CN104910263B

CN104910263B - 植物耐逆性相关蛋白TaPPR及其编码基因与应用

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Publication number: CN104910263B
Application number: CN201410089821.7A
Authority: CN
Inventors: 徐兆师; 马有志; 刘佳明; 李凤燕; 陈明; 李连城
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2014-03-12
Filing date: 2014-03-12
Publication date: 2018-03-13
Anticipated expiration: 2034-03-12
Also published as: CN104910263A

Abstract

本发明公开的一种植物耐逆性相关蛋白TaPPR及其编码基因与应用。本发明公开的一种蛋白，为如下（1）或（2）所示：（1）SEQ ID No.2所示的蛋白；（2）将SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。本发明公开的TaPPR基因在盐、BR、Al³⁺盐和低温的诱导下表达。TaPPR蛋白能够提高拟南芥对盐、BR、Al³⁺盐三种逆境的抗性，TaPPR基因过表达拟南芥对低温敏感。本发明公开的TaPPR蛋白和TaPPR基因为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物中发挥重要的作用。

Description

植物耐逆性相关蛋白TaPPR及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种植物耐逆性相关蛋白TaPPR及其编码基因与应用。

背景技术

干旱、高盐及低温等逆境胁迫是影响小麦生长、发育的障碍因子。因此，了解小麦对逆境条件的应答与信号传导机制，提高小麦品种的抗逆性，成为小麦遗传研究及小麦品种改良的重要任务之一。

在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的变化。明确植物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前，植物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平，并与遗传学和遗传工程研究相结合，探索用生物技术来改进植物生长特性，其目的是提高植物对逆境的适应能力。

在干旱、高盐和低温等环境胁迫的逆境条件下，植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整，以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱导表达，这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答，而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少伤害，增强对胁迫环境的抗性。较为明确的与胁迫相关的基因产物可以分为两大类：第一类基因编码的产物包括离子通道蛋白、水通道蛋白、渗透调节因子（蔗糖、脯氨酸和甜菜碱等）合成酶等直接参与植物胁迫应答的基因产物；第二类基因编码的产物包括参与胁迫相关的信号传递和基因表达调节的蛋白因子，如蛋白激酶、转录因子等。近年来研究发现，植物的PPR家族蛋白中有一部分蛋白也响应逆境胁迫，但响应机制仍不明确，需要深入研究。

植物PPR基因家族在拟南芥基因组测序完成时被鉴定出来，是35个氨基酸组成的PPR基序的串联重复（2~30次）。PPR基因广泛存在于真核生物基因组中，在陆生高等植物中尤其丰富，在拟南芥中有466个成员、水稻中480个成员。植物PPR家族可以分为P和PLS两个亚族。P亚族仅由PPR基序构成，如来自萝卜的Rfo，由17个P基序组成。PLS亚族（又称PCMP亚族）是陆生植物特有的基因家族，包含由P、L和S组成的特征性的三联体基序以及C末端结构域。PLS亚族的C末端结构域包括E、E+和DYW三个基序，根据C末端结构域的特征，PLS亚族又可以分为四个亚组：不包括任何C末端结构域的PLS亚组；C端只有E结构域的E亚组；C端有E和E+结构域的E+亚组；以及C端包括3种结构域的DYW亚组。PPR蛋白参与植物细胞器RNA编辑，及RNA成熟过程，包括RNA稳定、RNA剪切和加工。此外，PPR蛋白还参与植物细胞质雄性不育，PPR蛋白恢复育性的一般机制是在线粒体中抑制与细胞质雄性不育相关基因产物的积累。PPR蛋白在植物的叶绿体和胚胎早期发育中起着非常关键的作用，拟南芥的emb175（embryo-defective）编码一个与胚胎致死表型相关的叶绿体定位的DYW类PPR蛋白，clb19突变体在温室条件下是早期幼苗致死的。PPR家族蛋白数量大，表达模式多样，有些成员呈组成型表达，有些只在植物的特定组织或者发育的某一阶段特异性表达。在拟南芥中大多数PPR基因的表达量很低，但拟南芥线粒体PPR336表达量很高。近年来，研究发现有些PPR蛋白与非生物胁迫也有着密切联系，拟南芥PPR蛋白ABO5（ABA overly-sensitive5）参与线粒体转录本nad2内含子3的顺式剪切，在植物对ABA的响应中有重要作用。ppr40突变体早期对ABA的敏感性增强，晚期表现出萌发推迟、半矮化生长以及对盐胁迫敏感性增强。PPR蛋白PGN增加植物对真菌病原体的易感性以及对脱落酸(ABA)、葡萄糖、盐的敏感性，幼苗期盐胁迫条件下PGN缺失会大大增强活性氧积累。

