CN103755793B - 极端耐旱齿肋赤藓4个dreb转录因子及其编码基因 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了极端耐旱齿肋赤藓4个DREB转录因子基因及其编码基因，所述4个转录因子具有SEQ ID NO:5‑8所示的氨基酸序列，4个转录因子基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1‑4所示，其基因编码区长分别是ScDREB5‑3为685bp,ScDREB5‑6为681bp,ScDREB5‑8为519bp,ScDREB5‑10为1165bp；4个转录因子基因均为脱落酸依赖型，并且对干旱、高盐、低温和高温四种非生物胁迫有响应，但响应模式不尽相同。此外，转化这4个转录因子基因的酵母菌在干旱、高盐、冷、热胁迫下的存活率都高于对照非转基因酵母菌，说明极端耐旱藓类齿肋赤藓4个DREB类转录因子基因ScDREB5‑3，ScDREB5‑6，ScDREB5‑8，ScDREB5‑10均具有非生物胁迫的抗性。本发明可以用于作物非生物胁迫转基因育种研究。

Description

极端耐旱齿肋赤藓4个DREB转录因子及其编码基因
技术领域
本发明涉及一种极端耐旱藓类植物齿肋赤藓4个DREB转录因子及编码基因，4个极端耐旱藓类植物齿肋赤藓DREB转录因子ScDREB5-3、ScDREB5-6、ScDREB5-8、ScDREB5-10及其编码基因，利用该基因在提高酵母抗旱、高盐、耐低温及高温胁迫等抗逆性方面的应用，属于植物基因工程技术领域。
背景技术
DREB转录因子(Dehydration Responsive Element Binding protein)，即干旱应答元件结合蛋白，属于AP2/EREBP类基因家族，特异存在于植物中。DREB与抗逆基因启动子区域中的DRE/CRT(dehydration-responsive element)顺式作用元件结合，其核心序TACCGACAT，启动下游一系列的有DRE顺式作用元件的抗逆基因的表达，广泛参与干旱、高盐，热等胁迫应答反应，从而能从整体上提高植物的抗逆性。
自1994年Yamaguchi-Shinozaki从拟南芥中首次检测到DRE作用的蛋白因子并命名为DREB1,到1997年Stockinger等首次从拟南芥cDNA文库中克隆到AtCBF1以来，DREB／CBF转录因子基因的克隆一直是植物分子生物学的热点。目前已从拟南芥、水稻、玉米、小麦、黑麦、大豆、西红菜，棉花，芦荟等几十种植物中分离并鉴定出调控干早、高盐及低温耐性的DREB基因，并利用这些基因得到了抗逆性增强的拟南芥、烟草、油菜、西红柿、小麦等转基因植株。从文献报道来看，目前关于抗逆转录因子DREB的功能及转录调控的研究大部分来自模式植物拟南芥及经济作物水稻，小麦等，而对自然界天然存在的抗逆能力极强的植物资源却尝试较少，以天然抗逆性强的野生植物资源为基因克隆材料将是一个有价值的尝试。此外，目前有关DREB基因的研究多局限于草本植物领域，对于较为低等的苔藓植物中DREB的研究很少，仅见于模式藓类小立碗藓中的一例报道（Liu等，2007）。
另外，以往服务于分子育种的DREB基因的克隆和转化研究主要是针对单个DREB基因，没有比较和筛选，因此往往出现供转化基因有限及转化后转基因效果不理想等问题。这也是目前大部分的转基因研究费钱，费时，费力的主要原因所在。因此，要想避免下游应用研究的盲目性，必须对上游基因的克隆和筛选工作严加把关，挑选优质的（抗逆性增强且不影响生物量和产量）抗逆基因资源进行下一步的作物抗逆分子改良育种。以基因家族为比较研究单位，系统全面的克隆和分析特定基因家族，从众多家族成员中筛选最有潜力的抗逆基因，有方向有重点的对一个或少数几个优质基因进行转化将是一条新的思路，能有效地解决一直以来对单个基因研究的局限性及用单个基因转化农作物育种研究的盲目性的问题。
综上，植物中还存在大量的DREB基因及其家族尚待挖掘和研究。尤其从天然极端抗逆的荒漠苔藓植物中克隆DREB基因并进行抗逆育种鲜见报道且颇具潜力(Xu等,2011)。同时，站在DREB基因家族的高度，通过比较与筛选进而克隆得到功能更为强大的基因元件用于作物的遗传改良，避免的基因克隆的盲目性，具有更为准确、高效的意义，是一条值得尝试的全新道路。
齿肋赤藓(Syntrichia Caninervis,又名Tortula Caninervis)，隶属丛藓科赤藓属，为典型的旱生苔鲜植物，是构成古尔班通古特沙漠藓类生物结皮的优势种(张等,2006)。该藓具有极强的综合抗逆性，如抗旱，抗高温，低温等,是优良的开展抗逆研究的好材料。齿肋赤藓自然干燥状态下呈灰黑色，似一层“壳”分布在沙漠表面，形成有重要生态意义的苔藓生物结皮（Putzer等,2002），一旦遇到降水，齿肋赤藓即在30s内迅速通过再水化过程而“复原”呈鲜活的绿色，并开始执行光合作用，是典型的复苏植物代表。其迅速的复水过程及抗旱性、耐热性等的分子调控机制已成为国内外相关科学的研究热点。目前，本项目组还建立了齿肋赤藓茎叶体脱水状态(24h)以及复水0.5、6、12h的4个转录组以及相应的4个蛋白谱数据，为在基因家族高度研究抗逆相关基因，比较其功能，筛选最强的抗逆基因奠定基础。
因此，在比较筛选基础上，开展极端耐旱藓类齿肋赤藓抗旱相关DREB转录因子基因的克隆，对于深入理解该种的耐旱机理及开发利用抗逆基因资源，定向培育植物新品种均有重要价值。
发明内容
本发明的第一个目的在于为了解决目前可利用的DREB转录因子比较少的问题，提供极端耐旱藓类植物齿肋赤藓4个DREB转录因子ScDREB5-3、ScDREB5-6、ScDREB5-8、ScDREB5-10，其氨基酸序列由SEQ ID NO:5-8所示。
本发明的第二个目的在于提供编码齿肋赤藓4个DREB转录因子编码基因ScDREB5-3、ScDREB5-6、ScDREB5-8、ScDREB5-10基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1-4所示。
本发明的第三个目的在于，所述4个齿肋赤藓ScDREB5-3、ScDREB5-6、ScDREB5-8、ScDREB5-10转录因子基因在培育抗逆生物，尤其是抗非生物胁迫生物品种中的应用。
本发明所述的一种极端耐旱齿肋赤藓4个DREB转录因子及编码基因，该基因4个DREB转录因子为ScDREB5-3、ScDREB5-6、ScDREB5-8和ScDREB5-10，它们具有SEQ ID NO:5-8所示的氨基酸序列为：
SEQ ID NO:5ScDREB5-3氨基酸序列
MVEKNASQRAASDSRLEFLGVTKAKAKNEKAPSSPKYKGVRMRQWGKWVSEIREPNKRSRIWLGSFPTAEMAAKAYDAAVVCLRGSNAELNFPDSPPRVVPTCTSPKDVQIAAAAAAAAADPCTPVSLPALGAQPVAQSLETQLHKMDSSAVECVAESSPACSFVTLDQVELAWSDMKFIDLPPLEDLVDSSEQSSTSSAVYCRVSSGPLERNIMDNCYNVFAV
SEQ ID NO:6ScDREB5-6氨基酸序列
MVTSWKKCRRTSSEHAPPRRRRDALKKLVGKIVHSIVPESSSEYRGVRYRVELNKYVTEIRPSRSTKKIWLGTYDTAEEAARAFDIGNLCCKKNLPLNFADSPGMLKKISSRLSPDATRNAIAQLAKEVAALQAVVRTQKLETETSGVTYTEILQEQVATVMDCEEEEAVATTMPLQAADEGGSGSGYSWSFDLRTIFTADDNANVPLHKLINFGSSESIYVHTYP
SEQ ID NO:7ScDREB5-8氨基酸序列
MPGMAPSAWRLGAGAGVMKVERREVVEKVCKDREDRDIDLNVPYVMEEESMSATSSTSGEKGGSGASDEVHYRGGAGDASYRGVRHRPELNKWVTEIRPTAQKRKIWLGTYKTPEEAARAYDVGIHYTGKKIPLNFPDSMPNLPELPRGTWEEIAPFVKKQAVSAAKRHRGF
SEQ ID NO:8ScDREB5-10氨基酸序列
MAGEEAPSTLCRIWSAITPLMRFKNKIREHLWASSLLNDPDLHRETETASTLPEQHYYDASSQAFEAASPPAVTASFYDNPGDLATQLQAMQRNAHAEPEVYMSLDDFPVELISQPISADSYHRSTSEPISEDSYDRSISEPISEDSYDRSMSQPISEDSYLRSMSQPIEEDFTSDGADDDQSSEMMDTGAESSDLRRESSAEEWQQIMFFRHFFGMDSTVPPVPGWTVVVGIVSVFKRITGLIRQRRQERAQNQVAVVPRPRRRRAVVVTRYKGIRPRNGKWVSEIRIGGTKEKVWLGSYNTEKEAALAFDAGKHHCSLLRRTRGFNFNDSPRFLGPPQRFEHLTSEKRRENIKRLAEEHALTYASADIR
所述基因中4个齿肋赤藓转录因子ScDREB5-3、ScDREB5-6、ScDREB5-8、ScDREB5-10的氨基酸序列中ScDREB5-3基因编码224个氨基酸，ScDREB5-6基因编码226个氨基酸，ScDREB5-8基因编码172个氨基酸，ScDREB5-10基因编码371个氨基酸。
所述基因中4个基因核苷酸序列SEQ ID NO:1-4所示为：
SEQ ID NO:1ScDREB5-3基因的核苷酸序列
GGCGGTTAAGGGAGCGCGTCACCCAGAACATCCAAGTGGCAATTTCCGCGAAGGTGAGACCTTCACACCTGTCCTGT
TGCCTTGGGATTCATGTGTCTCGGAGTCGGGTATATATGCCGCTTCGAGCTCTGAAAAGAGGAAAAGTAGCTGTGTG
AAGGTCGATATCAGAGACTGAAGAGAGCAAGAGACCGAAGCAGGAAAGACAGGAAGGAGAGCAAGTCATTGAAGCAG
GAAAGACAGGAAGTAGAGCAAGGCATTGAAGCAGGAAAGAAAGGAATGGTGGAGAAGAACGCCAGCCAGAGAGCAGC
GTCGGACAGTCGTCTAGAGTTTCTGGGAGTGACCAAGGCCAAGGCGAAGAATGAGAAGGCGCCTTCGAGTCCCAAGT
ACAAGGGCGTGCGCATGCGGCAGTGGGGAAAGTGGGTGAGCGAGATTCGGGAGCCCAATAAGCGGTCGAGGATATGG
CTGGGCTCGTTTCCCACAGCGGAGATGGCTGCTAAGGCGTACGACGCTGCCGTCGTGTGCTTGCGGGGCTCCAACGC
GGAACTCAACTTCCCCGACTCGCCTCCGCGCGTGGTCCCCACCTGTACCTCGCCCAAGGACGTGCAGATCGCCGCCG
CGGCTGCCGCGGCCGCTGCGGACCCGTGCACTCCGGTGTCGCTCCCCGCGTTGGGGGCGCAGCCCGTTGCGCAGTCA
CTGGAAACGCAGCTGCACAAGATGGATTCTAGCGCGGTGGAGTGCGTGGCAGAGTCATCCCCGGCGTGCTCGTTCGT
CACGCTGGACCAGGTCGAACTCGCGTGGAGCGACATGAAGTTCATCGACCTGCCGCCGCTAGAGGATCTTGTCGATT
CGTCCGAGCAATCCTCAACTTCCTCTGCTGTGTATTGCCGTGTTTCGTCAGGTCCTCTCGAGAGGAACATCATGGAT
AATTGCTACAATGTGTTCGCGGTATAACGATTTCAGGGCTTCAGAAGCAATTTTGCCGGTGTGGGAAAAGACGGAGT
AGTTTTCGATGAAACGTAGGGCTTTCTTTCCCGAACGGAGCGGTTTTCGATGAGTTTTAGGGTTTTAGACCAAAATT
