CN1412199A - 小麦TaDREB,其编码基因及培育耐逆植物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新的小麦TaDREB基因，该基因编码含AP₂/EREBP结构域的DREB转录因子。本发明还提供了利用本发明的基因培育耐逆植物的方法。

Description

小麦TaDREB，其编码基因及培育耐逆植物的方法

技术领域

本发明涉及一种AP₂/EREBP类转录因子DREB，具体地说明，本发明涉及一种来源于小麦(Triticum aestivum)的AP₂/EREBP类转录因子DREB，命名为TaDREB。本发明还涉及编码这类转录因子的基因，含有这类基因的载体，和利用这类基因培育耐逆植物的方法。

技术背景

环境中物理化学因素的变化，例如：干旱、盐碱和冷害使得农作物大规模减产。因此，培育耐逆性作物是种植业的主要目标之一。高等植物细胞可有多种途径感受外界环境中物化参数的变化，从而将胞外的信号变为胞内信号，通过系列的磷酸化级联反应将信号传递给转录因子，转录因子再作用于功能基因，启动逆境应答的基因的表达从而提高植物的耐逆性。在植物中，AP₂/EREBP类DREB转录因子家族中的一类能接受环境胁迫信号并且启动逆境应答基因。小麦(Triticum aestivum)是重要的粮食作物。培育耐寒，耐盐，耐旱的作物新品种是小麦生产中的重要任务之一。发明人已从小麦中克隆了DREB转录因子，命名为TaDREB。该基因的表达受干旱、盐、冷诱导。构建了分别适用于单、双子叶植物的表达载体，转化单子叶模式植物水稻。转基因植株具明显的耐逆性。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种具有较强耐逆效果的TaDREB转录因子，该转录因子来源于小麦(Triticum aestivum)，其氨基酸序列示于图1和SEQ ID NO：2。图1中所示的序列代表了小麦中DREB转录因子家族。应当指出的是，对本发明的转录因子进行一个或多个氨基酸的替换、插入和/或缺失所得到的功能类似物也能达到本发明的目的。因而，本发明也包括与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有至少90％同源性，优选具有至少95％的同源性，但同时具有小麦DREB转录因子活性的功能类似物。

本发明的另一个目的是提供一种编码转录因子TaDREB的基因，在图1和SEQ ID NO：1中所示的基因代表了小麦中的一种DREB转录因子家族，它们都含有保守的AP₂/EREBP结构域序列。但不限于所列的序列。

本发明的再一个目的是提供一种培育耐逆植株的方法，该方法包括用本发明的转录因子TaDREB基因构建植物表达载体；用构建的表达载体转化植物组织；将转化的植物组织培育成植株。

本发明的又一个目的是提供一种含有所提及的TaDREB类转录因子的表达载体(图2)。可使用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的表达载体。这些植物表达载体包括但不限于，双元农杆菌载体，例如Bin19(Bevan，M.，1984，核酸研究，12：8711-8721)，含DRE元件的启动子以及用于单子叶植物微弹轰击的载体。载体还可包括3’非翻译区域。3’非翻译区域是指一种基因的部分，它含有一种包含聚腺苷酸信号和任何其它的可效应mRNA加工或基因表达的DNA片段。聚腺苷酸信号引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。3’区域的例子包括含有农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(例如胭脂碱合成酶(Nos基因))，和植物基因(例如大贮存蛋白基因)的3’转录的非翻译区。本发明的DREB转录因子的3’非翻译区域可被用于在植物中表达。

本发明的载体也可含有适当的启动子。在本发明中可使用任何一种强启动子。这些启动子包括但不限于花椰菜花叶病毒(CAMV 35S)和Ubiqutin启动子。它可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。

本发明的表达载体在需要时也可包括增强子，不论是翻译增强子或转录增强子。这些增强子区域包括但不限于ATG起始密码子和邻接区域。起始密码子必需与编码序列的阅读框同相，以保证整个序列的翻译。翻译控制信号和起始密码子可以是多种不同的来源，可以是天然的或合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域，或来自结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植株进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，包括加入植物可选择性标记。可使用的选择性标记包括对抗生素抗性的酶，抗生素包括庆大霉素、潮霉素、卡那霉素等。同样，可使用产生通过颜色变化(例如GUS)或发光(例如荧光酶)耒识别的化合物的酶，或抗化学试剂(例如除莠剂)。另外，也可不用任何筛选标记。