综上所述，PPR蛋白家族是一类数量庞大，表达多样，功能复杂的蛋白家族，正是由于功能的多样性，阐明PPR蛋白的作用机制是一项艰巨的任务。研究PPR蛋白新的功能，对于完善对PPR蛋白的认识，阐释其作用机制具有重要意义。对于新发现的与非生物胁迫有关PPR蛋白，是今后研究PPR功能的一个新突破口。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物耐逆性相关蛋白TaPPR及其编码基因与应用。

本发明提供的一种蛋白，为如下（1）或（2）所示：

（1）SEQ ID No.2所示的蛋白；

（2）将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。

上述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

上述编码基因中，所述编码基因为如下中至少一种：

1）SEQ ID No.1所示的DNA分子；

2）在严格条件下与1）限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

3）与1）或2）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述蛋白质的DNA分子。

含有上述任一所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

一种制备耐逆性增强的转基因植物的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤：将上述任一所述编码基因导入出发植物中，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物的耐逆性增强；

所述耐逆性具体为耐盐性、耐外源油菜素内酯胁迫性或耐铝盐胁迫性；

所述耐逆性增强具体为所述植物在盐胁迫下，所述转基因植物的侧根比所述出发植物的侧根长；在外源油菜素内酯胁迫下，所述转基因植物的主根比所述出发植物的主根长；在铝盐胁迫下，所述转基因植物的主根比所述出发植物的主根长；

所述盐胁迫具体为在140mM NaCl的环境下；

所述外源油菜素内酯胁迫具体为在5uM外源油菜素内酯的环境下；

所述铝盐（Al³⁺）胁迫具体为在20uM氯化铝的环境下。

一种制备耐低温性降低的转基因植物的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤：将上述任一所述的编码基因导入出发植物中，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物的耐低温性降低；

所述低温具体为16℃。

上述任一所述的方法中，所述编码基因是通过重组表达载体导入的，所述重组表达载体是将所述编码基因插入出发载体pBI121的多克隆位点得到的。

上述任一所述的方法中，所述植物为拟南芥。

上述蛋白、上述任一所述的编码基因在提高植物耐逆性中的应用也属于本发明的保护范围；

所述耐逆性具体为耐盐性、耐外源油菜素内酯性或耐铝盐性；

或，

上述蛋白、上述任一所述的编码基因在降低植物耐低温性中的应用；

所述低温具体为16℃。

上述应用中，所述植物为拟南芥。

本发明提供的TaPPR基因在盐、BR、Al³⁺盐和低温的诱导下表达。TaPPR蛋白能够提高拟南芥对盐、BR、Al³⁺盐三种逆境的抗性，TaPPR基因过表达拟南芥对低温敏感。本发明提供的TaPPR蛋白和TaPPR基因为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物中发挥重要的作用。

附图说明

图1为TaPPR与水稻、玉米同源蛋白的氨基酸序列同源性比对结果。

图2为TaPPR基因在胁迫诱导表达下的实时荧光定量PCR图谱。

图3为NaCl处理下野生型和转基因拟南芥生长情况。

图4为外源油菜素内酯处理下野生型和转基因拟南芥生长情况。

图5为低温处理下野生型和转基因拟南芥生长情况。

图6为Al³⁺盐处理下野生型和转基因拟南芥生长情况。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

小白麦(Triticum aestivum cv.Xiaobaimai)在文献“孙海桃等.小麦TaDREB6转录因子互作蛋白的筛选，中国农业科学，2011,44（22）：4740-4747.”中公开过，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

pBI121购自Clontech公司。

转化农杆菌C58购自北京拜尔迪生物技术有限公司。

拟南芥哥伦比亚生态型Col-0（简称为野生型拟南芥）购自美国ARABIDOPSISBIOLOGICAL RESOURCE CENTER(ABRC)公司。

5′-Full RACE Kit with TAP试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司，产品目录号为6107。