TTCCAGGTGTAGGAAAGATTTTTGCCGGCGTAGATAGATGAAACCCAAGCTGTGAGCTTGGTCATCTCTCTTCACCA
TTTCTAGACATTGTTCTCTGCTTATGTAAAGTAGATGGATAGCTGCAGATAGAGCATGTACCAATTTTTTCTCTGAT
TCAGCAGAGGTTAGTGTCATACACCCAATTCCTCTCGATGTGAGACCATGTAAAAAGACACTGCTTTTTGATAAGTG
TCTACCTCAAAATTCAATGTTTTGGTTCTGGTTCTTACATCGAGAGGAATTGGGTGTATG
SEQ ID NO:2ScDREB5-6基因的核苷酸序列
ACACACTTCAAGCAACAGAAACCTCACTCCAGTCTCTCTCAAGCATGTCTAGGTAGTTGTTGGTTTCTCAATATACA
GTGTCTAGATTTCTGTTGCTTTGTCAATATATAGTGTCTAGATTGGTGTTGCTTTCTCAATTGTGTCTAGATTGGTG
TTGCTGTCCGACAATCGGTTGTGAATGATAAGGAGGAAGCAGACTAGTGGAGCTGAGAGGGCGAAGGTGAAGTTGAA
GGGCTGATCATGGTGACTTCGTGGAAGAAGTGTCGCCGCACATCGTCAGAGCACGCGCCTCCGCGCCGTCGACGTGA
CGCGCTGAAGAAACTAGTTGGGAAGATCGTGCACAGCATTGTGCCGGAGTCATCCAGCGAGTACCGAGGAGTGCGGT
ACCGGGTGGAGCTGAACAAGTACGTGACGGAGATCAGGCCGTCCCGGAGCACGAAGAAGATCTGGCTGGGGACGTAC
GACACGGCGGAGGAGGCGGCGCGCGCGTTCGACATCGGCAACCTGTGCTGCAAGAAGAACCTGCCGCTCAACTTCGC
GGACTCGCCCGGGATGCTCAAGAAGATCTCGTCCCGCCTCTCCCCGGACGCGACCCGCAACGCCATCGCCCAGCTGG
CCAAAGAGGTCGCCGCGCTGCAAGCTGTGGTCAGGACGCAGAAGCTGGAAACGGAGACCTCCGGCGTCACCTACACC
GAGATCCTCCAGGAACAGGTCGCCACTGTGATGGACTGCGAAGAAGAAGAAGCTGTGGCCACCACCATGCCGCTGCA
GGCCGCGGACGAAGGCGGCTCCGGCTCTGGATACTCGTGGAGCTTCGACCTGAGAACCATCTTCACCGCTGACGACA
ATGCCAACGTCCCGCTCCACAAGCTCATCAACTTCGGATCGTCTGAGTCCATATACGTCCACACTTATCCCTGAATA
CAGGTACCATGATGCACTTCTTCATACAACTTCAACTTGATTACACAGGCGAAGCATCAACCTGGGGAGTGAGTCCT
GTGCACACTGTTTCTTATGTATACGATAGCATAGTGTTTTCTGTTTTTCTGGTATATATTTGTATGATCAATTTTCG
AGGATATGTATATTATACAATCAGGTTCAGATCAATGTATAGAGGAGAGAGACTTGCTGCTAAGTTAGATATGATGT
GGGCAGCGTCACGGCAGGATTGCTATGGAATTACTGATTTTTATACGACAATGATGTAAAAGCACAGACAGTTTTGT
CTTTAATGGAGAGACGTTCGAGGAAAGCTTTTGAGAGTGGGACCCAGGTCCTTGACTTGGT
SEQ ID NO:3ScDREB5-8基因的核苷酸序列
CTCTCTGCTCCAGCGTGGCACACGCTTCCCGCGGACGCGACGCCACCTGGGCAGCGGGCAGTGGTCAAAGCCGGCAC
AGCCCTGCAGTTACCTTATAATAGGCCGGCTCCGCTCTCCATCTCTCCATTGCAAATTTGGCACCGACATCTAACAC
TCACCAAAGCGTAAGAGAGAGGAGCAGAGAGAAGGGTTTGCACCAAGACGTTATGCCTGGGATGGCACCTTCAGCGT
GGAGATTGGGAGCAGGAGCAGGAGTGATGAAGGTGGAGAGGCGGGAGGTCGTGGAGAAGGTGTGCAAGGACAGGGAG
GACAGGGACATTGATCTCAACGTGCCGTATGTGATGGAGGAGGAGTCCATGTCGGCCACGAGCAGCACCAGCGGGGA
GAAGGGCGGCAGCGGGGCCTCCGACGAGGTGCACTATAGGGGGGGCGCGGGCGACGCCAGCTACCGCGGCGTGCGGC
ACCGCCCGGAGCTCAACAAGTGGGTCACGGAGATCCGCCCCACGGCGCAGAAGCGCAAGATCTGGCTGGGGACTTAC
AAGACGCCGGAGGAGGCCGCGCGCGCCTACGACGTCGGGATCCACTACACGGGGAAGAAGATCCCGCTCAATTTCCC
CGACTCCATGCCCAACCTCCCCGAGCTCCCGCGCGGGACGTGGGAGGAGATCGCGCCGTTCGTCAAGAAGCAGGCCG
TCTCCGCCGCCAAGCGCCACCGAGGGTTTTGAGGTGATCTTCGATGTCACCTCCCTCGACGGATTTTTTGTACAAGC
GCAGTTTTGGCTTCCTTTTTCCTTCCTTTTTTCGCCAAGAATCGGAGCCAAGACGAGGACCTCTTAGTAGTTGCCCC
TCTTTTTGTATATAGATAGATAGCTTCCCCTATCGCTACCATTCTTTGGGGTTTCTTTCTGGCTGTCAACTCCCAGA
ACGTCCCTTCCGCCACCCATAGGGTACCGATTGTTTTCATGACGGCGTCCCGGCGCAAATTGCATTGCCCCTCTGAT
GAGATCCGAAATAATAATAAAACTCTCGCGTTACCACTCCACTTCGTCTGTCTCTGCATTGTTGCATCGTCGC
SEQ ID NO:4ScDREB5-10基因的核苷酸序列
CCAGTGGAGAGGCTCTCAAGTCAAGAGGTCACATCATTCAGGCTGCTGCATCTTCCAGCCCTTCCGCATTCCACAGC
GTGCATCTTGTACGTACAGTACCACCGACCTCACAAGAGGTAGTCTTATTCTTGGTTTGTCAAGGCTTACTAGTGCA
GTGGAATCTGCTTGTTTTCTGAAGTCTGTGGGAGGTGCTACTTCTGTAGCAAGAGAAGTTTGTGGCGGAGACGTATT
TGGAGACGAGGAGACTGACTTCGCCACGCTTTCTCTGACACAGAGCGCGATGGCCGGCGAAGAAGCTCCGTCGACCC
TTTGTCGAATATGGAGTGCGATCACCCCCCTGATGCGGTTCAAGAACAAGATCCGGGAACATCTGTGGGCCTCCTCG
CTTCTGAACGATCCAGATCTCCACAGGGAAACGGAAACCGCTAGCACATTACCCGAACAACACTACTACGACGCGTC
GTCTCAAGCATTCGAAGCTGCTAGTCCACCGGCTGTGACTGCAAGCTTTTATGACAATCCCGGAGACCTCGCGACAC
AACTGCAGGCCATGCAAAGAAATGCCCACGCCGAACCGGAAGTCTACATGTCACTCGATGACTTCCCTGTAGAGCTG
ATATCACAACCAATCTCGGCGGATTCCTACCACAGGTCGACATCGGAACCGATCTCGGAGGATTCCTACGACAGGTC
GATATCGGAACCGATCTCGGAGGACTCCTACGACAGGTCGATGTCGCAACCGATCTCGGAGGATTCCTACCTCAGGT
CGATGTCCCAACCGATCGAGGAAGACTTCACTAGTGACGGCGCTGATGATGATCAGTCGAGTGAGATGATGGACACG
GGAGCTGAGTCGTCTGATCTTCGCCGTGAGAGCTCCGCCGAGGAATGGCAGCAGATCATGTTCTTCCGGCACTTCTT
CGGGATGGACTCCACGGTGCCCCCCGTGCCCGGGTGGACCGTCGTCGTGGGAATCGTGTCGGTGTTCAAGCGCATCA
CGGGCCTCATCCGGCAACGACGCCAAGAGAGAGCTCAGAACCAAGTAGCTGTGGTTCCGAGGCCGAGGAGGAGAAGG
GCGGTGGTGGTGACGAGGTACAAGGGAATTCGTCCCCGGAACGGCAAGTGGGTGTCGGAGATCCGCATTGGAGGCAC
CAAAGAGAAGGTGTGGCTGGGGTCGTACAACACGGAGAAGGAGGCGGCGCTGGCGTTCGACGCGGGGAAGCACCACT
GCAGTCTGTTGAGGAGGACCCGGGGCTTCAACTTCAACGACTCGCCCCGGTTCCTCGGCCCACCCCAGCGATTCGAA
CACCTTACGTCCGAGAAGAGAAAGGAAAATATCAAGAGATTGGCGGAGGAGCATGCATTAACTTACGCATCCGCAGA
CATCCGGTGATCATTGCCACTCCTCCAGGCTCACTAGCCATTCATTACATGTGTAGACTACTTTAGGGCTTAGGATT
CTTTGTTCTTTTTATCACGGTTTGGACTATTTCTTTCCCGGCTTTCCATTGTGATGTTGGATATCACATGGGATAAC
CAGCAGCTTGCGTTTGTTTTTCCATTGTTTATGATTCAGACTTTAGGGTTTTAAGTTCAGCGTTTCAGGTCTAGGGT
CTAGGGTTCTCCGTTCTTCTTATGGTCTGTACAATTTTTAAACTTGTAGTGTGTACCTTTGTAGATTATATGAGATG
ATTTGCAGCCTGTGACTGCTGCCCACACTTCTTCCAAAATTAAAAAAAAACCCAAAGCTACAAAGATATGCCCAAA。
所述基因中4个基因核苷酸序列编码区长分别是ScDREB5-3为685bp,ScDREB5-6为681bp,ScDREB5-8为519bp,ScDREB5-10为1165bp。
将所示的核苷酸序列按常规方法进行酵母表达载体构建，酵母表达载体导入宿主，其中宿主为酵母菌株INVSc1，得到具备抗逆能力的转ScDREB5-3、ScDREB5-6、ScDREB5-8、ScDREB5-10基因的转化体的功能测试。
所述的极端耐旱齿肋赤藓4个DREB转录因子及其编码基因在制备植物抗逆性育种和改良的用途。
本发明所述的4个齿肋赤藓转录因子ScDREB5-3、ScDREB5-6、ScDREB5-8、ScDREB5-10，它具有SEQ ID NO:5-8所示的氨基酸序列，其中转录因子ScDREB5-3基因编码224个氨基酸，ScDREB5-6基因编码226个氨基酸，转录因子ScDREB5-8基因编码172个氨基酸，ScDREB5-10基因编码371个氨基酸。
所述的4个齿肋赤藓DREB转录因子ScDREB5-3、ScDREB5-6、ScDREB5-8、ScDREB5-10基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1-4所示，其中基因编码区长分别是ScDREB5-3为685bp,ScDREB5-6为681bp,ScDREB5-8为519bp,ScDREB5-10为1165bp。
