CN104498512A - 拟南芥钙离子依赖蛋白激酶基因AtGPK1在调控气孔运动及植物抗干旱中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种拟南芥钙离子依赖蛋白激酶基因AtGPK1在调控气孔运动及植物抗干旱中的应用。本发明通过分子生物学筛选及转基因技术得到AtGPK1的功能缺失突变体(gpk1-1,gpk1-2)、突变体功能恢复植株(GPK1-C)及过量表达植株(GPK1-OE)。经对其的综合实验证实：AtGPK1在植物激素脱落酸(ABA)调控气孔运动中起到负调控因子的作用，同时在植物应对干旱胁迫中有调控作用。预示本发明的应用将有助于改良植物的抗旱胁迫能力，对培育抗旱高产的作物新品种有重要的理论指导意义，对我国农业生产具有巨大应用价值。

Description

拟南芥钙离子依赖蛋白激酶基因AtGPK1在调控气孔运动及植物抗干旱中的应用

技术领域

本发明涉及一种拟南芥钙离子依赖蛋白激酶基因的应用，尤其涉及一种拟南芥钙离子依赖蛋白激酶基因AtGPK1(Gene ID:841492)在调控气孔运动及植物抗干旱中的应用，属于分子生物学、基因工程技术领域。

背景技术

通过生物信息学对已公布的AtGPK1基因序列(Gene ID:841492)分析，表明其编码一种钙离子依赖的蛋白激酶。蛋白激酶又称蛋白质磷酸化酶，是一类催化蛋白质磷酸化反应的酶。它能把腺苷三磷酸(ATP)上的γ-磷酸基团转移到蛋白质分子的氨基酸残基上。其中钙离子依赖蛋白激酶(CDPKs)是植物体内重要的一类激酶，CDPKs作为植物体内主要的Ca²⁺感应蛋白，其对下游作用底物的磷酸化是植物调控蛋白活性及基因表达的主要方式。

前期的蛋白组学结果证明AtGPK1在植物保卫细胞中大量表达。基于保卫细胞是植物气孔的主要组成部分，植物蒸腾作用中水分的散失通过气孔进行，故对气孔运动调节及植物的抗旱性分析也已经成为科学研究的重要方面。

调控气孔的张开和闭合，即气孔的开度直接影响植物体内的保水性及抗干旱能力。虽然前期已经有AtGPK1基因序列的公布及蛋白组学的分析，但是通过学术检索，AtGPK1在调控植物气孔运动及抗干旱中的应用还没有相关报道。

发明内容

针对现有研究的不足，本发明的目的是提供一种拟南芥钙离子依赖蛋白激酶基因AtGPK1在调控气孔运动及植物抗干旱中的应用。

本发明所述拟南芥钙离子依赖蛋白激酶基因AtGPK1在调控气孔运动及植物抗干旱中的应用。

其中：本发明所述植物优选是十字花科植物，所述十字花科植物优选是拟南芥、芥菜、油菜、白菜或甘蓝。

本发明首先筛选AtGPK1基因的缺失表达突变体gpk1-1(SALK_036145)和gpk1-2(SAIL_26_C12)。然后根据已公布的AtGPK1基因核苷酸序列(Gene ID:841492)，通过RT-PCR技术从拟南芥中克隆钙离子依赖蛋白激酶基因AtGPK1。利用得到的基因片段构建植物表达载体，经过分子学和遗传学操作获得转基因植物，分别是AtGPK1的过表达植株(GPK1-OE)及突变体功能恢复植株(GPK1-C)。通过对以上植株生理性状的分析，这其中包括气孔运动、离体叶片失水、植物抗干旱等，阐明AtGPK1不同水平的表达(突变体、过表达、功能恢复)影响植物的气孔运动及抗干旱能力(结果见图1、图2、图3)，进一步证实拟南芥钙离子依赖蛋白激酶基因AtGPK1在调控气孔运动及植物抗干旱中的应用。