3'-Full RACE Core Set with PrimeScript^TMRTase购自宝生物工程(大连)有限公司，产品目录号为6106。

实施例1、TaPPR基因的克隆

一、mRNA的分离

将水培生长10天左右的小白麦三叶期整株幼苗（包括根）用100mM的NaCl的水溶液浸泡处理2小时，得到处理后的幼苗，将幼苗用液氮速冻，-80℃保存备用。

采用Trizol法提取处理后的小白麦(Triticum aestivum cv.Xiaobaimai)幼苗叶片总RNA，并反转录合成第一链cDNA。

二、TaPPR基因全长序列的获得

（一）引物设计

设计引物直接从小麦cDNA中扩增TaPPR基因全长序列。

上游引物TaPPRF:5′-ATGCCGGCGGTGGC-3′

下游引物TaPPRR:5′-TCATCTGGAAACTGGCACAAATGA-3′

（二）以步骤一得到的cDNA为模板，以上游引物TaPPRF和下游引物TaPPRR为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

将PCR扩增产物进行测序，其序列如SEQ ID No.1所示，将其命名为TaPPR基因，该基因编码的TaPPR蛋白，由487个氨基酸残基组成，具有PPR和SMR结构域，如SEQ ID No.2所示。

TaPPR与水稻、玉米同源蛋白的氨基酸序列同源性比对结果如图1所示。

实施例2、实时荧光定量PCR分析TaPPR的表达特性

一、胁迫处理

将苗龄为10天的小白麦幼苗，进行以下处理：

（1）实验组1（干旱处理）：将水培的小白麦幼苗取出吸干根上的水分，置于干燥的滤纸上，干旱培养30分钟、1小时、2小时、6小时、12小时、24小时、48小时后取出材料，用液氮速冻，-80℃保存备用。

（2）实验组2（盐渍处理）：将水培的小白麦幼苗置于2g/100ml的由NaCl和Na₂SO₄组成的钠盐的水溶液中（NaCl与Na₂SO₄的质量百分比为3：2）中，光照培养30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时后分别取出材料，用液氮速冻，-80℃保存备用。

（3）实验组3（脱落酸处理）：将水培的小白麦幼苗置于200μM的脱落酸（ABA）水溶液中，光照培养30分钟、1小时、2小时、6小时、12小时、24小时、48小时后分别取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。

（4）实验组4（低温处理）：将水培的小白麦幼苗置于42℃下，光照培养30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时后分别取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。

各实验组均设置对照处理：直接取未经任何处理的水培的小白麦幼苗-80℃冻存作为对照（0小时）。

二、mRNA的分离

采用Quikprep Micro mRNA Purification Kit（购自Pharmacia）对步骤一各组小白麦幼苗整株（包括根）提取mRNA。

三.反转录为cDNA

采用R103-Quant_Reverse_Transcriptase（购自天根生化科技(北京)有限公司）将纯化的各mRNA反转录为cDNA。

四、实时荧光定量PCR

根据TaPPR序列，在其可变区设计特异引物PPRRTF和PPRRTR（目的产物大小为322bp）。以actin为内参基因，引物为actin-2F和actin-2R。

PPRRTF：5'-AGGAATCCAGATCCCTCATCG-3';

PPRRTR：5'-TGACCTGCCTTCCCATAGC-3'。

actin-2F:5'-CTCCCTCACAACAACCGC-3'；

actin-2R:5'-TACCAGGAACTTCCATACCAAC-3'。

各实验组中幼苗的TaPPR基因对各个胁迫或激素表现出的响应分别如图2A-2D所示。

图2表明，TaPPR基因对干旱、盐渍、脱落酸和低温有响应，可能参与逆境胁迫。

实施例3、TaPPR提高拟南芥的耐逆性

一、重组表达载体的构建

(一)TaPPR基因的克隆

根据TaPPR基因的序列设计引物对（TaPPR-121F和TaPPR-121R），引物末端分别引入SmaI和SpeI酶切识别位点，以小白麦的cDNA为模板，以TaPPR-121F和TaPPR-121R为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