将所示的核苷酸序列按常规方法进行酵母表达载体构建，酵母表达载体导入宿主，其中宿主为酵母菌株INVSc1，得到具备抗逆能力的转ScDREB5-3、ScDREB5-6、ScDREB5-8、ScDREB5-10基因的转化体的功能测试。
本发明所述的极端耐旱齿肋赤藓4个DREB转录因子及其编码基因，为植物齿肋赤藓4个DREB转录因子ScDREB5-3、ScDREB5-6、ScDREB5-8、ScDREB5-10基因，具体方法为：
取野外采集的齿肋赤藓的壮年植株，用蒸馏水在实验室内复水24小时，然后冲洗干净，切除假根并取样，提取总RNA；
用总RNA进行逆转录得到cDNA，以cDNA为模板PCR扩增得到4个DREB转录因子基因，命名为ScDREB5-3、ScDREB5-6、ScDREB5-8、ScDREB5-10；
取经复水24小时后的野外采集的齿肋赤藓植株，用100uM脱落酸（ABA）处理，利用qPCR技术检测4个DREB转录因子均对脱落酸有响应，属于ABA依赖型；
取经复水24小时后的野外采集的齿肋赤藓植株，用20%聚乙二醇、250mM NaCl、温度4℃、温度45℃处理，利用qPCR技术检测4个DREB转录因子对干旱、高盐、冷和热胁迫的响应；
构建ScDREB5-3、ScDREB5-6、ScDREB5-8、ScDREB5-10酵母表达载体pYES2，转化酵母菌株INVSc1，用酵母体系验证该转录因子基因的功能。
本发明所述的极端耐旱齿肋赤藓4个DREB转录因子及编码基因，以极端耐旱藓类齿肋赤藓为材料，克隆了4个DREB转录因子基因ScDREB5-3、ScDREB5-6、ScDREB5-8、ScDREB5-10，并对该基因对不同非生物胁迫和外源激素脱落酸的响应进行了研究。同时，利用酵母表达体系验证了该转录因子基因具有抗旱，抗盐、抗高温和低温胁迫的能力。
本发明所述的植物齿肋赤藓DREB转录因子ScDREB5-3的基因为：
SEQ ID NO:1ScDREB5-3基因的核苷酸序列
GGCGGTTAAGGGAGCGCGTCACCCAGAACATCCAAGTGGCAATTTCCGCGAAGGTGAGACCTTCACACCTGTCCTGT
TGCCTTGGGATTCATGTGTCTCGGAGTCGGGTATATATGCCGCTTCGAGCTCTGAAAAGAGGAAAAGTAGCTGTGTG
AAGGTCGATATCAGAGACTGAAGAGAGCAAGAGACCGAAGCAGGAAAGACAGGAAGGAGAGCAAGTCATTGAAGCAG
GAAAGACAGGAAGTAGAGCAAGGCATTGAAGCAGGAAAGAAAGGAATGGTGGAGAAGAACGCCAGCCAGAGAGCAGC
GTCGGACAGTCGTCTAGAGTTTCTGGGAGTGACCAAGGCCAAGGCGAAGAATGAGAAGGCGCCTTCGAGTCCCAAGT
ACAAGGGCGTGCGCATGCGGCAGTGGGGAAAGTGGGTGAGCGAGATTCGGGAGCCCAATAAGCGGTCGAGGATATGG
CTGGGCTCGTTTCCCACAGCGGAGATGGCTGCTAAGGCGTACGACGCTGCCGTCGTGTGCTTGCGGGGCTCCAACGC
GGAACTCAACTTCCCCGACTCGCCTCCGCGCGTGGTCCCCACCTGTACCTCGCCCAAGGACGTGCAGATCGCCGCCG
CGGCTGCCGCGGCCGCTGCGGACCCGTGCACTCCGGTGTCGCTCCCCGCGTTGGGGGCGCAGCCCGTTGCGCAGTCA
CTGGAAACGCAGCTGCACAAGATGGATTCTAGCGCGGTGGAGTGCGTGGCAGAGTCATCCCCGGCGTGCTCGTTCGT
CACGCTGGACCAGGTCGAACTCGCGTGGAGCGACATGAAGTTCATCGACCTGCCGCCGCTAGAGGATCTTGTCGATT
CGTCCGAGCAATCCTCAACTTCCTCTGCTGTGTATTGCCGTGTTTCGTCAGGTCCTCTCGAGAGGAACATCATGGAT
AATTGCTACAATGTGTTCGCGGTATAACGATTTCAGGGCTTCAGAAGCAATTTTGCCGGTGTGGGAAAAGACGGAGT
AGTTTTCGATGAAACGTAGGGCTTTCTTTCCCGAACGGAGCGGTTTTCGATGAGTTTTAGGGTTTTAGACCAAAATT
TTCCAGGTGTAGGAAAGATTTTTGCCGGCGTAGATAGATGAAACCCAAGCTGTGAGCTTGGTCATCTCTCTTCACCA
TTTCTAGACATTGTTCTCTGCTTATGTAAAGTAGATGGATAGCTGCAGATAGAGCATGTACCAATTTTTTCTCTGAT
TCAGCAGAGGTTAGTGTCATACACCCAATTCCTCTCGATGTGAGACCATGTAAAAAGACACTGCTTTTTGATAAGTG
TCTACCTCAAAATTCAATGTTTTGGTTCTGGTTCTTACATCGAGAGGAATTGGGTGTATG
SEQ ID NO:2ScDREB5-6基因的核苷酸序列
ACACACTTCAAGCAACAGAAACCTCACTCCAGTCTCTCTCAAGCATGTCTAGGTAGTTGTTGGTTTCTCAATATACA
GTGTCTAGATTTCTGTTGCTTTGTCAATATATAGTGTCTAGATTGGTGTTGCTTTCTCAATTGTGTCTAGATTGGTG
TTGCTGTCCGACAATCGGTTGTGAATGATAAGGAGGAAGCAGACTAGTGGAGCTGAGAGGGCGAAGGTGAAGTTGAA
GGGCTGATCATGGTGACTTCGTGGAAGAAGTGTCGCCGCACATCGTCAGAGCACGCGCCTCCGCGCCGTCGACGTGA
CGCGCTGAAGAAACTAGTTGGGAAGATCGTGCACAGCATTGTGCCGGAGTCATCCAGCGAGTACCGAGGAGTGCGGT
ACCGGGTGGAGCTGAACAAGTACGTGACGGAGATCAGGCCGTCCCGGAGCACGAAGAAGATCTGGCTGGGGACGTAC
GACACGGCGGAGGAGGCGGCGCGCGCGTTCGACATCGGCAACCTGTGCTGCAAGAAGAACCTGCCGCTCAACTTCGC
GGACTCGCCCGGGATGCTCAAGAAGATCTCGTCCCGCCTCTCCCCGGACGCGACCCGCAACGCCATCGCCCAGCTGG
CCAAAGAGGTCGCCGCGCTGCAAGCTGTGGTCAGGACGCAGAAGCTGGAAACGGAGACCTCCGGCGTCACCTACACC
GAGATCCTCCAGGAACAGGTCGCCACTGTGATGGACTGCGAAGAAGAAGAAGCTGTGGCCACCACCATGCCGCTGCA
GGCCGCGGACGAAGGCGGCTCCGGCTCTGGATACTCGTGGAGCTTCGACCTGAGAACCATCTTCACCGCTGACGACA
ATGCCAACGTCCCGCTCCACAAGCTCATCAACTTCGGATCGTCTGAGTCCATATACGTCCACACTTATCCCTGAATA
CAGGTACCATGATGCACTTCTTCATACAACTTCAACTTGATTACACAGGCGAAGCATCAACCTGGGGAGTGAGTCCT
GTGCACACTGTTTCTTATGTATACGATAGCATAGTGTTTTCTGTTTTTCTGGTATATATTTGTATGATCAATTTTCG
AGGATATGTATATTATACAATCAGGTTCAGATCAATGTATAGAGGAGAGAGACTTGCTGCTAAGTTAGATATGATGT
GGGCAGCGTCACGGCAGGATTGCTATGGAATTACTGATTTTTATACGACAATGATGTAAAAGCACAGACAGTTTTGT
CTTTAATGGAGAGACGTTCGAGGAAAGCTTTTGAGAGTGGGACCCAGGTCCTTGACTTGGT
SEQ ID NO:3ScDREB5-8基因的核苷酸序列
CTCTCTGCTCCAGCGTGGCACACGCTTCCCGCGGACGCGACGCCACCTGGGCAGCGGGCAGTGGTCAAAGCCGGCAC
AGCCCTGCAGTTACCTTATAATAGGCCGGCTCCGCTCTCCATCTCTCCATTGCAAATTTGGCACCGACATCTAACAC
TCACCAAAGCGTAAGAGAGAGGAGCAGAGAGAAGGGTTTGCACCAAGACGTTATGCCTGGGATGGCACCTTCAGCGT
GGAGATTGGGAGCAGGAGCAGGAGTGATGAAGGTGGAGAGGCGGGAGGTCGTGGAGAAGGTGTGCAAGGACAGGGAG
GACAGGGACATTGATCTCAACGTGCCGTATGTGATGGAGGAGGAGTCCATGTCGGCCACGAGCAGCACCAGCGGGGA
GAAGGGCGGCAGCGGGGCCTCCGACGAGGTGCACTATAGGGGGGGCGCGGGCGACGCCAGCTACCGCGGCGTGCGGC
ACCGCCCGGAGCTCAACAAGTGGGTCACGGAGATCCGCCCCACGGCGCAGAAGCGCAAGATCTGGCTGGGGACTTAC
AAGACGCCGGAGGAGGCCGCGCGCGCCTACGACGTCGGGATCCACTACACGGGGAAGAAGATCCCGCTCAATTTCCC
CGACTCCATGCCCAACCTCCCCGAGCTCCCGCGCGGGACGTGGGAGGAGATCGCGCCGTTCGTCAAGAAGCAGGCCG
TCTCCGCCGCCAAGCGCCACCGAGGGTTTTGAGGTGATCTTCGATGTCACCTCCCTCGACGGATTTTTTGTACAAGC
GCAGTTTTGGCTTCCTTTTTCCTTCCTTTTTTCGCCAAGAATCGGAGCCAAGACGAGGACCTCTTAGTAGTTGCCCC
TCTTTTTGTATATAGATAGATAGCTTCCCCTATCGCTACCATTCTTTGGGGTTTCTTTCTGGCTGTCAACTCCCAGA
ACGTCCCTTCCGCCACCCATAGGGTACCGATTGTTTTCATGACGGCGTCCCGGCGCAAATTGCATTGCCCCTCTGAT
GAGATCCGAAATAATAATAAAACTCTCGCGTTACCACTCCACTTCGTCTGTCTCTGCATTGTTGCATCGTCGC
SEQ ID NO:4ScDREB5-10基因的核苷酸序列
CCAGTGGAGAGGCTCTCAAGTCAAGAGGTCACATCATTCAGGCTGCTGCATCTTCCAGCCCTTCCGCATTCCACAGC
GTGCATCTTGTACGTACAGTACCACCGACCTCACAAGAGGTAGTCTTATTCTTGGTTTGTCAAGGCTTACTAGTGCA
GTGGAATCTGCTTGTTTTCTGAAGTCTGTGGGAGGTGCTACTTCTGTAGCAAGAGAAGTTTGTGGCGGAGACGTATT
TGGAGACGAGGAGACTGACTTCGCCACGCTTTCTCTGACACAGAGCGCGATGGCCGGCGAAGAAGCTCCGTCGACCC
TTTGTCGAATATGGAGTGCGATCACCCCCCTGATGCGGTTCAAGAACAAGATCCGGGAACATCTGTGGGCCTCCTCG