本发明的表达载体可通过使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体，直接的DNA转化，微注射，电穿孔等导入植物细胞。对这些技术的综述参阅Weissbach和Weissbach，植物分子生物学方法(Method for PlantMolecular Biology)，Academy Press，New York VIII，pp.421-463(1988)；和Geiserson和Corey，植物分子生物学(Plant Molecular Biology)，第二版(1988)。

可使用本发明的方法转化的植物宿主包括单子叶植物和双子叶植物，例如：水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

附图简要说明

图1表示TaDREB基因的核苷酸和推导的氨基酸序列；

图2表示TaDREB植物表达载体的构建；

图3表示不同胁迫下经RT-PCR检测的TaDREB基因的表达特征；

图4表示TaDREB基因在小麦基因组中的组成分析。

实施例

一、小麦cDNA文库构建及转录因子TaDREB cDNA克隆，序列分析小麦种在盆中，14天后，取出，在2.0％ NaCl溶液中浸泡3-5小时。cDNA文库构建按Sambrook(1987)方法进行。收集新鲜全株叶片1g在液氮中研碎，悬于4mol/L硫氢酸胍中，混合物用酸性苯酚、氯仿抽提，上清中加入无水乙醇沉淀总RNA，之后，溶于水。经mRNA纯化试剂盒处理得到mRNA。取2ug mRNA进行逆转录反应，然后再进行二链合成。双链cDNA与EcoR1接头连接后磷酸化，经制备离心柱(Sephacryl-400)去除多余接头，然后与酶切的脱磷pExcell，载体(Pharmacia)连接，取5ul连接产物加入包装蛋白，建成cDNA文库。

以拟南芥DREB cDNA为探针筛选了4.5×10⁵未扩增斑得到3个阳性斑，其扦入片段为1.29kb。该片段包括834bp的开放读码框架，编码由278个氨基酸组成的多肽，其5’端为251bp，3’端为173bp。小麦TaDREB cDNA全序列及氨基酸序列见图1。

二.TaDREB cDNA植物表达质粒的构建和农杆菌介导转化拟南芥

TaDREB cDNA植物表达载体的构建按常规方法进行。双元表达载体pB1121含35S启动子和翻译增强子TMV的片段。将含35S启动子的植物表达载体直接转化农杆菌，拟南芥生态型Col-0植株用于农杆菌转化，农杆菌菌株为EH105。

1.植物材料准备

(1)将拟南芥Col-0种子在4℃条件下春化72小时。用1/3×B₅营养液浸泡装有蛭石(vermiculite)的种植盆，播种后于23℃培养。

(2)待植株开花后，剪去其主枝顶端，促进侧枝发展。在剪枝后的4-6天内，着手准备农杆菌转化。

2.农杆菌培养

(3)将构建好的带有外源基因的表达载体电击转化农杆菌，PCR和酶切检查无误后摇菌。

(4)将农杆菌接种于5ml LB+50μg/ml rifampin+50μg/ml卡那霉素培养基中，摇菌过夜。第二天转瓶至1升LB培养基中，28℃培养至OD₆₀₀＝0.8左右。

(5)离心收集菌体，用1升转化缓冲液悬浮农杆菌。约300-400ml能转化2盆植株。

3.抽真空转化

(6)将剪枝后4-6天的植株倒置于含转化缓冲液的玻璃瓶中，抽真空，维持0.05Mpa压力5-10分钟。

(7)取出种植盆，侧放24小时。然后将种植盆直立，按往常的方法培育植株至结实，收获成熟种子。

三、基因植株的耐逆性鉴定

将转基因植株和对照植株分别移栽到含150mM，200mM和250mMNaCl的MS培养基中继续生长，在多个盐浓度下，转基因植株生长发育良好而对照植株逐渐发白萎蔫，四周后全部死亡。

四.TaDREB基因在小麦基因组中的分析

以TaDREB为探针，在不同严谨度下进行Southern Blot分析，当在65℃下洗膜时，呈现多条杂交带，表明小麦基因组中存在着TaDREB基因的多个拷贝。在低严谨条件45℃下洗膜时的带型与65℃一致，表明TaDREB基因在小麦基因组中的没有其它同源类似物(图4)。

五、小麦TaDREB在逆境中的表达特征

以2.0％NaCl，20％PEG及30mM ABA溶液和4℃低温处理小麦1天，分别在0，2，5，24小时收集叶片，提取RNA作RT-PCR及Northern分析。结果表明TaDREB的转录在叶中受盐，干旱和ABA胁迫和低温逆境的不同程度诱导(图3)。