TaPPR-121F：5'-TTACCCGGGATGCCGGCGGTGGC-3'；

TaPPR-121R：5'-AGAACTAGTTCATCTGGAAACTGGCACAAATGA-3。

（下划线所示序列为酶切识别位点）

将PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，回收纯化1.46Kb左右的条带。

（二）用限制性内切酶SmaI和SpeI双酶切步骤(一)回收纯化的PCR扩增产物，得到基因片段；SmaI和SpeI双酶切pBI121，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接得到重组质粒，将其命名为pBI121-TaPPR，将pBI121-TaPPR送测序，结果正确。

二、转基因植物的获得

（一）用重组质粒pBI121-TaPPR转化农杆菌C58得到重组农杆菌。

（二）将重组农杆菌接种于YEP液体培养基中，28℃、3000rpm培养约30小时，得到菌液。

（三）将步骤（二）的菌液转至YEP液体培养基（含50μg/ml利福平）中，28℃、300rpm培养约14小时（菌液OD600达到1.5-3.0）。

（四）收集菌体,4℃、4000g离心10min，用10g/100ml蔗糖（含体积百分含量0.02%silwet L-77）的水溶液稀释至OD600约为0.8-1.0。

（五）将拟南芥哥伦比亚生态型Col-0（野生型拟南芥）整株与花盆一起倒扣在盛有步骤（四）的菌液的容器中，使花浸泡50s左右，浸泡完毕后，取出花盆，侧放于托盘中，盖上黑色塑料布，24hr后揭开塑料布，直立放置花盆，进行正常的光照培养，收获T₁代种子，卡那霉素筛选（浓度为50μg/L卡那霉素）阳性植株。将阳性植株进行PCR鉴定，鉴定结果表明，得到5株转基因植株（转TaPPR基因植株）。

采用同样的方法将空载体pBI121转入野生型拟南芥，得到T₁代转空载体拟南芥。

分别将T₁代转TaPPR拟南芥和T₁代转空载体拟南芥播种、自交，直到得到T₃代转TaPPR拟南芥和T₃代转空载体拟南芥。

提取T₃代转TaPPR拟南芥植株的DNA，以TaPPR-121F和TaPPR-121R为引物进行PCR检测，得到含有长度约1.45Kb目的条带的阳性T₃代转TaPPR拟南芥植株。

提取T₃代转空载体拟南芥的基因组DNA，用TaWPK-121F和TaWPK-121R为引物进行PCR扩增，没有得到目的片段，说明T₃代转空载体拟南芥构建成功。

四、转基因植物的耐逆性鉴定

分别将T₃代转基因植株（PPR）、和拟南芥Col-0(WT，野生型)进行耐逆性鉴定。

(一)高盐逆境胁迫根长实验

分别将编号为PPR-1、PPR-2和PPR-3的T₃代阳性转TaPPR拟南芥（TaPPR）种子、T₃代转空载体拟南芥种子和野生型拟南芥种子(WT)播种在普通MS培养基上，生长7天后，进行抗胁迫性鉴定。每组实验设置三次重复，结果取平均值。

将处于相同生长期的幼苗转移到含有140mM NaCl的MS培养基上继续培养7天，观察生长情况,如图3A所示。测量在含有NaCl的MS培养基生长7天的拟南芥幼苗侧根长和主根长，分别如图3B和3C所示。

图3B表明，转TaPPR拟南芥侧根长明显高于野生型拟南芥侧根长，图3C表明，转TaPPR拟南芥主根长约是野生型拟南芥主根长的1/2。

T₃代转空载体拟南芥和野生型拟南芥的结果无显著差异。

结果显示，三个转TaPPR拟南芥株系在140mM NaCl的处理下侧根长均明显长于野生型拟南芥,主根长短于野生型拟南芥。

（二）低温逆境胁迫根长实验

分别将编号为PPR-1、PPR-2和PPR-3的阳性T₃代转TaPPR拟南芥（TaPPR）种子、T₃代转空载体拟南芥种子和野生型拟南芥种子(WT)播种在普通MS培养基上，4℃春化7天后，22℃培养7天。每组实验设置三次重复，结果取平均值。