CTTCTGAACGATCCAGATCTCCACAGGGAAACGGAAACCGCTAGCACATTACCCGAACAACACTACTACGACGCGTC
GTCTCAAGCATTCGAAGCTGCTAGTCCACCGGCTGTGACTGCAAGCTTTTATGACAATCCCGGAGACCTCGCGACAC
AACTGCAGGCCATGCAAAGAAATGCCCACGCCGAACCGGAAGTCTACATGTCACTCGATGACTTCCCTGTAGAGCTG
ATATCACAACCAATCTCGGCGGATTCCTACCACAGGTCGACATCGGAACCGATCTCGGAGGATTCCTACGACAGGTC
GATATCGGAACCGATCTCGGAGGACTCCTACGACAGGTCGATGTCGCAACCGATCTCGGAGGATTCCTACCTCAGGT
CGATGTCCCAACCGATCGAGGAAGACTTCACTAGTGACGGCGCTGATGATGATCAGTCGAGTGAGATGATGGACACG
GGAGCTGAGTCGTCTGATCTTCGCCGTGAGAGCTCCGCCGAGGAATGGCAGCAGATCATGTTCTTCCGGCACTTCTT
CGGGATGGACTCCACGGTGCCCCCCGTGCCCGGGTGGACCGTCGTCGTGGGAATCGTGTCGGTGTTCAAGCGCATCA
CGGGCCTCATCCGGCAACGACGCCAAGAGAGAGCTCAGAACCAAGTAGCTGTGGTTCCGAGGCCGAGGAGGAGAAGG
GCGGTGGTGGTGACGAGGTACAAGGGAATTCGTCCCCGGAACGGCAAGTGGGTGTCGGAGATCCGCATTGGAGGCAC
CAAAGAGAAGGTGTGGCTGGGGTCGTACAACACGGAGAAGGAGGCGGCGCTGGCGTTCGACGCGGGGAAGCACCACT
GCAGTCTGTTGAGGAGGACCCGGGGCTTCAACTTCAACGACTCGCCCCGGTTCCTCGGCCCACCCCAGCGATTCGAA
CACCTTACGTCCGAGAAGAGAAAGGAAAATATCAAGAGATTGGCGGAGGAGCATGCATTAACTTACGCATCCGCAGA
CATCCGGTGATCATTGCCACTCCTCCAGGCTCACTAGCCATTCATTACATGTGTAGACTACTTTAGGGCTTAGGATT
CTTTGTTCTTTTTATCACGGTTTGGACTATTTCTTTCCCGGCTTTCCATTGTGATGTTGGATATCACATGGGATAAC
CAGCAGCTTGCGTTTGTTTTTCCATTGTTTATGATTCAGACTTTAGGGTTTTAAGTTCAGCGTTTCAGGTCTAGGGT
CTAGGGTTCTCCGTTCTTCTTATGGTCTGTACAATTTTTAAACTTGTAGTGTGTACCTTTGTAGATTATATGAGATG
ATTTGCAGCCTGTGACTGCTGCCCACACTTCTTCCAAAATTAAAAAAAAACCCAAAGCTACAAAGATATGCCCAAA。
附图说明
图1为本发明4个齿肋赤藓DREB基因RT-PCR扩增电泳图，其中泳道1、3、5、7为ScDREB5-10、ScDREB5-8、ScDREB5-3、ScDREB5-6基因以cDNA为模板的扩增；泳道2、4、6、8为ScDREB5-10、ScDREB5-8、ScDREB5-3、ScDREB5-6基因以齿肋赤藓DNA为模板的扩增；泳道M：分子量Maker DL2000；
图2为本发明4个转录因子基因序列分析图，其中AP2保守结构域用下划线标注，保守的第14位的缬氨（V14）和第19位的谷氨酰胺（E19）位点用方框标出，图中a、b、c、d分别对应ScDREB5-10、ScDREB5-8、ScDREB5-6、ScDREB5-3；
图3为本发明4个齿肋赤藓DREB基因在脱落酸处理0.5h、2h、6h、12h、24h的响应图，其中a,b,c,d依次是ScDREB5-10、ScDREB5-8、ScDREB5-6和ScDREB5-3基因对ABA的响应；
图4为本发明ScDREB5-3基因在干旱、高盐、低温和高温处理后的表达特性图，其中a,b,c,d分别是齿肋赤藓ScDREB5-3基因在受到干旱20%聚乙二醇、高盐250mM NaCl、低温4℃和高温45℃胁迫处理后的表达特性；
图5为本发明ScDREB5-6基因在干旱、高盐、低温和高温处理后的表达特性图，其中a,b,c,d分别是齿肋赤藓ScDREB5-6基因在受到干旱20%聚乙二醇、高盐250mM NaCl、低温4℃和高温45℃胁迫处理后的表达特性；
图6为本发明ScDREB5-8基因在干旱、高盐、冷和热处理后的表达特性图。其中a,b,c,d分别是齿肋赤藓ScDREB5-8基因在受到干旱20%聚乙二醇、高盐250mM NaCl、低温4℃和高温45℃胁迫处理后的表达特性；
图7为本发明ScDREB5-10基因在干旱、高盐、冷和热处理后的表达特性图，其中a,b,c,d分别是齿肋赤藓ScDREB5-10基因在受到干旱20%聚乙二醇、高盐250mM NaCl、低温4℃和高温45℃胁迫处理后的表达特性；
图8为本发明重组载体pYES2-ScDREB5-10、ScDREB5-8、ScDREB5-3、ScDREB5-6化酵母菌株INVSc1的菌液PCR图，其中M泳道为分子量Maker DL2000，泳道1-5为INVSc1（pYES2-ScDREB5-10）的菌液PCR结果，其中泳道1、2、3、5为阳性菌株，泳道6-10为INVSc1（pYES2-ScDREB5-8）的菌液PCR结果，其中泳道6、7、9、10为阳性菌株，泳道11-15为INVSc1（pYES2-ScDREB5-3）的菌液PCR结果，其中泳道11、12、13、14为阳性菌株。泳道16-20为INVSc1（pYES2-ScDREB5-6）的菌液PCR结果，其中泳道16、18、19、20为阳性菌株。
图9为本发明转ScDREB5-3、ScDREB5-6、ScDREB5-8、ScDREB5-10转录因子基因的酵母菌在无胁迫条件和干旱，高盐，冷和热胁迫下的生长实验结果图，其中A为无胁迫条件下的空载质粒pYES2（下）和带目的片段的重组载体（上）的生长情况；B是3M山梨醇模拟干旱胁迫条件下两者的生长情况；C是4M NaCl模拟高盐胁迫下菌的生长情况；D是4℃冷胁迫下菌体的生长情况；E是53℃热胁迫处理下菌的生长情况。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步阐述。
下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规实验操作进行，如《精编分子生物学实验指南》（F.M奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G塞德曼主编，马学军，舒跃龙译，北京：科学出版社，2004）中所述的方法进行：
实施例1：齿肋赤藓中4个DREB转录因子ScDREB5-3、ScDREB5-6、ScDREB5-8、ScDREB5-10基因的克隆：
植物材料的获得：
本试验中的实验材料均采自古尔班通古特沙漠中发育良好的苔藓结皮，选取生长在同一地点，长势一致且经形态鉴定排除其他藓类确定为齿肋赤藓的壮年植株为实验材料，用蒸馏水复水24小时，然后冲洗干净切除假根后置于液氮中冻存，之后转移至温度-80℃超低温冰箱中保存；
齿肋赤藓总RNA的提取和反转录：
RNA提取用TAKARA的RNAiso reagent试剂，具体步骤按说明书进行，经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计测定后，完整性和纯度都较好的RNA样本可用于下游反转录实验，用1μg RNA进行反转录，反转录试剂是TAKARA的PrimerScript RT-PCR试剂盒，反转录反应如下：
反转录反应条件为：温度37℃，时间30min；温度85℃，时间5s；
cDNA全长序列的获得：
根据齿肋赤藓转录组数据库注释，选取含有AP2结构域注释为DREB(dehydration-responsive element binding protein)，且有完整ORF的unigene作为候选序列，候选基因包括unigene40134、unigene80031、unigene39055、unigene74743，根据与拟南芥中DREB基因的进化树分析命名为ScDREB5-3、ScDREB5-6、ScDREB5-8、ScDREB5-10。并以此为依据设计基因特异性引物，扩增目的基因。
引物序列见表1：
表1：
引物名称 引物序列
ScDREB5-10-F AGACGAGGAGACTGACTTCG
ScDREB5-10-R AGACCTGAAACGCTGAACTT
ScDREB5-8-F GAGCAGAGAGAAGGGTTTG
ScDREB5-8-R GGGCAACTACTAAGAGGTCC
ScDREB5-6-F GAATGATAAGGAGGAAGCAGA
ScDREB5-6-R GTACCTGTATTCAGGGATAAGTGT
ScDREB5-3-F TGAAGAGAGCAAGAGACCG
ScDREB5-3-R TCTGAAGCCCTGAAATCG
PCR体系如下：
反应条件：温度95℃,时间5min；温度94℃，时间30s；温度(ScDREB5-10:56℃;ScDREB5-8：58℃;ScDREB5-6：56℃;ScDREB5-3：58℃),时间30s；温度72℃,时间30s；温度72℃,时间7min；30个循环；
PCR反应完毕后，电泳检测并回收片段，将所得片段连接xMD19-T克隆载体，操作步骤参照TAKARA公司产品xMD19-T vector说明书进行，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选和菌液PCR鉴定后，送阳性克隆进行序列测定。测序结果如下：
候选基因ScDREB5-3核苷酸序列结果见SEQ ID NO:1
GGCGGTTAAGGGAGCGCGTCACCCAGAACATCCAAGTGGCAATTTCCGCGAAGGTGAGACCTTCACACCTGTCCTGT
TGCCTTGGGATTCATGTGTCTCGGAGTCGGGTATATATGCCGCTTCGAGCTCTGAAAAGAGGAAAAGTAGCTGTGTG
AAGGTCGATATCAGAGACTGAAGAGAGCAAGAGACCGAAGCAGGAAAGACAGGAAGGAGAGCAAGTCATTGAAGCAG
GAAAGACAGGAAGTAGAGCAAGGCATTGAAGCAGGAAAGAAAGGAATGGTGGAGAAGAACGCCAGCCAGAGAGCAGC
GTCGGACAGTCGTCTAGAGTTTCTGGGAGTGACCAAGGCCAAGGCGAAGAATGAGAAGGCGCCTTCGAGTCCCAAGT
ACAAGGGCGTGCGCATGCGGCAGTGGGGAAAGTGGGTGAGCGAGATTCGGGAGCCCAATAAGCGGTCGAGGATATGG
CTGGGCTCGTTTCCCACAGCGGAGATGGCTGCTAAGGCGTACGACGCTGCCGTCGTGTGCTTGCGGGGCTCCAACGC
GGAACTCAACTTCCCCGACTCGCCTCCGCGCGTGGTCCCCACCTGTACCTCGCCCAAGGACGTGCAGATCGCCGCCG
CGGCTGCCGCGGCCGCTGCGGACCCGTGCACTCCGGTGTCGCTCCCCGCGTTGGGGGCGCAGCCCGTTGCGCAGTCA
CTGGAAACGCAGCTGCACAAGATGGATTCTAGCGCGGTGGAGTGCGTGGCAGAGTCATCCCCGGCGTGCTCGTTCGT
