CN105112395A - 猕猴桃AdPDC1基因与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了猕猴桃AdPDC1基因与应用。该猕猴桃AdPDC1是具有序列表中的SEQIDNO.2所述氨基酸序列的蛋白质，其编码基因为AdPDC1基因SEQIDNO.1的DNA序列。猕猴桃AdPDC1基因受涝害、盐害诱导表达。过量表达AdPDC1的转基因拟南芥与野生型组相比，耐涝性能力显著增强。说明猕猴桃AdPDC1在植物提抗涝害的过程中起着重要的作用。另外，ABA处理条件下，转猕猴桃AdPDC1基因的拟南芥发芽率和根长显著的低于野生型株系，说明猕猴桃AdPDC1与植物激素ABA呈现负相关的关系。因此，AdADH1基因及含有所述的AdPDC1基因的重组表达载体可在创制耐涝新种质和/或植物品种改良中应用。

Description

猕猴桃AdPDC1基因与应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及猕猴桃AdPDC1基因与应用。
背景技术
猕猴桃属于猕猴桃科(Actinidiaceae)猕猴桃属(Actinidia)落叶性藤本果树，全世界猕猴桃属植物有54个种21个变种，共约75个分类单位，种质资源极其丰富。1904年，新西兰从我国引种猕猴桃，人工驯化，开始品种选育工作和商业化生产。目前市场上栽培的主要品种大多选自于美味猕猴桃和中华猕猴桃，还有少量选自软枣猕猴桃。猕猴桃由于含有极其丰富的营养价值，尤其是Vc含量很高，被誉为“Vc之王”，所以越来越受到人们的青睐。
江苏省夏季雨季较长，雨水较多，给猕猴桃生长生产带来了严峻的挑战。2011年，由于雨季雨水较多，涝害严重，扬州市大量成年猕猴桃植株死亡，给果农造成了巨大的经济损失。因此，猕猴桃的耐涝问题是制约江苏省猕猴桃产业发展的主要因素之一。选育耐涝性砧木和品种资源无疑是解决该问题的主要途径。随着分子生物学及基因工程技术在果树领域的应用，应用基因工程技术手段来改造猕猴桃的抗性，是今后抗性研究的目标。因此，挖掘和研究猕猴桃耐涝基因将会为通过基因工程技术手段培育猕猴桃耐涝性砧木和品种资源奠定理论基础。
目前，有关植物耐涝基因筛选方面的研究较少，关于耐涝基因的表达与调控方面的研究更是微乎其微。猕猴桃品种‘金魁’是我国选育的美味猕猴桃品种之一，抗旱、耐涝、抗冻能力较强。在猕猴桃耐涝基因挖掘方面的研究还未见报道。因此克隆和研究猕猴桃抗逆相关基因，对于开发具有中国自主知识产权的果树抗逆基因具有重要的意义。
发明内容
发明目的：
本发明的目的是提供猕猴桃AdPDC1。
本发明的另一目的是提供该猕猴桃AdPDC1的编码基因。
本发明的又一目的是提供该基因的功能。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
本发明所提供的猕猴桃AdPDC1，来源于猕猴桃优良品种‘金魁’，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。
本发明所述的猕猴桃AdPDC1的编码基因，其cDNA序列如SEQIDNO.1所示，含有1821bp的最大开放阅读框，编码SEQIDNO.2所示的606个氨基酸残基序列。
含有本发明AdPDC1编码基因SEQIDNO.1的表达载体。
所述的表达载体优选将所述的猕猴桃AdPDC1的编码基因插入到pCAMBIA1301载体的KpnⅠ和SacⅠ酶切位点间所得。
宿主菌是指将pCAMBIA1301-AdPDC1转入的根癌农杆菌EHA105.