将处于相同生长期的幼苗转移到普通的MS培养基上，16℃继续培养7天，观察生长情况,如图4A所示，测量在低温处理下生长7天的拟南芥幼苗侧根长，如图4B所示。

图4表明，转TaPPR拟南芥的侧根长没有野生型拟南芥根长发达，主根长约是野生型拟南芥的1/2。

T₃代转空载体拟南芥和野生型拟南芥的结果无显著差异。

结果显示，三个转TaPPR拟南芥株系在低温处理下侧根长均明显低于野生型,主根长不如野生型。

（三）外源油菜素内酯（BR）胁迫下根长实验

将处于相同生长期的幼苗转移到含有5uM BR的MS培养基上继续培养7天，观察生长情况,如图5A所示。测量在含有BR的MS培养基生长7天的拟南芥幼苗的主根长，如图5B所示。

图5表明，三个转TaPPR拟南芥株系的主根长明显长与野生型拟南芥主根长，优势非常明显。

T₃代转空载体拟南芥和野生型拟南芥的结果无显著差异。

结果显示，三个转TaPPR拟南芥株系在5uM油菜素内酯(BR)的处理下主根长均明显高于野生型。

（四）外源铝盐（Al³⁺）胁迫下根长实验

分别将编号为PPR-1、PPR-2和PPR-3的阳性T₃代转TaPPR拟南芥（TaPPR）种子、T₃代转空载体拟南芥种子和野生型拟南芥种子(WT)播种在普通MS培养基上，生长7天后，进行抗胁迫性鉴定。每组实验设置三次重复，结果取平均值。

将处于相同生长期的幼苗转移到含有20uM AlCl₃的MS培养基上继续培养7天，观察生长情况,如图6A所示。测量在含有AlCl₃的MS培养基生长7天的拟南芥幼苗的主根长，如图6B所示。

转基因拟南芥主根长明显长与野生型拟南芥的主根长，优势非常明显。

T₃代转空载体拟南芥和野生型拟南芥的结果无显著差异。

结果显示，三个转基因株系在20uM AlCl₃的处理下主根长均明显高于野生型拟南芥的主根长，表明转基因拟南芥抗铝毒胁迫能力强于野生型。

总结以上实验结果，三个转TaPPR拟南芥株系在140mM NaCl、5uM油菜素内酯(BR)、20uM AlCl₃的处理下，抗逆性强于野生型拟南芥,三个转TaPPR拟南芥株系在低温处理下，抗逆性弱于野生型拟南芥。

Claims

1.一种蛋白，为SEQ ID No.2所示的蛋白。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为SEQ ID No.1所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、表达盒或重组菌。

5.一种制备耐逆性增强的转基因植物的方法，包括如下步骤：将权利要求2或3所述编码基因导入出发植物中，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物的耐逆性增强；

所述耐逆性为耐盐性、耐外源油菜素内酯胁迫性或耐铝盐胁迫性；

所述耐逆性增强具体为在盐胁迫下，所述转基因植物的侧根比所述出发植物的侧根长；在外源油菜素内酯胁迫下，所述转基因植物的主根比所述出发植物的主根长；在铝盐胁迫下，所述转基因植物的主根比所述出发植物的主根长。

6.一种制备耐低温性降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：将权利要求2或3所述编码基因导入出发植物中，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物的耐低温性降低；

所述低温为16℃。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述编码基因是通过重组表达载体导入的，所述重组表达载体是将所述编码基因插入出发载体pBI121的多克隆位点得到的。

8.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述植物为拟南芥。

9.权利要求1所述的蛋白、权利要求2或3所述的编码基因在提高植物耐逆性中的应用；

所述耐逆性为耐盐性、耐外源油菜素内酯性或耐铝盐性。

10.权利要求1所述的蛋白、权利要求2或3所述的编码基因在降低植物耐低温性中的应用。

11.根据权利要求9或10所述的应用，其特征在于：所述植物为拟南芥。