                   序列表<110>中国科学院遗传研究所

清华大学<120>小麦TaDREB、其编码基因以及培育耐逆植物的方法<130>I2001271<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1292<212>DNA<213>Triticum aestivum<220><221>CDS<222>(252)..(1085)<223><400>1caaaaccaag gcggcggcag cggggcggga gagcggggag caccgaccga caccggccga     60cagggtgggc tgcatgcgga gctgaggcga ggcgaggcga ggcggggaga gatccggcgc    120gggtgccacc gccggccggc cgcgggagat ctggttggtg gcgccgcccg gataagggag    180aggcggcgag gggagagcag ccgggggaga ccgaggcgag aggagatctc tctcgtccct    240cttctcgctc c atg gag acc ggg ggt agc aag cgg gaa gga gac tgc ccc     290

         Met Glu Thr Gly Gly Ser Lys Arg Glu Gly Asp Cys Pro

         1               5                   10ggg cag gaa agg aag aag aaa gtg cgc agg aga agc act ggt cct gat      338Gly Gln Glu Arg Lys Lys Lys Val Arg Arg Arg Ser Thr Gly Pro Asp

15                  20                  25tcg gtt gct gaa acc atc aag aag tgg aag gag gaa aac cag aag ctc      386Ser Val Ala Glu Thr Ile Lys Lys Trp Lys Glu Glu Asn Gln Lys Leu30                  35                  40                  45cag caa gag aat gga tcc cgg aaa gca ccg gcc aag ggt tcc aag aaa      434Gln Gln Glu Asn Gly Ser Arg Lys Ala Pro Ala Lys Gly Ser Lys Lys

            50                  55                  60ggg tgc atg gca ggg aaa gga ggt cca gag aat tca aac tgc gct tac     482Gly Cys Met Ala Gly Lys Gly Gly Pro Glu Asn Ser Asn Cys Ala Tyr

        65                  70                  75cgc ggt gtg agg cag agg acg tgg ggg aaa tgg gtt gct gag atc cgt     530Arg Gly Val Arg Gln Arg Thr Trp Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile Arg

    80                  85                  90gag ccc aac cgt ggc aat cgg ctg tgg ctt ggt tca ttc cct acc gca     578Glu Pro Asn Arg Gly Asn Arg Leu Trp Leu Gly Ser Phe Pro Thr Ala

95                  100                 105gtc gaa gct gca cgt gca tat gat gat gcg gca agg gca atg tat ggc     626Val Glu Ala Ala Arg Ala Tyr Asp Asp Ala Ala Arg Ala Met Tyr Gly110                 115                 120                 125gcc aaa gca cgt gtc aac ttc tca gag cag tcc ccg gat gcc aac tct     674Ala Lys Ala Arg Val Asn Phe Ser Glu Gln Ser Pro Asp Ala Asn Ser

            130                 135                 140ggt tgc acg ctg gca cct cca ttg ccg atg tct aat ggg gca acc gct     722Gly Cys Thr Leu Ala Pro Pro Leu Pro Met Ser Asn Gly Ala Thr Ala

        145                 150                 155gcg tca cat cct tct gat ggg aag gat gaa tcg gag tct cct cct tct     770Ala Ser His Pro Ser Asp Gly Lys Asp Glu Ser Glu Ser Pro Pro Ser

    160                 165                 170ctt atc tca aat gcg ccg aca gct gcg ctg cat cgg tct gat gct aag     818Leu Ile Ser Asn Ala Pro Thr Ala Ala Leu His Arg Ser Asp Ala Lys

175                 180                 185gat gag tct gag tct gca ggg acc gtg gca cgt aag gtg aaa aaa gaa     866Asp Glu Ser Glu Ser Ala Gly Thr Val Ala Arg Lys Val Lys Lys Glu190                 195                 200                 205gtg agc aat gat ttg aga agt acc cat gag gag cac aag acc ctg gaa     914Val Ser Asn Asp Leu Arg Ser Thr His Glu Glu His Lys Thr Leu Glu

            210                 215                 220gta tcc caa cca aaa ggg aag gct tta cat aaa gca gcg aac gta agt     962Val Ser Gln Pro Lys Gly Lys Ala Leu His Lys Ala Ala Asn Val Ser

        225                 230                 235tat gat tac ttc aac gtc gag gaa gtt ctt gac atg ata att gtg gaa    1010Tyr Asp Tyr Phe Asn Val Glu Glu Val Leu Asp Met Ile Ile Val Glu

