEQ ID NO:2是本发明分离克隆GhEXLB₂基因编码的蛋白质序列。

图1：是利用ClustalW软件和MEGA4.0软件(公开使用软件)对GhEXLB₂编码氨基酸序列与NCBI数据库中部分膨胀素和类膨胀素聚类分析的结果。通过聚类分析表明，GhEXLB₂编码氨基酸序列与烟草中中的TcEXLB₁编码氨基酸同源性最高。

图2：使用Real-time PCR的方法检测GhEXLB₂基因对逆境处理的表达模式分析。附图标 记说明：图2A为PEG处理下叶片中GhEXLB₂的表达分析；图2B为NaCl处理下叶片中GhEXLB₂的表达分析；图2C为4℃冷处理下叶片中GhEXLB₂的表达分析；图2D为脱落酸(ABA)处理下叶片中GhEXLB₂的表达分析；图2E为茉莉酸(JA)处理下根中GhEXLB₂的表达分析；图2F为水杨酸(SA)处理下根中GhEXLB₂的表达分析。表达分析结果表明，GhEXLB₂基因受PEG和NaCl诱导上调表达，ABA处理后下调表达，受JA和SA诱导先上调后下调表达。

图3：构建超表达载体和干涉表达载体所用的载体。附图标记说明：图3A为本发明构建的超量表达载体所用的pCAMBIA2300载体示意图。图3B为构建的目标基因超量表达载体pCAMBIA2300S-GhEXLB₂的示意图。图3C为BP反应的中间载体pDONR^TM221示意图。图3D为构建干涉表达载体所用的pHELLSGATE4载体示意图。

图4：利用RT-PCR方法检测超表达和干涉表达GhEXLB₂转基因株系叶片中GhEXLB₂表达分析。

图5：显示GhEXLB₂基因能够提高陆地棉萌发期的抗旱性的情况。附图标记说明：图5A转基因株系萌发期PEG处理的表型，其中上排为平行对照，下排为PEG(-0.7MPa)处理9天的结果，左起前两个为超量表达系mB2-12和mB2-2，第三个为转基因受体YZ1(CK)，后三个为干涉表达系iB2-4、iB2-6和iB2-11。图5B为PEG处理9天后植株主根长统计结果。图5C为PEG处理9天后植株下胚轴长统计结果。图5D为PEG处理9天后植株子叶中H₂O₂含量的统计结果。

图6：是GhEXLB₂能够提高植株苗期的抗旱性的情况。附图标记说明：图6A为转基因植株两叶一心期经13％PEG处理后的表型，其中左图为处理前的幼苗，右图为处理7天后的结果，两图中左起前两列为超量表达系mB2-12和mB2-2，第三列为对照YZ1，后两列为干涉系iB-6和iB-11。图6B为PEG处理5天后叶片中H₂O₂含量的统计结果。图6C为PEG处理5天后叶片中丙二醛含量的统计结果。

图7：是GhEXLB₂基因能够提高植株的抗旱性的情况。附图标记说明：图7A为转基因植株6周时期自然干旱处理的表型，图中左起第一个为超量表达系mB2-12，第二个为对照YZ1，后两个为干涉系iB-6和iB-11。图7B为干旱处理6天后叶片中丙二醛含量的统计结果。

具体实施方式

以下实施例定义了本发明，并描述了本发明克隆包含有GhEXLB₂基因完整编码区段的DNA片段，以及验证GhEXLB₂基因功能的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明 做出各种改变和修改，以使其适用不同的用途和条件。

实施例1GhEXLB₂基因的分离克隆及表达模式分析

本申请人通过搜索DFCI棉花EST数据库(http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/cgi-bin/tgi/gimain.pl？gudb＝cotton)中找到一个陆地棉EST序列(DN779316)，对这条序列在NCBI基因库中进行tBLASTx比对，发现这个序列可能是Expansin-like基因家族成员。这条EST序列没有包含完整地开放读码框，我们采用RACE技术(cDNA末端快速克隆技术)得到这个基因完整的编码序列。