本发明首次阐明了拟南芥钙离子依赖蛋白激酶基因AtGPK1在调控气孔运动及植物抗干旱中的应用，为利用AtGPK1基因调控气孔的张开和闭合以实现调控植物体内的保水性及抗干旱能力奠定了基础，预示本发明的应用将有助于改良植物的抗旱胁迫能力，对培育抗旱高产的作物新品种有重要的理论指导意义，对我国农业生产具有巨大应用价值。

附图说明

图1：AtGPK1参与植物激素脱落酸(ABA)调控气孔运动过程。

其中：Open是指ABA抑制气孔开放过程；Closure是指ABA促进气孔关闭过程。

结果显示在ABA抑制气孔开放和促进气孔关闭过程中AtGPK1突变体(gpk1-1，gpk1-2)的气孔开度比野生型(Col-0)小，对ABA的作用过敏感；过表达(GPK1-OE)与突变体表型相反，ABA处理下气孔开度比野生型(Col-0)和空载体对照(EV)大；功能恢复植株(GPK1-C)气孔开度正常，恢复突变体过敏感的表现。说明AtGPK1的表达水平影响ABA调控气孔运动过程。

图2：AtGPK1参与植物离体叶片失水。同样条件下，统计离体叶片失水率。

与野生型(Col-0)和空载体对照(EV)对比，AtGPK1过表达植株(GPK1-OE)失水快，而突变体植株(gpk1-1，gpk1-2)失水较慢，功能恢复植株(GPK1-C)与野生型(Col-0)和空载体对照(EV)没有差异。说明AtGPK1调控植物离体叶片失水，影响植物体内水分散失。

图3：AtGPK1参与植物抗干旱过程。

干旱处理下，与野生型(Col-0)对比，AtGPK1突变体(gpk1-1，gpk1-2)抗干旱能力增强(如图3-A)；过表达(GPK1-OE)与空载体对照(EV)相比抗干旱能力减弱；功能恢复植株(GPK1-C)与空载体对照(EV)没有差异(如图3-B)。说明AtGPK1在植物抗干旱胁迫应答中起到重要的调节作用。

具体实施方式

以下实施例用于阐明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行，或按照产品制造生产厂商的使用说明。

实施例1拟南芥钙离子依赖蛋白激酶基因GPK1功能缺失突变体的获得和分子鉴定

1，订购T-DNA插入突变体

通过拟南芥生物信息学网站TAIR(http://www.arabidopsis.org/)，查询AtGPK1T-DNA插入突变体，根据T-DNA插入位置选取gpk1-1(SALK_036145)和gpk1-2(SAIL_26_C12)两个突变体，分别插入第六外显子和第七内含子处。

2，PCR方法筛选纯系T-DNA插入突变体

生长2-3周的拟南芥幼苗，提取基因组DNA，以此为模板进行PCR检测。

TPS法提取DNA：

1)用剪刀剪取1-2mm²大小的幼嫩叶片直接放入20μl的TPS缓冲液中；

2)在200μl的Tip管中把叶片充分碾磨；

3)碾磨后放入95℃中15分钟，然后迅速放入冰中冷却；

4)冷却后加180μl的ddH₂O到Tip管中，放置4℃冰箱，基因组DNA溶解于上清中，可直接做PCR反应模板。

TPS配方(20ml)：

用ddH₂O定容到20ml即可。

PCR方法应用三对引物法，即T-DNA插入左侧引物(LP)和中间引物，右侧引物(RP)和中间引物，左侧引物(LP)和右侧引物(RP)。

gpk1-1(SALK_036145)使用的引物序列分别是

gpk1-1-LP：5’-ATGACACACAGGTTACTCGGC-3’，

gpk1-1-RP：5’-AGTGAAACAGCTCATGGATGC-3’，

LBb1.3：5’-ATTTTGCCGATTTCGGAAC-3’；

gpk1-2(SAIL_26_C12)使用的引物序列分别是

gpk1-2-LP：5’-TGTTGTGGATTCCCACTTCTC-3’，

gpk1-2-RP：5’-TGGAAGGTGAAATCGACTTTG-3’，

LB2：5’-GCTTCCTATTATATCTTCCCAAATTACCAATACA-3’