扩增AdPDC1cDNA全长的引物为：
AdPDC1-ORFsense：5'-TGAAGGGTTGTACTCATCATTAT-3'
AdPDC1-ORFantisense：5'-CAAGTGGCTCAACACAAACTAC-3'
实时荧光定量RT-PCR分析中涉及的AdPDC1的qPCR引物为：
AdPDC1-qPCRsense：5'-TGGAGTGTACTGGAAGTGTCAATG-3'
AdPDC1-qPCRantisense：5'-AGCAGGGAGGTCGGAACG-3'
上述猕猴桃AdPDC1、其编码基因、含有编码基因的表达载体在培育耐涝植物中的应用。
有益效果：
本发明在金魁猕猴桃中克隆到一个AdPDC1基因，AdPDC1参与猕猴桃耐涝胁迫过程。
AdPDC1编码基因在涝害胁迫和盐害胁迫诱导条件下表达。转基因拟南芥中过量表达AdPDC1编码基因，与对照组相比，转基因材料表现耐涝的特性。这一结果说明AdPDC1基因参与植物抵抗涝害胁迫过程中起着非常重要的作用。另外，在植物激素ABA处理条件下，转基因拟南芥的发芽率和根长显著的低于野生型株系，说明猕猴桃AdPDC1基因与ABA呈现负相关的关系。
本发明的AdPDC1基因对于培育耐涝植物品种或植物改良品种具有重要意义，在作物育种方面具有广泛的应用前景。
利用本发明的植物表达载体，将AdPDC1基因导入植物体内，可以获得耐涝的转基因植株。
附图说明
图1植物PDC基因的系统进化树分析
图2AdPDC1基因在猕猴桃涝害(A)、低温(B)和高盐(C)胁迫下的表达特性
图3转基因拟南芥与野生型拟南芥在涝害胁迫处理条件下的表型观察
PDC1-3：转基因拟南芥株系；WT：野生型株系；A：处理前表型；B：涝害处理2周后表型；C：恢复生长1周后表型。
图4转基因拟南芥与野生型拟南芥在涝害胁迫处理后恢复生长1周后的根长(A)、鲜重(B)和干重(C)的统计分析
PDC1-3：转基因拟南芥株系；WT：野生型株系；
图5转基因拟南芥与野生型拟南芥在ABA处理条件下的表型(A)和发芽率(B)分析
图6转基因拟南芥与野生型拟南芥在ABA处理条件下的根长统计分析
PDC1-3：转基因拟南芥株系；WT：野生型株系；
具体实施方式
下列实例中所有的方法无特别说明，均为常规方法
实施例1猕猴桃AdPDC1基因的克隆与鉴定
实验材料为猕猴桃品种‘金魁’扦插苗，对其进行涝害处理0天，1天，2天，4天后，取其根部组织，参考蔡斌华等改进的CTAB法(蔡斌华，张计育，高志红，渠慎春，佟兆国，靡林，乔玉山，章镇.一种改良的提取草莓属叶片总RNA的方法[J].江苏农业学报，2008，24(6)：875-877)提取RNA，反转录cDNA。根据已经报道物种的序列，在PDC1最大开放阅读框两端分别设计引物AdPDC1-ORFsense：5'-TGAAGGGTTGTACTCATCATTAT-3'(SEQIDNO.3)和AdPDC1-ORFantisense：5'-CAAGTGGCTCAACACAAACTAC-3'(SEQIDNO.4)。以cDNA为模板，进行PCR，反应条件为：94℃5min热变性；94℃45s，58℃45s，72℃120s，共35个循环；72℃延伸20min。将PCR产物用胶回收试剂盒(Genscript)回收后，与pMD19-T载体(Takara,Japan)连接，然后转化大肠菌DH5α，挑选阳性克隆，进行测序。测序得到的片段长度为1283bp(SEQIDNO.5)，含有1931bp的最大开放阅读框(SEQIDNO.1)，编码606个氨基酸残基序列(SEQIDNO.2)。将所得到的序列SEQIDNO.2与其它植物的PDC基因构建系统发育树(图1)，结果表明，进化关系分为2类，分别为单子叶植物和双子叶植物，说明PDC基因在单子叶植物和双子叶植物分类进化过程中相对保守的。
实施例2猕猴桃AdPDC1基因在涝害、低温和高盐胁迫条件下的表达特性
以猕猴桃品种‘金魁’为材料，对其进行涝害、低温(4℃)、高盐(200mMNaCl)处理，处理后取其叶片，提取RNA，cDNA的合成用能消除RNA中残留DNA的试剂盒，PrimeScrioptRTreagentkitwithgDNAEraser(Takara,Japan)，具体步骤参照试剂盒说明书进行。利用实时荧光定量RT-PCR技术研究猕猴桃AdPDC1基因在涝害、低温和高盐胁迫条件下的表达特性。内参使用actin基因，引物序列为ACTIN-F：5'-TGCATGAGCGATCAAGTTTCAAG-3'(SEQIDNO.6)，ACTIN-R：5'-TGTCCCATGTCTGGTTGATGACT-3'(SEQIDNO.7)。根据AdPDC1基因序列设计表达检测引物AdPDC1-qPCRsense：5'-ATAGAAGTTGAGATTCACGATGGG-3'(SEQIDNO.8)和AdPDC1-qPCRantisense：5'-TCTATGAAGCACAAGCAGTCTTTC-3'(SEQIDNO.9)。实时荧光定量RT-PCR反应条件为：反应体系为稀释10×cDNA1μL，上下游引物分别为0.15pmol·L-1，10μLPremixExTaqTM(TaKaRa)10μL，ddH2O补足至20μL。反应程序为：95℃，4min；95℃20s，57℃，20s,72℃，40s，40个循环。数据分析采用7300system软件和的方法(LivakKJ,SchmittgenTD.Analysisofrelativegeneexpressiondatausingreal-timequantitativePCRandthe2-DDCtmethod.Methods,2001,25:402-408)