    240                 245                 250ttg agt gct gat gta aaa atg gaa gca cat gaa gag tac caa gat ggt    1058Leu Ser Ala Asp Val Lys Met Glu Ala His Glu Glu Tyr Gln Asp Gly

255                 260                 265gat gat ggg ttt agt ctt ttc tca tat tagggtttta gctatgaggg            1105Asp Asp Gly Phe Ser Leu Phe Ser Tyr270                 275ttgcagtcat gcggagcaat agggataact ttcattctag ctgctaggaa atacttcaaa    1165tctgcaaccc gaagctttgt agtcacttat ggttttcatc ttactggaga gaatagcttt    1225ataccataag tcaacgggta caagaagttg tcctgtgcgt tgagttcatg tactatggta    1285aaagttg                                                              1292<210>2<211>278<212>PRT<213>Triticum aestivum<400>2Met Glu Thr Gly Gly Ser Lys Arg Glu Gly Asp Cys Pro Gly Gln Glu1               5                   10                  15Arg Lys Lys Lys Val Arg Arg Arg Ser Thr Gly Pro Asp Ser Val Ala

        20                  25                  30Glu Thr Ile Lys Lys Trp Lys Glu Glu Asn Gln Lys Leu Gln Gln Glu

    35                  40                  45Asn Gly Ser Arg Lys Ala Pro Ala Lys Gly Ser Lys Lys Gly Cys Met

50                  55                  60Ala Gly Lys Gly Gly Pro Glu Asn Ser Asn Cys Ala Tyr Arg Gly Val65                  70                  75                  80Arg Gln Arg Thr Trp Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile Arg Glu Pro Asn

            85                  90                  95Arg Gly Asn Arg Leu Trp Leu Gly Ser Phe Pro Thr Ala Val Glu Ala

        100                 105                 110Ala Arg Ala Tyr Asp Asp Ala Ala Arg Ala Met Tyr Gly Ala Lys Ala

    115                 120                 125Arg Val Asn Phe Ser Glu Gln Ser Pro Asp Ala Asn Ser Gly Cys Thr

130                 135                 140Leu Ala Pro Pro Leu Pro Met Ser Asn Gly Ala Thr Ala Ala Ser His145                 150                 155                 160Pro Ser Asp Gly Lys Asp Glu Ser Glu Ser Pro Pro Ser Leu Ile Ser

            165                 170                 175Asn Ala Pro Thr Ala Ala Leu His Arg Ser Asp Ala Lys Asp Glu Ser

        180                 185                 190Glu Ser Ala Gly Thr Val Ala Arg Lys Val Lys Lys Glu Val Ser Asn

    195                 200                 205Asp Leu Arg Ser Thr His Glu Glu His Lys Thr Leu Glu Val Ser Gln

210                 215                 220Pro Lys Gly Lys Ala Leu His Lys Ala Ala Asn Val Ser Tyr Asp Tyr225                 230                 235                 240Phe Asn Val Glu Glu Val Leu Asp Met Ile Ile Val Glu Leu Ser Ala

            245                 250                 255Asp Val Lys Met Glu Ala His Glu Glu Tyr Gln Asp Gly Asp Asp Gly

        260                 265                 270Phe Ser Leu Phe Ser Tyr

    275

Claims (10)

1.一种来源于小麦的AP₂/EREBP类转录因子TaDREB或其功能类似物，其氨基酸序列与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有至少90％的同源性。

2.按照权利要求1所述的转录因子或其功能类似物，其氨基酸序列与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有至少95％的同源性。

3.按照权利要求1所述的转录因子或其功能类似物，它具有SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列。

4.一种编码权利要求1至3中任意一项所述的小麦的AP₂/EREBP类转录因子TaDREB或其功能类似物的基因。

5.按照权利要求4所述的基因，它具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

6.一种含有权利要求4或5所述的TaDREB转录因子或其功能类似物的基因的植物表达载体。

7.按照权利要求6所述的植物表达载体，其中，所述的植物表达载体是双元农杆菌载体。

8.一种培育耐逆性植株的方法，包括用权利要求4或5所述的TaDREB转录因子或其功能类似物的基因构建植物表达载体；用构建的表达载体转化植物细胞；和将转化的植物细胞培育成植株。

9.按照权利要求8所述的方法，其中，所述的转化是通过农杆菌介导或基因枪法进行的。

10.按照权利要求8所述的方法，其中所述的植物是单子叶植物或双子叶植物。

Images