CACGCTGGACCAGGTCGAACTCGCGTGGAGCGACATGAAGTTCATCGACCTGCCGCCGCTAGAGGATCTTGTCGATT
CGTCCGAGCAATCCTCAACTTCCTCTGCTGTGTATTGCCGTGTTTCGTCAGGTCCTCTCGAGAGGAACATCATGGAT
AATTGCTACAATGTGTTCGCGGTATAACGATTTCAGGGCTTCAGAAGCAATTTTGCCGGTGTGGGAAAAGACGGAGT
AGTTTTCGATGAAACGTAGGGCTTTCTTTCCCGAACGGAGCGGTTTTCGATGAGTTTTAGGGTTTTAGACCAAAATT
TTCCAGGTGTAGGAAAGATTTTTGCCGGCGTAGATAGATGAAACCCAAGCTGTGAGCTTGGTCATCTCTCTTCACCA
TTTCTAGACATTGTTCTCTGCTTATGTAAAGTAGATGGATAGCTGCAGATAGAGCATGTACCAATTTTTTCTCTGAT
TCAGCAGAGGTTAGTGTCATACACCCAATTCCTCTCGATGTGAGACCATGTAAAAAGACACTGCTTTTTGATAAGTG
TCTACCTCAAAATTCAATGTTTTGGTTCTGGTTCTTACATCGAGAGGAATTGGGTGTATG
候选基因ScDREB5-6核苷酸序列结果见SEQ ID NO:2
ACACACTTCAAGCAACAGAAACCTCACTCCAGTCTCTCTCAAGCATGTCTAGGTAGTTGTTGGTTTCTCAATATACA
GTGTCTAGATTTCTGTTGCTTTGTCAATATATAGTGTCTAGATTGGTGTTGCTTTCTCAATTGTGTCTAGATTGGTG
TTGCTGTCCGACAATCGGTTGTGAATGATAAGGAGGAAGCAGACTAGTGGAGCTGAGAGGGCGAAGGTGAAGTTGAA
GGGCTGATCATGGTGACTTCGTGGAAGAAGTGTCGCCGCACATCGTCAGAGCACGCGCCTCCGCGCCGTCGACGTGA
CGCGCTGAAGAAACTAGTTGGGAAGATCGTGCACAGCATTGTGCCGGAGTCATCCAGCGAGTACCGAGGAGTGCGGT
ACCGGGTGGAGCTGAACAAGTACGTGACGGAGATCAGGCCGTCCCGGAGCACGAAGAAGATCTGGCTGGGGACGTAC
GACACGGCGGAGGAGGCGGCGCGCGCGTTCGACATCGGCAACCTGTGCTGCAAGAAGAACCTGCCGCTCAACTTCGC
GGACTCGCCCGGGATGCTCAAGAAGATCTCGTCCCGCCTCTCCCCGGACGCGACCCGCAACGCCATCGCCCAGCTGG
CCAAAGAGGTCGCCGCGCTGCAAGCTGTGGTCAGGACGCAGAAGCTGGAAACGGAGACCTCCGGCGTCACCTACACC
GAGATCCTCCAGGAACAGGTCGCCACTGTGATGGACTGCGAAGAAGAAGAAGCTGTGGCCACCACCATGCCGCTGCA
GGCCGCGGACGAAGGCGGCTCCGGCTCTGGATACTCGTGGAGCTTCGACCTGAGAACCATCTTCACCGCTGACGACA
ATGCCAACGTCCCGCTCCACAAGCTCATCAACTTCGGATCGTCTGAGTCCATATACGTCCACACTTATCCCTGAATA
CAGGTACCATGATGCACTTCTTCATACAACTTCAACTTGATTACACAGGCGAAGCATCAACCTGGGGAGTGAGTCCT
GTGCACACTGTTTCTTATGTATACGATAGCATAGTGTTTTCTGTTTTTCTGGTATATATTTGTATGATCAATTTTCG
AGGATATGTATATTATACAATCAGGTTCAGATCAATGTATAGAGGAGAGAGACTTGCTGCTAAGTTAGATATGATGT
GGGCAGCGTCACGGCAGGATTGCTATGGAATTACTGATTTTTATACGACAATGATGTAAAAGCACAGACAGTTTTGT
CTTTAATGGAGAGACGTTCGAGGAAAGCTTTTGAGAGTGGGACCCAGGTCCTTGACTTGGT
候选基因ScDREB5-8核苷酸序列结果见SEQ ID NO:3
CTCTCTGCTCCAGCGTGGCACACGCTTCCCGCGGACGCGACGCCACCTGGGCAGCGGGCAGTGGTCAAAGCCGGCAC
AGCCCTGCAGTTACCTTATAATAGGCCGGCTCCGCTCTCCATCTCTCCATTGCAAATTTGGCACCGACATCTAACAC
TCACCAAAGCGTAAGAGAGAGGAGCAGAGAGAAGGGTTTGCACCAAGACGTTATGCCTGGGATGGCACCTTCAGCGT
GGAGATTGGGAGCAGGAGCAGGAGTGATGAAGGTGGAGAGGCGGGAGGTCGTGGAGAAGGTGTGCAAGGACAGGGAG
GACAGGGACATTGATCTCAACGTGCCGTATGTGATGGAGGAGGAGTCCATGTCGGCCACGAGCAGCACCAGCGGGGA
GAAGGGCGGCAGCGGGGCCTCCGACGAGGTGCACTATAGGGGGGGCGCGGGCGACGCCAGCTACCGCGGCGTGCGGC
ACCGCCCGGAGCTCAACAAGTGGGTCACGGAGATCCGCCCCACGGCGCAGAAGCGCAAGATCTGGCTGGGGACTTAC
AAGACGCCGGAGGAGGCCGCGCGCGCCTACGACGTCGGGATCCACTACACGGGGAAGAAGATCCCGCTCAATTTCCC
CGACTCCATGCCCAACCTCCCCGAGCTCCCGCGCGGGACGTGGGAGGAGATCGCGCCGTTCGTCAAGAAGCAGGCCG
TCTCCGCCGCCAAGCGCCACCGAGGGTTTTGAGGTGATCTTCGATGTCACCTCCCTCGACGGATTTTTTGTACAAGC
GCAGTTTTGGCTTCCTTTTTCCTTCCTTTTTTCGCCAAGAATCGGAGCCAAGACGAGGACCTCTTAGTAGTTGCCCC
TCTTTTTGTATATAGATAGATAGCTTCCCCTATCGCTACCATTCTTTGGGGTTTCTTTCTGGCTGTCAACTCCCAGA
ACGTCCCTTCCGCCACCCATAGGGTACCGATTGTTTTCATGACGGCGTCCCGGCGCAAATTGCATTGCCCCTCTGAT
GAGATCCGAAATAATAATAAAACTCTCGCGTTACCACTCCACTTCGTCTGTCTCTGCATTGTTGCATCGTCGC
候选基因ScDREB5-10核苷酸序列结果见SEQ ID NO:4
CCAGTGGAGAGGCTCTCAAGTCAAGAGGTCACATCATTCAGGCTGCTGCATCTTCCAGCCCTTCCGCATTCCACAGC
GTGCATCTTGTACGTACAGTACCACCGACCTCACAAGAGGTAGTCTTATTCTTGGTTTGTCAAGGCTTACTAGTGCA
GTGGAATCTGCTTGTTTTCTGAAGTCTGTGGGAGGTGCTACTTCTGTAGCAAGAGAAGTTTGTGGCGGAGACGTATT
TGGAGACGAGGAGACTGACTTCGCCACGCTTTCTCTGACACAGAGCGCGATGGCCGGCGAAGAAGCTCCGTCGACCC
TTTGTCGAATATGGAGTGCGATCACCCCCCTGATGCGGTTCAAGAACAAGATCCGGGAACATCTGTGGGCCTCCTCG
CTTCTGAACGATCCAGATCTCCACAGGGAAACGGAAACCGCTAGCACATTACCCGAACAACACTACTACGACGCGTC
GTCTCAAGCATTCGAAGCTGCTAGTCCACCGGCTGTGACTGCAAGCTTTTATGACAATCCCGGAGACCTCGCGACAC
AACTGCAGGCCATGCAAAGAAATGCCCACGCCGAACCGGAAGTCTACATGTCACTCGATGACTTCCCTGTAGAGCTG
ATATCACAACCAATCTCGGCGGATTCCTACCACAGGTCGACATCGGAACCGATCTCGGAGGATTCCTACGACAGGTC
GATATCGGAACCGATCTCGGAGGACTCCTACGACAGGTCGATGTCGCAACCGATCTCGGAGGATTCCTACCTCAGGT
CGATGTCCCAACCGATCGAGGAAGACTTCACTAGTGACGGCGCTGATGATGATCAGTCGAGTGAGATGATGGACACG
GGAGCTGAGTCGTCTGATCTTCGCCGTGAGAGCTCCGCCGAGGAATGGCAGCAGATCATGTTCTTCCGGCACTTCTT
CGGGATGGACTCCACGGTGCCCCCCGTGCCCGGGTGGACCGTCGTCGTGGGAATCGTGTCGGTGTTCAAGCGCATCA
CGGGCCTCATCCGGCAACGACGCCAAGAGAGAGCTCAGAACCAAGTAGCTGTGGTTCCGAGGCCGAGGAGGAGAAGG
GCGGTGGTGGTGACGAGGTACAAGGGAATTCGTCCCCGGAACGGCAAGTGGGTGTCGGAGATCCGCATTGGAGGCAC
CAAAGAGAAGGTGTGGCTGGGGTCGTACAACACGGAGAAGGAGGCGGCGCTGGCGTTCGACGCGGGGAAGCACCACT
GCAGTCTGTTGAGGAGGACCCGGGGCTTCAACTTCAACGACTCGCCCCGGTTCCTCGGCCCACCCCAGCGATTCGAA
CACCTTACGTCCGAGAAGAGAAAGGAAAATATCAAGAGATTGGCGGAGGAGCATGCATTAACTTACGCATCCGCAGA
CATCCGGTGATCATTGCCACTCCTCCAGGCTCACTAGCCATTCATTACATGTGTAGACTACTTTAGGGCTTAGGATT
CTTTGTTCTTTTTATCACGGTTTGGACTATTTCTTTCCCGGCTTTCCATTGTGATGTTGGATATCACATGGGATAAC
CAGCAGCTTGCGTTTGTTTTTCCATTGTTTATGATTCAGACTTTAGGGTTTTAAGTTCAGCGTTTCAGGTCTAGGGT
CTAGGGTTCTCCGTTCTTCTTATGGTCTGTACAATTTTTAAACTTGTAGTGTGTACCTTTGTAGATTATATGAGATG
ATTTGCAGCCTGTGACTGCTGCCCACACTTCTTCCAAAATTAAAAAAAAACCCAAAGCTACAAAGATATGCCCAAA
将测序得到序列在美国国立生物技术信息中心（NCBI）数据库里比对，比对结果显示，从齿肋赤藓中克隆得到的4个序列均含有一个AP2保守结构域，属DREB家族基因；同时为了探究这4个转录因子有无内含子，用以上引物对同时扩增齿肋赤藓DNA和cDNA模板，PCR反应体系同上，PCR反应条件：温度95℃,时间5min；温度94℃，时间30s；温度(ScDREB5-10:56℃;ScDREB5-8：58℃;ScDREB5-6：56℃;ScDREB5-3：58℃)，时间30s；温度72℃,时间30s；温度72℃,时间7min；30个循环；序列扩增产物电泳结果如图1，其中泳道1、3、5、7为ScDREB5-10、ScDREB5-8、ScDREB5-3、ScDREB5-6基因以cDNA为模板的扩增；泳道2、4、6、8为ScDREB5-10、ScDREB5-8、ScDREB5-3、ScDREB5-6基因以齿肋赤藓DNA为模板的扩增，由电泳图可以看出以齿肋赤藓的DNA为模板扩增的4个基因的片段大小与以齿肋赤藓cDNA为模板扩增的大小一致，证明这4个基因同其它植物中已经克隆出来的DREB类转录因子一致，均无内含子，对扩增片段按照上述方法进行克隆和测序；