A.RNA的提取及cDNA的获得

从陆地棉Coker201(来源于中国农业科学院棉花研究所，河南安阳)胚性愈伤及原生质体再生细胞壁0、3、6、12、18、24、36、48、72h悬浮系的样品中提取总RNA，原生质体再生细胞壁悬浮体系的样品获取方法参照华中农业大学，杨细燕，棉花原生质体不对称融合研究及原生质体细胞壁重建相关基因的表达谱分析(杨细燕2009)报道的方法(http:// cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10504-2010011290.htm)，提取总RNA的方法参照Zhu etal(2005)报道的方法，将获得的RNA样品各取0.1ug混合，利用反转录酶SuperscriptⅢ(购自Invitrogen公司，美国)将其反转录合成cDNA，反应条件为：65℃5min，50℃60min，70℃10min。

B.GhEXLB₂基因全长序列的获得

采用RACE(Frohman et al.,1988报道的方法)分别扩增出GhEXLB₂的5’和3’端，所用的引物序列分别为GhEXLB₂5r-1(5'-AGCTGCATCTTTTGTCTGAGCCATCC-3')和GhEXLB₂5r-2(5'-GAGTTTGGGTAGTAAGCTGCTCGCGA-3')，GhEXLB₂3r-1(5'-GGTGCACCAACAGCCACTATTGCTCAGAC-3')和GhEXLB₂3r-2(5'-GGATGGCTCAGACAAAAGATGCAGCT-3')。将所得的序列拼接后得到GhEXLB₂的cDNA序列(见SEQ ID NO：1)。根据上述所得的拼接序列设计ORF引物，其上下游引物分别为：GhEXLB₂-F(5'-ATGGCTCTTTCTATTCAATCCCT-3')和GhEXLB₂-R(5'-CTCTGGTGCAGATATCTAGATATCA-3')，以第一链cDNA为模板，利用PCR技术扩增GhEXLB₂的ORF。PCR条件为94℃预变性3min；94℃30sec，54℃30sec,72℃1min，28个循环；72℃延伸5min。将扩增获得的PCR产物连入pGEM-T载体(购自Promega公司，美国)，筛选阳性克隆并测序。其序列为SEQ ID NO:1中150-914bp所示的序列。再通过ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)对获得的cDNA进行分析，确定包含一个完整的ORF， 其表达的蛋白为SEQ ID NO:2所示的蛋白质序列。

C.GhEXLB₂的基因的组织表达分析及逆境/激素诱导表达分析

以陆地棉YZ1(来源于中国农业科学院作物科学研究所，北京)为材料，提取根和叶片以及PEG、NaCl、ABA和冷处理不同时间点各样品的RNA(提取方法参考本发明的上述方法)，选取的PEG、NaCl和4℃冷处理的时间点分别是0h，1h，4h，8h，ABA处理的时间点分别是1h，1h和2h，JA和SA处理时间点分别是0h，1h，3h和6h，以正常生长的YZ1选取相对应的时间点作平行对照。利用反转录酶SuperscriptⅢ(购自Invitrogen公司，美国)将其反转录合成cDNA，反应条件为：65℃5min，50℃60min，70℃10min。以上述反转合成的cDNA为模板，采用Real-time PCR检测GhEXLB₂的表达水平，所用引物为：GhEXLB₂-RTS：(5'-CTGACAACAGAGGCAACGACTTTC-3')和GhEXLB₂-RTA：5'-(GCTGCTGATACATCTCCACCATTT-3')。同时用引物GhUbiquitin7-F：(5'-GAAGGCATTCCACCTGACCAAC-3')和GhUbiquitin7-R：(5'-CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG-3')对棉花GhUbiquitin7(GenBank登陆号：DQ116441)基因做特异扩增，作为内参对照进行相对定量分析。定量PCR仪型号为ABI7500，定量PCR试剂购自Bio-Rad公司。PCR反应体系(总体积为20μl)包括：10μl稀释后的cDNA(等于20ng起始总RNA)，10μl 2×PCR Master Mix,200nM的引物。反应条件为：95℃30sec；95℃5sec，58℃35sec，40个循环。反应过程中进行荧光检测实时定量分析。结果表明：本发明克隆的基因GhEXLB₂受PEG和NaCl处理诱导上调表达，而受ABA处理下调表达，同时受茉莉酸(JA)和水杨酸(SA)处理后的表达量是先上调后下调表达，均在3h表达最高。