纯系植株的鉴别方法：LP+RP没有扩增条带，LP+中间引物或/和RP+中间引物有扩出条带，说明为纯系插入。

通过此方法筛选到两个突变体的纯系插入。

3，RT-PCR方法鉴定AtGPK1突变体基因表达水平

筛选到T-DNA纯系插入突变体后，RT-PCR进行RNA表达水平的检测，证明为有效突变。

首先提取突变体总RNA，反转录后得到的cDNA为模板进行RT-PCR检测。

RT-PCR所用到的上游引物和下游引物分别是：

RT-PCR-LP：5'-ATGGGGAATTGCTTAGCCA-3'

RT-PCR-RP：5'-TTAGAACAATCTTGGTTGTTGTGG-3'

结果证明AtGPK1在两个突变体中都没有表达，为有效的缺失表达突变体。

实施例2拟南芥钙离子依赖蛋白激酶基因AtGPK1转基因植株获得

1，PCR方法克隆AtGPK1基因片段

以拟南芥总RNA反转录获得的cDNA为模板，以下面引物组合进行PCR扩增：

GPK1-OE-F：5'-TAGGATCCATGGGGAATTGCTTAGCCA-3'

GPK1-OE-R：5'-GTGAGCTCTTAGAACAATCTTGGTTGTTGTGG-3'

PCR产物电泳检测，切胶回收目的条带，纯化得到AtGPK1基因片段。

2，载体连接和转化

首先用纯化后的AtGPK1基因片段连接中间克隆载体Blunt(北京全式金公司产品)，转化大肠杆菌DH5α，通过抗生素筛选和菌落PCR得到阳性克隆；连接后的Blunt载体进行测序，获得测序完全正确的AtGPK1基因序列。

通过酶切组合BamhⅠ/SacⅠ将AtGPK1核苷酸序列从Blunt载体中切下，再次胶回收并连接到植物表达载体pSTART中。

3，转基因植株的筛选和获得

连接正确的植物表达载体pSTART-GPK1转化农杆菌EHA105，通过农杆菌浸染的方法进行转基因操作，转入野生型植株，获得过表达株系；转入突变体植株，获得功能恢复株系。具体实施方法如下：

农杆菌感受态转化步骤：

1)-80℃冰箱中取出农杆菌感受态细胞，冰浴融化，加入目的质粒DNA，轻弹均匀，冰浴30分钟；

2)冰浴结束后，液氮速冻1分钟，紧接着37℃水浴3-5分钟；

3)加入500μl无抗生素LB液体培养基，28℃、振荡培养2-4小时；

4)培养结束后收集菌体，100μl LB液体培养基重悬，菌液涂布在YEP固体培养基(添加相应抗生素)，28℃倒置培养2-3天；

5)挑取单克隆菌斑做菌落PCR鉴定。

农杆菌浸染拟南芥：培养约4周的抽薹拟南芥，将已经开放的花剪去。将已转化目的基因的农杆菌菌液在转化前一天放大培养(按照2％接种)，28℃振荡培养过夜。摇培至OD₆₀₀＝1.0-1.2后，6000rpm离心15分钟收集菌体，用转化介质将菌液稀释至OD₆₀₀＝0.8-0.9，加入Sillwet至终浓度为0.02％。将花盆倒置，花序浸入转染液中20秒，之后将花盆水平放置，在黑暗中培养24小时。之后在22℃，长日照(16小时光照，8小时黑暗)培养，收取种子。通过抗性筛选标记和PCR鉴定得到阳性转基因植株。