序列分析：
从齿肋赤藓中克隆的基因ScDREB5-3属于DREB家族基因（图2），基因长约1369bp，开放阅读框长675bp，编码225个氨基酸，具有AP2保守结构域（下划线标注），且有保守的14位的缬氨（V14）位点（方框标出），用BLAST软件将分离出来的全长cDNA序列与GenBank中的序列进行比对分析表明该基因与小立碗藓中的DBF1的相似性最高，为68%，基因全长的核苷酸序列见SEQ ID NO:1；
该基因编码的转录因子的氨基酸序列为SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列
MVEKNASQRAASDSRLEFLGVTKAKAKNEKAPSSPKYKGVRMRQWGKWVSEIREPNKRSRIWLGSFPTAEMAAKAYDAAVVCLRGSNAELNFPDSPPRVVPTCTSPKDVQIAAAAAAAAADPCTPVSLPALGAQPVAQSLETQLHKMDSSAVECVAESSPACSFVTLDQVELAWSDMKFIDLPPLEDLVDSSEQSSTSSAVYCRVSSGPLERNIMDNCYNVFAV
从齿肋赤藓中克隆的基因ScDREB5-6是DREB基因（图2），基因长约1293bp，开放阅读框长681bp，编码227个氨基酸，具有AP2保守结构域（下划线标注），且有保守的14位的缬氨（V14）位点（方框标出）；利用BLAST软件将分离出来的全长cDNA序列与GenBank中的序列进行比对分析表明该基因与梅花中的CBF/DREB1-like protein b的相似性最高，为50%，基因全长的核苷酸序列见SEQ ID NO:2；
该基因编码的转录因子的氨基酸序列为SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列
MVTSWKKCRRTSSEHAPPRRRRDALKKLVGKIVHSIVPESSSEYRGVRYRVELNKYVTEIRPSRSTKKIWLGTYDTAEEAARAFDIGNLCCKKNLPLNFADSPGMLKKISSRLSPDATRNAIAQLAKEVAALQAVVRTQKLETETSGVTYTEILQEQVATVMDCEEEEAVATTMPLQAADEGGSGSGYSWSFDLRTIFTADDNANVPLHKLINFGSSESIYVHTYP
从齿肋赤藓中克隆的基因ScDREB5-8属于DREB家族基因（图2），基因长约1074bp，开放阅读框长519bp，编码173个氨基酸，具有AP2保守结构域（下划线标注），且有保守的14位的缬氨（V14）位点（方框标出）；利用BLAST软件将分离出来的全长cDNA序列与GenBank中的序列进行比对分析表明该基因与山葡萄的CBF/DREB2的相似性最高，为57%，基因全长的核苷酸序列见SEQ ID NO:3；
该基因编码的转录因子的氨基酸序列为SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列
MPGMAPSAWRLGAGAGVMKVERREVVEKVCKDREDRDIDLNVPYVMEEESMSATSSTSGEKGGSGASDEVHYRGGAGDASYRGVRHRPELNKWVTEIRPTAQKRKIWLGTYKTPEEAARAYDVGIHYTGKKIPLNFPDSMPNLPELPRGTWEEIAPFVKKQAVSAAKRHRGF
序列分析表明从齿肋赤藓中克隆的基因ScDREB5-10属于DREB家族基因（图2），基因长约1770bp，开放阅读框长1116bp，编码372个氨基酸，具有AP2保守结构域（下划线标注），且有保守的14位的缬氨（V14）位点（方框标出）。利用BLAST软件将分离出来的全长cDNA序列与GenBank中的序列进行比对分析表明该基因与苹果的MdAP2D6的相似性最高，为53%，基因全长的核苷酸序列见SEQ ID NO:4；
该基因编码的转录因子的氨基酸序列为SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列
MAGEEAPSTLCRIWSAITPLMRFKNKIREHLWASSLLNDPDLHRETETASTLPEQHYYDASSQAFEAASPPAVTASFYDNPGDLATQLQAMQRNAHAEPEVYMSLDDFPVELISQPISADSYHRSTSEPISEDSYDRSISEPISEDSYDRSMSQPISEDSYLRSMSQPIEEDFTSDGADDDQSSEMMDTGAESSDLRRESSAEEWQQIMFFRHFFGMDSTVPPVPGWTVVVGIVSVFKRITGLIRQRRQERAQNQVAVVPRPRRRRAVVVTRYKGIRPRNGKWVSEIRIGGTKEKVWLGSYNTEKEAALAFDAGKHHCSLLRRTRGFNFNDSPRFLGPPQRFEHLTSEKRRENIKRLAEEHALTYASADIR。
实施例2：4个齿肋赤藓ScDREB基因的信息学特性分析
利用在线软件ExPASyProtParam tool(http://us.expasy.org/tools/ protparam.html)预测4个ScDREB5-3、ScDREB5-6、ScDREB5-8、ScDREB5-10基因的理化性质（如表2），其中ScDREB5-10基因的分子重量（MW）为42.27kDa，等电点（PI）为5.58，预测定位于细胞核；ScDREB5-6基因的分子（重）量为25.18，等电点为8.6，预测定位于细胞核；ScDREB5-8基因的分子（重）量为19.13，等电点为9.16，预测也定位于细胞核；ScDREB5-3基因的分子（重）量为24.12，等电点为5.58，预测定位于线粒体，这与其他三个基因作为转录因子定位于核不同，表2
表2
实施例3：4个齿肋赤藓ScDREB5-3、ScDREB5-6、ScDREB5-8、ScDREB5-10基因对非生物胁迫的响应特征：
利用实施例1中所述方法提取经干旱、高盐、低温和高温四种非生物胁迫处理后的齿肋赤藓RNA并用相同方法进行反转录，得到四种不同处理下的cDNA样品，10倍稀释备用；同时用ABA处理健壮的齿肋赤藓植株，提取RNA，反转录成cDNA备用；其中干旱处理采用20%PEG模拟干旱环境，250mM NaCl溶液模拟高盐环境，温度4℃、温度45℃模拟低温和高温环境；外施ABA浓度为100uM；用TAKARA SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒进行qPCR反应，具体操作参照TAKARA SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒说明书；
qPCR体系如下：
反应条件：温度95℃，时间30s；温度95℃，时间5s；温度(ScDREB5-10：56℃；ScDREB5-8：58℃；ScDREB5-6：56℃；ScDREB5-3：58℃)，时间30s，40个循环；
实验仪器为Bio-Rad公司CFX96Real-Time PCR Detection System。实验结果分析采用Bio-Rad CFX Manager software软件进行分析；
经外源施100Um ABA后，四个DREB基因的表达特性如图3，ScDREB5-6、ScDREB5-8、ScDREB5-10均在2小时和12小时有一个表达高峰，说明这三个基因均是响应脱落酸胁迫，在转录调控通路上属于脱落酸-依赖型的；ScDREB5-3在0.5小时表达量较大，然后随着时间推移逐渐下降，到12小时又升高并达到高峰，说明ScDREB5-3也是响应脱落酸，并属于脱落酸依赖型的。
对本发明中ScDREB5-3基因在受到干旱、高盐、冷和热四种胁迫后的表达特性分析发现，该基因在受到干旱胁迫后的表达呈双峰表达模式，在0.5小时和12小时的表达量均较高，6小时是该基因表达最低值；在受到盐胁迫后，该基因的表达呈逐渐升高趋势，相对表达量的最高值出现在24小时；在受到冷胁迫时，该基因表达先升高在降低，最大值出现在0.5小时；在受到热胁迫后，该基因在10分钟内表达量在0.4，在0.5小时升高到1.7左右，并在随后的12小时内表达量均维持在这个水平，说明该基因对热的响应较强烈；
对本发明中ScDREB5-6基因在4种非生物胁迫下的表达特性分析表明，该基因在受到干旱胁迫后在2小时和24小时有表达高峰；在受到盐胁迫后，该基因的表达量在0.5小时处达最高，在随后研究的2小时及以后的时间里该基因的表达值明显低于0.5小时值；在受到冷胁迫后的12小时内，该基因的相对表达值均在0.7左右，无明显变化；在受到热胁迫后，该基因的相对表达值在10分钟有一个峰值，在随后的时间里从0.5小时开始缓慢升高，但到12小时时表达量仍低于10分钟时的表达量；
对本发明中ScDREB5-8基因在4种胁迫下的表达分析发现，该基因在受到干旱处理后的表达为波动上升；在受到盐胁迫处理后该基因的表达在前12小时无明显变化，而在24小时后该基因相对表达值强烈升高；在受到冷胁迫后，该基因的相对表达量逐渐降低，最高值在10分钟，说明该基因对冷的响应时一种快速响应，能在受到胁迫10分钟内强烈表达，而后随着时间推移，表达量降低；在受到热胁迫后，该基因的表达值无明显变化，说明该基因对热胁迫不响应；
对干旱、高盐、低温和高温4种胁迫下ScDREB5-10基因的表达特点作分析，结果如图8，在受到干旱胁迫6小时后，ScDREB5-10基因的表达量上升到一个峰值，随后在12小时又降到低到比0.5小时更低的水平，在24小时又有所回升；在受到盐胁迫后，该基因的表达量在0.5小时和12小时点处呈现双峰表达模式；在受到冷胁迫后，该基因在10分钟、2小时时的表达量高于其他时间；在受到热胁迫后，该基因的表达为先逐渐下降，到12小时处又突然升高；以上说明ScDREB5-10基因对干旱、高盐、冷和热均有一定的响应，并且响应的方式不相同。
实施例4：4个齿肋赤藓ScDREB5-3、ScDREB5-6、ScDREB5-8、ScDREB5-10转录因子在酵母中的功能验证：
4个基因酵母表达载体的构建：
设计带酶切位点的引物（ScDREB5-3：EcoRⅠ和HindⅢ；ScDREB5-6：EcoRⅠ和HindⅢ；ScDREB5-8:EcoRⅠ和KpnⅠ；ScDREB5-10：BamHⅠ和KpnⅠ）以pMD19-T-ScDREB5-3、pMD19-T-ScDREB5-6、pMD19-T-ScDREB5-8、pMD19-T-ScDREB5-10质粒为模板引入带酶切位点的全基因，构建到pMD19-T-simple载体，测序，将测序正确的转化子质粒和酵母表达载体pYES2共同双酶切，回收，连接，转化，测序鉴定，得到构建正确的酵母表达载体pYES2-ScDREB5-3、pYES2-ScDREB5-6、pYES2-ScDREB5-8、pYES2-ScDREB5-10空载质粒和转基因质粒用乙酸锂法共同转化酿酒酵母INVSc1感受态细胞，在尿嘧啶缺陷型培养基（SD-URA）上筛选阳性转化子INVSc1-pYES2和INVSc1-pYES2-ScDREB5-3、INVSc1-pYES2-ScDREB5-6、INVSc1-pYES2-ScDREB5-8、INVSc1-pYES2-ScDREB5-10。并挑取单菌落进行扩大培养，提取转化子质粒并反转入大肠杆菌感受态细胞后，做菌液PCR并将阳性株送测序公司测序。经序列比对证明4个基因ScDREB5-3、ScDREB5-6、ScDREB5-8和ScDREB5-10已成功构建到PYES2载体并转化酵母菌株INVSCI成功；