实施例2：GhEXLB₂基因植物超量表达和干涉表达载体的构建

A.超量表达载体的构建

根据得到的SEQ ID NO:1的序列及表达载体酶切位点分布，设计引物用于构建表达载体，引物序列分别为GhEXLB₂OE-F(5’-ACGAGCTCACCATGGCTCTTTCTATTCAATCC-3’)和GhEXLB₂OE-R(5’-ACCTGCAGTCTAGACTAGATATCAATTTGTACTCCTGTG-3’)，以T-GhEXLB₂质粒(购自Promega公司，美国)为模板进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃30sec，57℃30sec，72℃1min，28个循环；72℃延伸5min，经PCR扩增得到两端带有酶切位点的包含完整ORF的PCR产物。利用TIANquick Midi Purification kit(购自天根生化科技(中国)有限公司)进行PCR产物回收，利用SacⅠ和PstⅠ(购自NEB公司，美国)对回收产物和pCAMBIA2300空载体(pCAMBIA2300载体来源于CAMBIA实验 室，澳大利亚墨尔本)分别进行双酶切，酶切反应体系(20μl)：回收产物pCAMBIA2300空载体10μl；10×NEBbuffer1 2μl；ScaⅠ1μl；Pst 1μl；ddH2O 6μl，37℃水浴3h。酶切后，凝胶电泳分离，利用TIANgel MidiPurification Kit(购自天根生化科技(中国)有限公司)对目标片段/pCAMBIA2300空载体大片段挖胶回收。利用T4DNA ligase对回收的目标片段和pCAMBIA2300空载体酶切产物进行连接，连接体系(5μl)：目标片段1.5μl；pCAMBIA 2300S空载体酶切产物0.5μl；2×ligasereaction buffer 2.5μl；T4DNA ligase 0.5μl，4℃条件下连接24h后转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，以GhEXLB₂特异引物GhEXLB₂OE-F(5’-ACGAGCTCACCATGGCTCTTTCTATTCAATCC-3’)和GhEXLB₂OE-R(5’-ACCTGCAGTCTAGACTAGATATCAATTTGTACTCCTGTG-3’)进行PCR检测挑取的阳性单克隆，并活化。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃30sec，57℃30sec，72℃30sec，28个循环；72℃延伸5min。取PCR检测后的阳性活化菌液提质粒进行双酶切检测，确定的阳性克隆即为获得的用于转化的超量表达质粒p35s-GhEXLB₂(图3B)

B.干涉表达载体的构建

根据得到的SEQ ID NO:1序列设计引物用于构建非保守区干涉表达载体，在引物两端分别加上BP-LR反应的接头碱基，引物序列分别为GhEXLB₂Ri-F(5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAGAAAATTGGAAAGCTGGAGAGAC-3’)和GhEXLB₂Ri-R(5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGAAGAAACCTAGAAACTTATTCTTT-3’)，以T-GhEXLB₂质粒为模板进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，28个循环；72℃延伸5min，经PCR扩增得到两端带attB接头的的PCR产物。PCR产物经BP反应连接至pDONR^TM221载体上(BP酶购自Invitrogen公司，美国，室温反应4小时，见图3C，pDONR^TM221载体来源于CSIRO Plant Industry，澳大利亚)后转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，以通用M13引物M13-F(5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCAAAAATGATGATCGGAGA-3’)和M13-R(5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTCATTTCACCAACTCAGATAC-3’)进行PCR检测来挑取阳性克隆，并活化提取质粒。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，28个循环；72℃延伸5min。再用LR反应将GhEXLB₂基因连接至植物表达载体pHELLSGATE 4(LR酶购自Invitrogen公司，美国，室温反应4小时，图3D，载体pHELLSGATE 4由CSIRO Plant Industry惠赠，澳大利亚)，用反应产物转化大肠杆菌 感受态细胞TOP10。以GhEXLB₂的特异引物GhEXLB₂Ri-F(5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAGAAAATTGGAAAGCTGGAGAGAC-3’)和GhEXLB₂Ri-R(5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGAAGAAACCTAGAAACTTATTCTTT-3’)进行PCR检测来挑取阳性克隆，并活化提取质粒。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，28个循环；72℃延伸5min。确定为阳性的克隆即为获得用于转化的干涉表达质粒pHELLSGATE4-GhEXLB₂。