结果分析表明(图2)，涝害、高盐处理可以诱导猕猴桃AdPDC1基因的表达。但是涝害处理猕猴桃AdPDC1基因表达量的增加倍数显著的高于盐害处理后的表达量。低温胁迫处理未能诱导猕猴桃AdPDC1基因的表达。
实施例3AdPDC1基因的耐涝性鉴定
提取含有AdPDC1编码基因目的片段的T-载体及表达载体pCAMBIA1301质粒DNA，用限制性内切酶KpnⅠ和SacⅠ双酶切，切胶回收，然后用T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌。提取质粒，PCR和酶切鉴定。将大肠杆菌质粒用冻融法转入农杆菌(EHA105)感受态细胞，菌液PCR鉴定阳性克隆。获得AdPDC1过量表达表达载体pCAMBIA1301-AdPDC1。将过量表达载体通过用冻融法将pCAMBIA1301-AdPDC1转入根癌农杆菌株EHA105(Avsian-Kretchmeretal，2004，PlantPhysiology，135:1685-1696)中。pCAMBIA1301-AdPDC1通过农杆菌株EHA105的介导，转化拟南芥，利用抗生素筛选阳性转基因植株。将鉴定出的转基因T2代种子和野生型拟南芥种子同时播到栽培基质中，人工培养条件为：相对湿度80％，光照强度80-200μmol/M2/S，温光周期为16h光照，22℃/8h黑暗。
将培养35d的拟南芥株系进行涝害胁迫处理，处理条件如下：将营养钵放入处理箱中，用自来水淹没土壤表面0.5cm，处理箱中的温度控制在25℃左右。然后观察转基因株系和野生型株系在淹水条件下的表型特性，待看到表型后，将拟南芥株系转入正常生长条件下进行恢复，观察其表型特性。并对其鲜重、干重、和根长进行统计分析。
结果表明：涝害处理2周后，转基因拟南芥株系的生长情况明显好于野生型拟南芥(图3)。将涝害处理后的转基因株系和野生型株系转入正常生长条件下恢复1周后，转基因拟南芥株系的生长情况明显好于野生型拟南芥(图3)。对转基因株系和野生型株系的鲜重、干重、和根长进行统计分析，转基因株系的鲜重、干重和根长显著高于野生型株系(图4)。说明转猕猴桃AdPDC1基因的拟南芥株系提高了植物的抗涝性。
实施例4AdPDC1基因参与植物激素ABA信号途径
将鉴定出的转基因T2代种子和野生型拟南芥种子分别播种到MS，MS+ABA(2μM)、MS+ABA(10μM)的培养基上，然后放在相对湿度80％，光照强度80-200μmol/M2/S，温光周期为16h光照，22℃/8h黑暗的条件下进行培养，7天后统计发芽率。另外将鉴定出的转基因T2代种子和野生型拟南芥种子播种到MS基本培养基上，待其发芽露白后，转移到含有MS，MS+ABA(2μM)的培养基上，竖放培养，培养7天后，对其根长进行统计分析。
结果表明：在MS基本培养基上，转基因和野生型拟南芥种子的发芽率和根长没有差异(图5、图6)。在含有ABAMS培养基上，转基因拟南芥的发芽率和根长显著的低于野生型株系，说明转猕猴桃AdPDC1基因与植物激素ABA呈负相关的关系，猕猴桃AdPDC1基因参与植物激素ABA信号途径。

Claims (10)

1.猕猴桃AdPDC1蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。
2.权利要求1所述的猕猴桃AdPDC1蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的AdPDC1蛋白的编码基因，其特征在于其cDNA基因核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
4.含有权利要求2或3所述的猕猴桃AdPDC1蛋白的编码基因的表达载体。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于所述的表达载体是将所述的猕猴桃AdPDC1蛋白的编码基因插入到pCAMBIA1301载体的KpnⅠ和SacⅠ酶切位点间所得。
6.含有权利要求2和3所述基因的宿主菌。
7.根据权利要求6所述的宿主菌，其特征在于所述的宿主菌是将权利要求5所述的表达载体转入根癌农杆菌EHA105所得。
8.权利要求1所述的猕猴桃AdPDC1蛋白在培育耐涝植物中的应用。
9.权利要求2或3中所述的猕猴桃AdPDC1蛋白的编码基因在培育耐涝植物中的应用。
10.权利要求4或5所述的表达载体在培育耐涝植物中的应用。
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