4种重组酵母的逆境胁迫实验：
挑取重组酵母单菌落进行各种逆境胁迫实验；
非胁迫处理：
分别挑取4种重组酵母和对照酵母INVSC1（pYES2）单菌落，接种于SC-U液体培养基（终浓度2%葡萄糖为碳源）中，温度30℃振荡培养20h左右；
测定培养物OD600值，取一定量的培养物，4000r/min，离心1min，弃上清，菌体重悬于10ml SC-U（终浓度2%半乳糖为碳源及诱导底物）诱导培养基中，使得菌液OD600值为0.4，30℃振荡培养，使10ml诱导培养基（SC-U+2%半乳糖）中菌体OD600为0.4，温度30℃诱导表达36h；
再测定培养物OD600值，取一定量的培养物，4000r/min，离心1min，弃上清；
菌体重悬于200μl灭菌水中，使得菌液OD600为2；
将菌液依次稀释10、100、1000、10000、100000或1000000倍后，取2μl接种于SC-U（终浓度2%葡萄糖为碳源）固体培养基，温度30℃倒置培养2天左右，观察菌落存活情况；
干旱胁迫处理：
分别挑取四种重组酵母和对照酵母INVSc1（pYES2）单菌落，接种于SC-U液体培养基中，温度30℃振荡培养20h左右；
按照非胁迫处理操作方法在温度30℃诱导表达24h；
再测定培养物OD600值，取一定量的培养物，4000r/min，离心1min，弃上清；
菌体重悬于200μl3mol/l山梨醇溶液中，30℃胁迫24h；
将菌液依次稀释10、100、1000、10000、100000或1000000倍后，取2μl接种于SC-U（终浓度2%葡萄糖为碳源）固体培养基，温度30℃倒置培养2天左右，观察菌落存活情况；
盐胁迫处理：
分别挑取四种重组酵母和对照酵母INVSc1（pYES2）单菌落，接种于SC-U液体培养基中，温度30℃振荡培养20h左右；
按照非胁迫处理操作方法在温度30℃诱导表达24h；
再测定培养物OD600值，取一定量的培养物，4000r/min，离心1min，弃上清；
菌体重悬于200μl4mol/l NaCl溶液中，30℃胁迫24h；
将菌液依次稀释10、100、1000、10000、100000或1000000倍后，取2μl接种于SC-U（终浓度2%葡萄糖为碳源）固体培养基，温度30℃倒置培养2天左右，观察菌落存活情况；
低温胁迫处理：
分别挑取四种重组酵母和对照酵母INVSc1（pYES2）单菌落，接种于SC-U液体培养基中，温度30℃振荡培养20h左右；
按照非胁迫处理操作方法在温度30℃诱导表达24h；
再测定培养物OD600值，取一定量的培养物，4000r/min，离心1min，弃上清；
菌体重悬于200μl灭菌水中，使得菌液OD600为2；
将菌液放置在温度4℃冰箱中胁迫24h；
将胁迫后的菌液依次稀释10、100、1000、10000、100000或1000000倍后，取2μl接种于SC-U（终浓度2%葡萄糖为碳源）固体培养基，温度30℃培养48h，观察菌落存活状况；
高温胁迫处理：
分别挑取四种重组酵母和对照酵母INVSc1（pYES2）单菌落，接种于SC-U液体培养基中，温度30℃振荡培养20h左右；
按照非胁迫处理操作方法在温度30℃诱导表达24h；再测定培养物OD600值，取一定量的培养物，4000r/min，离心1min，弃上清；
菌体重悬于200μl灭菌水中，使得菌液OD600为2；
将菌液放在温度53℃培养箱中胁迫1h；
将胁迫后的菌液依次稀释10、100、1000、10000或100000倍后，取2μl接种于SC-U（终浓度2%葡萄糖为碳源）固体培养基，温度30℃培养48h，观察菌落存活的状况。
为研究4个齿肋赤藓ScDREB基因的功能，将重组酵母菌和对照酵母菌分别诱导培养36h，然后进行非生物逆境胁迫试验（图9），由图9a可见，非胁迫条件下四种重组酵母和对照酵母的生长状况一致，说明二者的胁迫初始浓度及菌活力相同，在3M山梨醇模拟干旱胁迫下，重组酵母INVSC1(pYES2-ScDREB5-10)和INVSC1(pYES2-ScDREB5-8对干旱的抗性表现显著优于对照酵母INVSc1(pYES2)，对照酵母菌在受到胁迫后只能在10倍稀释后有少量菌存活，而转基因酵母在稀释10000倍以后仍有部分菌生长，说明在干旱胁迫条件下，ScDREB5-10和ScDREB5-8基因的表达对酵母细胞的抗旱能力有显著提高，在4MNaCl模拟高盐胁迫处理下，重组酵母INVSC1-pYES2-ScDREB5-10和INVSC1-pYES2-ScDREB5-8表现出比对照更强的抗盐能力（图9.c），在稀释100000倍后仍有菌体能生长，说明ScDREB5-10和ScDREB5-8基因的表达对提高酵母的抗盐能力有十分显著的作用。在温度4℃低温胁迫处理后，重组酵母INVSc1-pYES2-ScDREB5-3和INVSc1-pYES2-ScDREB5-6的菌落存活率高于对照酵母INVSc1-pYES2(图9.d)，且随着稀释倍数的增大，二者的差异也更加明显，尤其在稀释105倍时，对照酵母菌难以生长而重组酵母菌仍然生长比较旺盛，说明ScDREB5-3和ScDREB5-6基因的表达一定程度上提高了酵母细胞对低温胁迫的耐受能力。在温度53℃高温处理1小时后，四种转基因酵母比对照的存活率在稀释106时有所差异，存活率高于对照。说明四种基因在提高酵母抵抗高温的能力均不是很强。
综上所述，通过酵母表达体系初步验证了从耐旱藓类齿肋赤藓中克隆得到的4个ScDREB基因具有抗旱，高盐，低温胁迫的特性，在植物抗逆基因工程育种方面具有重大的潜能。
发明名称：极端耐旱藓类植物齿肋赤藓4个DREB转录因子及编码基因和应用
申请人：中国科学院新疆生态与地理研究所
4个DREB转录因子为ScDREB5-3、ScDREB5-6、ScDREB5-8和ScDREB5-10，它们具有SEQ IDNO:5-8所示的氨基酸序列为：
SEQ ID NO:5 转录因子ScDREB5-3氨基酸序列
MVEKNASQRAASDSRLEFLGVTKAKAKNEKAPSSPKYKGVRMRQWGKWVSEIREPNKRSRIWLGSFPTAEMAAKAYDAAVVCLRGSNAELNFPDSPPRVVPTCTSPKDVQIAAAAAAAAADPCTPVSLPALGAQPVAQSLETQLHKMDSSAVECVAESSPACSFVTLDQVELAWSDMKFIDLPPLEDLVDSSEQSSTSSAVYCRVSSGPLERNIMDNCYNVFAV
SEQ ID NO:6 转录因子ScDREB5-6氨基酸序列
MVTSWKKCRRTSSEHAPPRRRRDALKKLVGKIVHSIVPESSSEYRGVRYRVELNKYVTEIRPSRSTKKIWLGTYDTAEEAARAFDIGNLCCKKNLPLNFADSPGMLKKISSRLSPDATRNAIAQLAKEVAALQAVVRTQKLETETSGVTYTEILQEQVATVMDCEEEEAVATTMPLQAADEGGSGSGYSWSFDLRTIFTADDNANVPLHKLINFGSSESIYVHTYP
SEQ ID NO:7 转录因子ScDREB5-8氨基酸序列
MPGMAPSAWRLGAGAGVMKVERREVVEKVCKDREDRDIDLNVPYVMEEESMSATSSTSGEKGGSGASDEVHYRGGAGDASYRGVRHRPELNKWVTEIRPTAQKRKIWLGTYKTPEEAARAYDVGIHYTGKKIPLNFPDSMPNLPELPRGTWEEIAPFVKKQAVSAAKRHRGF
SEQ ID NO:8 转录因子ScDREB5-10氨基酸序列
MAGEEAPSTLCRIWSAITPLMRFKNKIREHLWASSLLNDPDLHRETETASTLPEQHYYDASSQAFEAASPPAVTASFYDNPGDLATQLQAMQRNAHAEPEVYMSLDDFPVELISQPISADSYHRSTSEPISEDSYDRSISEPISEDSYDRSMSQPISEDSYLRSMSQPIEEDFTSDGADDDQSSEMMDTGAESSDLRRESSAEEWQQIMFFRHFFGMDSTVPPVPGWTVVVGIVSVFKRITGLIRQRRQERAQNQVAVVPRPRRRRAVVVTRYKGIRPRNGKWVSEIRIGGTKEKVWLGSYNTEKEAALAFDAGKHHCSLLRRTRGFNFNDSPRFLGPPQRFEHLTSEKRRENIKRLAEEHALTYASADIR
4个DREB转录因子为ScDREB5-3、ScDREB5-6、ScDREB5-8和ScDREB5-10，它们具有SEQ IDNO:5-8所示的核苷酸序列为：
SEQ ID NO:1ScDREB5-3基因的核苷酸序列
GGCGGTTAAGGGAGCGCGTCACCCAGAACATCCAAGTGGCAATTTCCGCGAAGGTGAGACCTTCACACCTGTCCTGTTGCCTTGGGATTCATGTGTCTCGGAGTCGGGTATATATGCCGCTTCGAGCTCTGAAAAGAGGAAAAGTAGCTGTGTGAAGGTCGATATCAGAGACTGAAGAGAGCAAGAGACCGAAGCAGGAAAGACAGGAAGGAGAGCAAGTCATTGAAGCAGGAAAGACAGGAAGTAGAGCAAGGCATTGAAGCAGGAAAGAAAGGAATGGTGGAGAAGAACGCCAGCCAGAGAGCAGCGTCGGACAGTCGTCTAGAGTTTCTGGGAGTGACCAAGGCCAAGGCGAAGAATGAGAAGGCGCCTTCGAGTCCCAAGTACAAGGGCGTGCGCATGCGGCAGTGGGGAAAGTGGGTGAGCGAGATTCGGGAGCCCAATAAGCGGTCGAGGATATGGCTGGGCTCGTTTCCCACAGCGGAGATGGCTGCTAAGGCGTACGACGCTGCCGTCGTGTGCTTGCGGGGCTCCAACGCGGAACTCAACTTCCCCGACTCGCCTCCGCGCGTGGTCCCCACCTGTACCTCGCCCAAGGACGTGCAGATCGCCGCCGCGGCTGCCGCGGCCGCTGCGGACCCGTGCACTCCGGTGTCGCTCCCCGCGTTGGGGGCGCAGCCCGTTGCGCAGTCACTGGAAACGCAGCTGCACAAGATGGATTCTAGCGCGGTGGAGTGCGTGGCAGAGTCATCCCCGGCGTGCTCGTTCGTCACGCTGGACCAGGTCGAACTCGCGTGGAGCGACATGAAGTTCATCGACCTGCCGCCGCTAGAGGATCTTGTCGATTCGTCCGAGCAATCCTCAACTTCCTCTGCTGTGTATTGCCGTGTTTCGTCAGGTCCTCTCGAGAGGAACATCATGGATAATTGCTACAATGTGTTCGCGGTATAACGATTTCAGGGCTTCAGAAGCAATTTTGCCGGTGTGGGAAAAGACGGAGTAGTTTTCGATGAAACGTAGGGCTTTCTTTCCCGAACGGAGCGGTTTTCGATGAGTTTTAGGGTTTTAGACCAAAATTTTCCAGGTGTAGGAAAGATTTTTGCCGGCGTAGATAGATGAAACCCAAGCTGTGAGCTTGGTCATCTCTCTTCACCATTTCTAGACATTGTTCTCTGCTTATGTAAAGTAGATGGATAGCTGCAGATAGAGCATGTACCAATTTTTTCTCTGATTCAGCAGAGGTTAGTGTCATACACCCAATTCCTCTCGATGTGAGACCATGTAAAAAGACACTGCTTTTTGATAAGTGTCTACCTCAAAATTCAATGTTTTGGTTCTGGTTCTTACATCGAGAGGAATTGGGTGTATG
SEQ ID NO:2ScDREB5-6基因的核苷酸序列