C.载体转化农杆菌

将构建的p35s-GhEXLB₂载体和干涉表达载体pHELLSGATE4-GhEXLB₂转化农杆菌菌株EHA105，挑取单克隆菌落接于含100mg/L相应抗生素(例如干涉表达载体用100mg/L壮观霉素筛选，超量表达载体用100mg/L卡那霉素筛选)的LB液体培养基中于150rpm，28℃摇48h，按菌液和甘油体积比为1：1加入1.5mL离心管中混匀，-70℃保存。再通过农杆菌介导的转化方法转化棉花下胚轴。

以上及以后所述的LB培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L；用5mM NaOH调培养基的pH＝7.2；用蒸馏水定容至1L；在121-125^oC高压蒸汽下灭菌15-20min。LB固体培养基需每升加入8g琼脂。

实施例3 GhEXLB₂基因的遗传转化及筛选鉴定

A.棉花下胚轴的准备

供试材料为陆地棉豫早1号(YZ1，来源于中国农业科学院棉花研究所，河南安阳)。选择饱满一致YZ1种子，剥去种皮，用0.1％升汞溶液杀菌10-12min，期间不断摇动，再用无菌水冲洗种子3次，将种子置于MS培养基表面。30℃暗培养1.5d后扶苗，继续暗培养4-5d。

B.农杆菌的活化

从超低温冰箱内取出保存的含有目标基因(即本发明克隆克隆的GhEXLB₂基因)的EHA105菌株的甘油管在冰上融化，接10μl于2ml含100mg/L相应抗生素(如上所述)的LB液体中，28℃震荡培养2d，取培养好的菌液1ml转至LB平板，28℃倒置暗培养3d，刮取表面菌落于20ml含50mg/L乙酰丁香酮(AS)的MGL培养基(具体成分见后面)中，28℃振荡培养3-4h至OD₆₀₀＝0.5。

C.YZ1下胚轴的遗传转化和转基因植株的再生

农杆菌介导的棉花下胚轴的转化方法和程序参照(金双侠2006， http:// cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10504-2006190162.htm)报道的方法。具体步骤如下：

(1)每次取15-20株无菌苗下胚轴切成0.5-0.8cm小段接入50ml无菌锥形瓶，加入活化好的含有目标载体p35s-GhEXLB₂和pHELLSGATE4-GhEXLB₂的EHA105农杆菌菌液侵染10min，期间摇动数次；

(2)倒去菌液，将下胚轴置于无菌滤纸上吸干表面菌液，置于超净工作台吹10-15min后接入不含抗生素的2，4-D诱导培养基(具体成分见后面)上，19℃黑暗条件共培养48-60h；

(3)共培养结束后将下胚轴切段接入含卡那霉素(100mg/L)和头孢霉素(100mg/L)的2，4D诱导培养基(具体成分见后面)，28℃弱光培养；

(4)3周后转入含抗生素的IBA诱导培养基(具体成分见后面)连续继代至出现胚性愈伤；

(5)将胚性愈伤陆续接入胚分化培养基(具体成分见后面)继代至体细胞胚成熟，成熟的子叶胚接入生根培养基(具体成分见后面)上萌发、成苗。

本实施例中所用的MGL培养基配方为：胰蛋白胨5g/L，NaCl 5g/L，MgSO₄﹒7H₂O0.1g/L，KH₂PO₄0.25g/L，甘露醇5g/L，甘氨酸1g/L。