实施例3拟南芥钙离子依赖蛋白激酶基因AtGPK1的转基因应用

利用获得的AtGPK1突变体(gpk1-1，gpk1-2)、过表达植株(GPK1-OE)、功能恢复植株(GPK1-C)进行下面生理性状实验，分析AtGPK1在拟南芥或其他经济作物中在调控气孔运动及植物抗干旱方面的应用。

1，拟南芥气孔运动实验

外源ABA(脱落酸)抑制气孔开放(Opening)和促进气孔关闭(Closure)的实验。

Opening：

1)剪取生长四周的拟南芥莲座叶，放在Opening Buffer(10mM KCl，7.5mMiminodiacetic acid，10mM Mes-KOH，pH 6.15)中，下表皮接触Buffer，温室条件下避光处理；

2)2.5小时后，加ABA到Opening Buffer中，终浓度为0-50μM，继续黑暗处理10分钟后，室温光照培养(450mol.m^-2.s^-1)；

3)2.5小时后，撕取叶片下表皮，制作水压片，显微镜400放大倍数下拍照；

4)用统计软件ImageJ统计气孔开度。

Closure：

1)剪取生长四周的拟南芥莲座叶，放在Closure Buffer(20mM KCl，1mM CaCl₂，5mMMes-KOH，pH 6.15)中，下表皮接触Buffer，室温光照培养(450mol.m^-2.s^-1)；

2)2.5小时后，加ABA(脱落酸)到Closure Buffer中，终浓度为0-50μM，继续光照处理；

3)2.5小时后，撕取叶片下表皮，制作水压片，显微镜400放大倍数下拍照；

4)用统计软件ImageJ统计气孔开度。

气孔运动实验结果如图1所示，在ABA抑制气孔开放和促进气孔关闭过程中AtGPK1突变体(gpk1-1，gpk1-2)的气孔开度比野生型(Col-0)小，对ABA的作用过敏感；过表达(GPK1-OE)与突变体表型相反，ABA处理下气孔开度比野生型(Col-0)和空载体对照(EV)大，同时功能恢复植株(GPK1-C)使突变体过敏感的表型恢复。说明在植物气孔运动方面，AtGPK1具有很大的应用价值。

2，拟南芥离体叶片失水率实验

生长四周左右的植株，选取生长健壮的莲座叶，剪取，放在温室条件下进行失水实验，分别在0、30、60、120、180分钟称量叶片重量，按照下面公式计算叶片失水率：

叶片失水率％＝(0分钟重量-X分钟重量)/0分钟重量×100

离体叶片失水结果如图2所示，同样条件下，统计各转基因植株的离体叶片失水率。与野生型(Col-0)和空载体对照(EV)相比，AtGPK1过表达植株(GPK1-OE)失水快，而突变体植株(gpk1-1，gpk1-2)失水较慢，功能恢复植株(GPK1-C)和对照没有差异。

3，拟南芥植株干旱实验

生长3-4周的植株，充分浇水后，停止浇水。在温室干旱处理，植株开始萎蔫至死亡时进行复水，3天后观察植株存活状态。在干旱处理后和复水3天后分别拍照。

植株干旱实验结果如图3所示，干旱处理下，与野生型(Col-0)对比，AtGPK1突变体(gpk1-1，gpk1-2)抗干旱能力增强，过表达(GPK1-OE)与空载体对照(EV)相比抗干旱能力减弱，功能恢复植株(GPK1-C)与空载体对照(EV)没有差异。说明AtGPK1在植物抗干旱胁迫应答中起到重要的调节作用，在培育抗旱作物新品种方面有潜在的应用价值。

Claims (3)

1.拟南芥钙离子依赖蛋白激酶基因AtGPK1在调控气孔运动及植物抗干旱中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述植物是十字花科植物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述十字花科植物是芥菜、油菜、白菜或甘蓝。