ACACACTTCAAGCAACAGAAACCTCACTCCAGTCTCTCTCAAGCATGTCTAGGTAGTTGTTGGTTTCTCAATATACAGTGTCTAGATTTCTGTTGCTTTGTCAATATATAGTGTCTAGATTGGTGTTGCTTTCTCAATTGTGTCTAGATTGGTGTTGCTGTCCGACAATCGGTTGTGAATGATAAGGAGGAAGCAGACTAGTGGAGCTGAGAGGGCGAAGGTGAAGTTGAAGGGCTGATCATGGTGACTTCGTGGAAGAAGTGTCGCCGCACATCGTCAGAGCACGCGCCTCCGCGCCGTCGACGTGACGCGCTGAAGAAACTAGTTGGGAAGATCGTGCACAGCATTGTGCCGGAGTCATCCAGCGAGTACCGAGGAGTGCGGTACCGGGTGGAGCTGAACAAGTACGTGACGGAGATCAGGCCGTCCCGGAGCACGAAGAAGATCTGGCTGGGGACGTACGACACGGCGGAGGAGGCGGCGCGCGCGTTCGACATCGGCAACCTGTGCTGCAAGAAGAACCTGCCGCTCAACTTCGCGGACTCGCCCGGGATGCTCAAGAAGATCTCGTCCCGCCTCTCCCCGGACGCGACCCGCAACGCCATCGCCCAGCTGGCCAAAGAGGTCGCCGCGCTGCAAGCTGTGGTCAGGACGCAGAAGCTGGAAACGGAGACCTCCGGCGTCACCTACACCGAGATCCTCCAGGAACAGGTCGCCACTGTGATGGACTGCGAAGAAGAAGAAGCTGTGGCCACCACCATGCCGCTGCAGGCCGCGGACGAAGGCGGCTCCGGCTCTGGATACTCGTGGAGCTTCGACCTGAGAACCATCTTCACCGCTGACGACAATGCCAACGTCCCGCTCCACAAGCTCATCAACTTCGGATCGTCTGAGTCCATATACGTCCACACTTATCCCTGAATACAGGTACCATGATGCACTTCTTCATACAACTTCAACTTGATTACACAGGCGAAGCATCAACCTGGGGAGTGAGTCCTGTGCACACTGTTTCTTATGTATACGATAGCATAGTGTTTTCTGTTTTTCTGGTATATATTTGTATGATCAATTTTCGAGGATATGTATATTATACAATCAGGTTCAGATCAATGTATAGAGGAGAGAGACTTGCTGCTAAGTTAGATATGATGTGGGCAGCGTCACGGCAGGATTGCTATGGAATTACTGATTTTTATACGACAATGATGTAAAAGCACAGACAGTTTTGTCTTTAATGGAGAGACGTTCGAGGAAAGCTTTTGAGAGTGGGACCCAGGTCCTTGACTTGGT
SEQ ID NO:3ScDREB5-8基因的核苷酸序列
CTCTCTGCTCCAGCGTGGCACACGCTTCCCGCGGACGCGACGCCACCTGGGCAGCGGGCAGTGGTCAAAGCCGGCACAGCCCTGCAGTTACCTTATAATAGGCCGGCTCCGCTCTCCATCTCTCCATTGCAAATTTGGCACCGACATCTAACACTCACCAAAGCGTAAGAGAGAGGAGCAGAGAGAAGGGTTTGCACCAAGACGTTATGCCTGGGATGGCACCTTCAGCGTGGAGATTGGGAGCAGGAGCAGGAGTGATGAAGGTGGAGAGGCGGGAGGTCGTGGAGAAGGTGTGCAAGGACAGGGAGGACAGGGACATTGATCTCAACGTGCCGTATGTGATGGAGGAGGAGTCCATGTCGGCCACGAGCAGCACCAGCGGGGAGAAGGGCGGCAGCGGGGCCTCCGACGAGGTGCACTATAGGGGGGGCGCGGGCGACGCCAGCTACCGCGGCGTGCGGCACCGCCCGGAGCTCAACAAGTGGGTCACGGAGATCCGCCCCACGGCGCAGAAGCGCAAGATCTGGCTGGGGACTTACAAGACGCCGGAGGAGGCCGCGCGCGCCTACGACGTCGGGATCCACTACACGGGGAAGAAGATCCCGCTCAATTTCCCCGACTCCATGCCCAACCTCCCCGAGCTCCCGCGCGGGACGTGGGAGGAGATCGCGCCGTTCGTCAAGAAGCAGGCCGTCTCCGCCGCCAAGCGCCACCGAGGGTTTTGAGGTGATCTTCGATGTCACCTCCCTCGACGGATTTTTTGTACAAGCGCAGTTTTGGCTTCCTTTTTCCTTCCTTTTTTCGCCAAGAATCGGAGCCAAGACGAGGACCTCTTAGTAGTTGCCCCTCTTTTTGTATATAGATAGATAGCTTCCCCTATCGCTACCATTCTTTGGGGTTTCTTTCTGGCTGTCAACTCCCAGAACGTCCCTTCCGCCACCCATAGGGTACCGATTGTTTTCATGACGGCGTCCCGGCGCAAATTGCATTGCCCCTCTGATGAGATCCGAAATAATAATAAAACTCTCGCGTTACCACTCCACTTCGTCTGTCTCTGCATTGTTGCATCGTCGC
SEQ ID NO:4ScDREB5-10基因的核苷酸序列
CCAGTGGAGAGGCTCTCAAGTCAAGAGGTCACATCATTCAGGCTGCTGCATCTTCCAGCCCTTCCGCATTCCACAGCGTGCATCTTGTACGTACAGTACCACCGACCTCACAAGAGGTAGTCTTATTCTTGGTTTGTCAAGGCTTACTAGTGCAGTGGAATCTGCTTGTTTTCTGAAGTCTGTGGGAGGTGCTACTTCTGTAGCAAGAGAAGTTTGTGGCGGAGACGTATTTGGAGACGAGGAGACTGACTTCGCCACGCTTTCTCTGACACAGAGCGCGATGGCCGGCGAAGAAGCTCCGTCGACCCTTTGTCGAATATGGAGTGCGATCACCCCCCTGATGCGGTTCAAGAACAAGATCCGGGAACATCTGTGGGCCTCCTCGCTTCTGAACGATCCAGATCTCCACAGGGAAACGGAAACCGCTAGCACATTACCCGAACAACACTACTACGACGCGTCGTCTCAAGCATTCGAAGCTGCTAGTCCACCGGCTGTGACTGCAAGCTTTTATGACAATCCCGGAGACCTCGCGACACAACTGCAGGCCATGCAAAGAAATGCCCACGCCGAACCGGAAGTCTACATGTCACTCGATGACTTCCCTGTAGAGCTGATATCACAACCAATCTCGGCGGATTCCTACCACAGGTCGACATCGGAACCGATCTCGGAGGATTCCTACGACAGGTCGATATCGGAACCGATCTCGGAGGACTCCTACGACAGGTCGATGTCGCAACCGATCTCGGAGGATTCCTACCTCAGGTCGATGTCCCAACCGATCGAGGAAGACTTCACTAGTGACGGCGCTGATGATGATCAGTCGAGTGAGATGATGGACACGGGAGCTGAGTCGTCTGATCTTCGCCGTGAGAGCTCCGCCGAGGAATGGCAGCAGATCATGTTCTTCCGGCACTTCTTCGGGATGGACTCCACGGTGCCCCCCGTGCCCGGGTGGACCGTCGTCGTGGGAATCGTGTCGGTGTTCAAGCGCATCACGGGCCTCATCCGGCAACGACGCCAAGAGAGAGCTCAGAACCAAGTAGCTGTGGTTCCGAGGCCGAGGAGGAGAAGGGCGGTGGTGGTGACGAGGTACAAGGGAATTCGTCCCCGGAACGGCAAGTGGGTGTCGGAGATCCGCATTGGAGGCACCAAAGAGAAGGTGTGGCTGGGGTCGTACAACACGGAGAAGGAGGCGGCGCTGGCGTTCGACGCGGGGAAGCACCACTGCAGTCTGTTGAGGAGGACCCGGGGCTTCAACTTCAACGACTCGCCCCGGTTCCTCGGCCCACCCCAGCGATTCGAACACCTTACGTCCGAGAAGAGAAAGGAAAATATCAAGAGATTGGCGGAGGAGCATGCATTAACTTACGCATCCGCAGACATCCGGTGATCATTGCCACTCCTCCAGGCTCACTAGCCATTCATTACATGTGTAGACTACTTTAGGGCTTAGGATTCTTTGTTCTTTTTATCACGGTTTGGACTATTTCTTTCCCGGCTTTCCATTGTGATGTTGGATATCACATGGGATAACCAGCAGCTTGCGTTTGTTTTTCCATTGTTTATGATTCAGACTTTAGGGTTTTAAGTTCAGCGTTTCAGGTCTAGGGTCTAGGGTTCTCCGTTCTTCTTATGGTCTGTACAATTTTTAAACTTGTAGTGTGTACCTTTGTAGATTATATGAGATGATTTGCAGCCTGTGACTGCTGCCCACACTTCTTCCAAAATTAAAAAAAAACCCAAAGCTACAAAGATATGCCCAAA。

Claims (3)

1.一种极端耐旱齿肋赤藓的DREB转录因子组，其特征在于包含DREB转录因子ScDREB5-3、ScDREB5-6、ScDREB5-8和ScDREB5-10，
所述的转录因子ScDREB5-3，含有224个氨基酸，其氨基酸序列SEQ ID NO:5，编码基因ScDREB5-3的基因编码区长为675bp，其核苷酸序列SEQ ID NO:1；
所述的转录因子ScDREB5-6，含有226个氨基酸，其氨基酸序列SEQ ID NO:6，编码基因ScDREB5-6的基因编码区长为681bp，其核苷酸序列SEQ ID NO:2；
所述的转录因子ScDREB5-8，含有172个氨基酸，其氨基酸序列SEQ ID NO:7，编码基因ScDREB5-8的基因编码区长为519bp，其核苷酸序列SEQ ID NO:3；
所述的转录因子ScDREB5-10，含有371个氨基酸，其氨基酸序列SEQ ID NO:8，编码基因ScDREB5-10的基因编码区长为1116bp，基因的核苷酸序列SEQ ID NO:4。
2.根据权利要求1所述极端耐旱齿肋赤藓的DREB转录因子组的功能测试方法，其特征在于将所示的核苷酸序列按常规方法进行酵母表达载体构建，酵母表达载体导入宿主，其中宿主为酵母菌株INVSc1，得到具备抗逆能力的转ScDREB5-3、ScDREB5-6、ScDREB5-8、ScDREB5-10基因的转化。
3.根据权利要求1所述的极端耐旱齿肋赤藓转录因子组在制备植物抗逆性育种和改良的用途。
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Molecular cloning of a stress-responsive aldehyde dehydrogenase gene ScALDH2 from the desiccation-tolerant moss Syntrichia caninervis and its responses to different stresses;Yang H.等;《Molecular Biology Report》;20121231;第39卷;第2645-2652页 *

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