2，4-D诱导培养基配方为：以MS培养基为基础添加2,4-D 0.1mg/L，KT(激动素)0.1mg/L，葡萄糖30g/L，Phytagel 2.5g/L，pH为5.9。

IBA诱导培养基配方为：以MS培养基为基础添加IBA 0.5mg/L KT 0.1mg/L，葡萄糖30g/L，Phytagel 2.5g/L，pH为5.9。

胚分化培养基配方为：以MS培养基为基础添加1.9g/L KNO₃，KT 0.1mg/L，葡萄糖30g/L，Gln 1.0g/L，Asn 0.5g/L，Phytagel 2.5g/L，pH为5.9。

生根培养基配方为：以1/2MS培养基为基础添加葡萄糖15g/L，Phytagel 2.5g/L，pH为5.9。

上述培养基配方中所述的基础MS培养基配方为(在公开的文献、教科书或技术类手册智能光都有报道):大量元素(KNO₃1.9g/L，NH₄NO₃1.65g/L，KH₂PO₄0.17g/L，MgSO₄﹒7H₂O0.37g/L，CaCl₂﹒2H₂O 0.44g/L)，微量元素(KI 0.83mg/L，H₃BO₃6.2mg/LMnSO₄﹒4H2O 22.3mg/L，ZnSO₄﹒7H₂O 8.6mg/L，Na₂MoO₄﹒2H₂O 0.25mg/L，CuSO₄﹒5H₂O 0.025mg/L，CoCl₂0.025mg/L)，铁盐(Na₂﹒EDTA 37.3mg/L，FeSO₄﹒7H₂027.8mg/L)，有机成分(肌醇100mg/L，Gly 2mg/L，VB₁0.1mg/L，VB₆0.5mg/L，VB₅0.5mg/L)。

D.转基因植株的鉴定

(1)转基因植株阳性检测及纯系检测

提取转基因植株幼嫩叶片的基因组DNA，DNA抽提采用天根生化科技(中国)有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒提取(具体操作步骤见该试剂盒的说明书)，以35s启动子正向引物和目的基因(GhEXLB₂)反向引物35s-S(5’-CCACTATCCTTCGCAAGACCCT-3’)和GhEXLB₂-R(5’-CAAAGAAATGAATGACTCTGGTGC-3’)进行PCR检测是否有相应T-DNA插入。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，28个循环；72℃延伸5min。

将收取的T₁代的种子剥去种皮，用0.1％升汞溶液杀菌10-12min，期间不断摇动，用无菌水冲洗3次，将种子置于棉花无菌苗培养基(含100mg/L卡那霉素)表面。30℃暗培养1.5d后扶苗，转移至光照室(3000Lux，15h/9h)培养，5-6d观察是否有抗性分离(长侧根植株为阳性转基因植株)。之后每一代单株留自交种进行筛选直至不发生抗性分离的即为转基因纯系，用作下一步表型分析和功能鉴定。

(2)转基因RNA水平检测

取T₃代转基因棉花植株主茎倒一叶提取RNA，RNA的抽提用Invitrogen公司的Trizol抽提试剂盒(具体操作步骤见该试剂盒的说明书)。

cDNA的合成是以2μg总RNA为模版，与1μl 500μg/ml oligo-dT(15)引物(购自Promega公司)，DEPC-water混合，总体积为14μl；然后70℃变性5min冰上骤冷；再加入10μl含有5μl RT buffer，1.25μl 10mM dNTP，1.75μl DEPC-water，1μlRibonucleaseInhibitor(购自Promega公司，美国)，和1μl SuperscriptⅢ反转录酶(购自Invitrogen公司，美国)的混合液；42℃温浴1h合成第一链；反应结束后70℃处理15min使SuperscriptⅢ反转录酶失活。每份cDNA稀释到200μl后于-20℃保存待用。以上述反转录合成的cDNA为模板，用引物GhEXLB₂-RTS和GhEXLB₂-RTA进行特异PCR扩增(扩增产物长347bp)。同时用GhUbiquitin7-F和GhUbiquitin7-R对棉花GhUbiquitin7(GenBank登陆号：DQ116441)基因做特异扩增(扩增产物长198bp)，作为内参对照进行相对定量分析。PCR反应体系的总体积为20μl，cDNA模板1ul、1×Taq酶反应缓冲液2μl、25mM MgCL₂1.2ul、2mM dNTP 1.5ul、10uM引物0.2ul、0.3单位Taq酶0.2μl，加ddH₂O至20μl。反应程序为：94℃变性5min，94℃30s、53℃30s、72℃30s 31个循环，72℃延伸5min。获得的PCR产物取10μl以0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。

结果表明：本发明克隆的GhEXLB₂基因在不同转基因株系中的表达量有差异。后续的功能验证研究中选取具有合适表达量的超量表达系mB2-2和mB2-12以及干涉系iB-4、iB-6和iB-11来进行分析(见图4)。

所用引物为：

GhEXLB₂-RTS：5'-CTGACAACAGAGGCAACGACTTTC-3'

GhEXLB₂-RTA：5'-GCTGCTGATACATCTCCACCATTT-3'

GhUbiquitin7-F：5'-GAAGGCATTCCACCTGACCAAC-3'

GhUbiquitin7-R：5'-CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG-3'

实施例4：利用转基因棉花对GhEXLB₂基因进行功能验证

具体步骤如下：

A.萌发期PEG处理及相关生理指标测定

将超表达mB2-2、mB2-12和干涉系iB2-4、iB2-6、iB2-11及对照YZ1T₃代种子用升汞杀菌清洗后置于不含PEG的无菌苗培养基和含PEG(-0.7MPa)的无菌苗培养基上。含PEG的无菌苗培养基的配制参照Verslues et at.,2006,Methods and concepts in quantifyingresistance to drought,salt and freezing,abiotic stresses that affect plantwater status.The Plant Journal 45:523-539(Verslues et al.2006)报道的方法，在28℃暗培养观察种子萌发。在不含PEG的无菌苗培养基上，各个转基因株系的萌发一致，在含PEG(-0.7MPa)的无菌苗培养基上，干涉系萌发慢于超表达两个株系。9d后，不含PEG的无菌苗培养基上各个转基因株系的主根和下胚轴长无明显差异，在含有PEG的无菌苗培养基上棉花主根下胚轴生长受到抑制，但超表达株系的主根根长和下胚轴长显著高于对照YZ1和干涉系。这说明本发明克隆的基因的超表达可以提高转基因株系对PEG的抗性，检测结果见图5A。取子叶进行H₂O₂含量测定，发现PEG处理后H₂O₂含量呈上升趋势，且处理后超表达系H₂O₂含量显著低于干涉系(见图5D)，表明超表达系清除干旱胁迫产生的活性氧能力较强。

B.两叶一心期幼苗水培PEG处理实验

将超表达mB2-2、mB2-12和干涉系iB2-4、iB2-6、iB2-11及对照YZ1T₃代种子用清水萌发后，幼苗在常规的Hoagland营养液中水培至两叶期，之后用13％浓度的PEG6000溶液进行处理，处理7天后发现干涉系iB2-4、iB2-6、iB2-11株系和对照品种的萎蔫程度较重，而超表达两个株系萎蔫程度较轻，转入正常培养液(Hoagland营养液)中进行缓苗处理，发现超表达两个株系恢复较快(结果见图6A)，表明超表达该基因可以增强转基因棉花对干旱的耐受性。进一步用PEG处理5天，取叶片测定膜脂过氧化程度(MDA含量)及活性氧(H₂O₂含量)，发现干涉系中H₂O₂含量显著升高，MDA含量在超表达系和干涉系之间无显著差异(见图6B和图6C)。

C.植株土培干旱处理及复水实验

将转基因棉花和野生型陆地棉YZ1种子用浓硫酸脱绒晒干后温水浸泡6h后催芽，播种于均匀的沙质细土(每盆质量相等)，放入温室培养，6周后进行水饱和试验，测定含水量后停止浇水进行干旱处理，观察植株的萎蔫程度。7天后观察到超表达系萎蔫较轻，而干涉系萎蔫严重，结果见图7A，并测定了叶片膜脂过氧化程度(MDA含量)发现正常生长条件下，各个系之间MDA含量并无明显差别，而在干旱情况下，MDA含量显著降低，且超表达系MDA含量显著低于对照野生型YZ1和干涉系(结果见图7B)，说明本发明克隆的基因能够提高植株的耐旱性。

D.GhEXLB₂转基因植株和YZ1植株PEG或干旱处理后生理指标的测定

1)过氧化氢定量测定。

在酸性环境中，过氧化氢可将Fe²⁺离子氧化成Fe³⁺离子，Fe²⁺离子再与染料分子结合形成Fe³⁺-染料复合物，该复合物在560nm(或595nm)处有最大吸收波长，且吸光值与过氧化氢的浓度成正比。

将转基因棉花子叶或叶片样品用液氮研磨，取0.1g左右的样品至2ml的离心管中，立即加入1.8ml预冷的80％丙酮，振荡20分钟，4℃，13000rpm/min离心15分钟，吸取上清液转入新的离心管用于后续实验。按照试剂盒H₂O₂quantification kit(购自Sangon Biotech公司，上海)提供的方法对转基因棉花样品进行过氧化氢定量测定。对不含PEG和含PEG的无菌苗上萌发9天后的各个转基因及对照(YZ1)株系棉花子叶和水培各个转基因及对照(YZ1)株系幼苗两叶期PEG处理5天后叶片双氧水含量测定发现，PEG能够提高植株体内的双氧水含量，即打破了细胞的氧化还原稳态，但是超表达系的双氧水升高明显低于对照和干涉系，说明在棉花中超表达GhEXLB₂基因有助于清除干旱胁迫导致的活性氧积累，测定结果见图5D和图6B。

2)丙二醛(MDA)含量的测定。

植物器官衰老或在非生物逆境条件下，膜脂发生过氧化作用，丙二醛是其中的产物之一，通常利用它作为膜脂过氧化指标。在PEG萌发处理9天后和干旱处理7天后取样进行MDA含量测定。称取0.1g左右的叶片，剪刀剪碎后加10％三氯乙酸(TCA)2mL，用预冷的研钵置于冰上研磨至匀浆状，倒入2mL离心管中。在12000rpm下冷冻(4℃)离心10min，取上清液0.8mL至新的2mL的离心管中，向其中加入0.6％硫代巴比妥酸(TBA)0.8mL，混合后在100℃沸水中煮15min后在冰上立即冷却后离心取上清。用分光光度计分别测定上清液在450nm、532nm和600nm处的吸光度值。并按公式算出MDA浓度，再算 出单位鲜重组织中的MDA含量(μmol/g)。结果计算按公式：C/μmol/L＝6.45(A532-A600)*(V1*V)/(V2*W)。其中V1为反应液总量，V2为反应中提取液量，V为提取液总量，W为样品质量。最终结果发现PEG处理的样品导致膜脂过氧化，超表达系的膜脂过氧化程度明显低于干涉系和对照，结果见图7B。

本实施例中用到的棉花无菌苗培养基配方为：0.02M KNO₃，0.02M NH₃NO₃，1.5mMMgSO₄，1.2mM KH₂PO₄，3mM CaCl₂，15g/L葡萄糖；pH6.2，phgtagel 2.5g/L。

特别说明：本专利申请获得中国"国家自然科学基金青年基金"项目资助。

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Claims (1)

1.一种从棉花中分离的GhEXLB₂基因在提高棉花耐旱性中的应用，其特征在于：该基因是序列表SEQ ID NO：1中第1-1151位碱基所示的序列。