CN110157718A - 一种来源于玉米的硝态氮调控基因ZmNRG2.7及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种来源于玉米的硝态氮调控基因ZmNRG2.7及其用途。该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2。该基因的表达受硝态氮的强烈诱导，利用该基因转入后的拟南芥与受体拟南芥相比，其响应硝态氮的能力增强、体内硝态氮积累量、硝态氮还原酶活性、氨基酸含量和全氮含量显著升高，能够明显提高植物的氮素利用率。

Description

一种来源于玉米的硝态氮调控基因ZmNRG2.7及其用途

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种来源于玉米的硝态氮调控基因ZmNRG2.7及其在提高硝态氮同化利用方面的用途。

背景技术

氮素是玉米生长发育中需求量最大的矿质元素之一，是构成其生命物质的主要成分，在玉米的生长发育中具有多种多样的功能。在玉米的生长发育过程中易存在感氮不足的现象，因此玉米也被称为“氮指示植物”，玉米缺氮时会表现出植株细弱，叶色发黄，发育延迟，产量下降等现象(于雷et al.,2011)。氮素是玉米光合效率最有效的调控因子之一，可以影响到光合叶面积的大小、光合持续时间的长短和叶片的衰老等方面。氮素是叶绿素、ATP、RuBP羧化酶、PEP羧化酶等的组成物质，并且能够使光合产物被作物利用(Evans,1983)。研究表明，玉米叶片的含氮量会影响自身的光合效率，在一定范围内增加氮肥的施用量可以提高玉米的光合效率，从而提高玉米的产量；而过量施用氮肥会使玉米的光合速率下降，对其生长发育造成负面影响(于雷et al.,2011)。此外，在弱光胁迫时增加氮肥的施用量可以提高玉米叶片中硝酸还原酶(NR)和谷氨酰胺合成酶(GS)的活性，增加干物质的积累量和最终产量(田锴,2008)。氮素能够提高玉米体内活性氧的清除能力，提高抗氧化代谢水平，增强抗逆能力。玉米体内的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)等保护酶的活性，明显受到氮素水平的影响(吴巍&赵军,2010)。研究表明，在玉米苗期施用适量的氮肥，能够有效地提高细胞中保护酶的活性，减少细胞中对生物体有害的活性氧的产生及积累，提高活性氧的清除能力，从而能够延缓叶片的衰老和光合功能的衰退，提高玉米的籽粒产量(于雷et al.,2011)。氮素还会影响玉米对水分的利用，从而间接影响玉米的器官建成。氮素能够与土壤中的水分互作并合理搭配，调节植物营养生长与生殖生长之间的关系，提高产量。另外，氮肥用量影响玉米生物量、氮含量及水分利用效率，对玉米良好冠盖度的形成具有促进作用，可以减少玉米的蒸腾作用，从而提高玉米对水分的利用率，增强玉米的抗旱性(刘秀珍et al.,1994；李琪,2007)。氮素可以影响玉米中内源激素的水平。研究表明，玉米中局部NO₃ ^-对侧根生长的影响依赖于生长素地上部向地下部的转运；施用NO₃ ^-减少玉米中生长素从地上部向地下部的转运，减少了根中生长素的浓度，从而使侧根生长维持在一个正常的水平(Liu et al.,2010)。一氧化氮(NO)作为信号分子可以调节植物的生长发育进程，是脱落酸(ABA)诱导气孔关闭的重要因素，在NO₃ ^-响应的初级阶段NR可以产生并维持NO的稳定；玉米中内源NO含量的下降导致了高浓度NO₃ ^-抑制玉米根尖细胞的伸长(Zhao et al.,2007；Manoli et al.,2014)。另外，增施氮肥可以通过促进玉米叶片中玉米素核苷(ZR)、二氢玉米素腺苷(DHZR)和异戊烯基腺苷(iPA)的积累，抑制ABA在叶片中的积累，从而抑制玉米叶片的衰老(李文娟,2012)。

大多数陆生作物如玉米、小麦等都是以吸收硝态氮为主。植物主要通过NRT1和NRT2两个硝态氮转运蛋白家族从外界吸收硝态氮并在体内对硝态氮进行转运分配。近年来的研究发现CLC和SLAC两个蛋白家族在硝态氮的转运和存储中也发挥重要的作用(Krappet al.,2010,J Exp Bot 65,789-798)。吸收进入植物体内的硝态氮在硝态氮还原酶(NR)、亚硝态氮还原酶(NiR)的作用下被还原为铵，而铵经由GS-GOGAT途径被还原为有机氮，直接被植物利用维持植物正常的生长发育。硝态氮不仅是植物生长发育所需的营养物质，同时也是重要的信号分子，调控植物体内基因的表达及各个生物进程。硝态氮信号可以被分成两种类型：短期效应和长期效应。短期效应是指植物对硝态氮的初级响应，植物经硝态氮处理后，一些基因的表达会在短期内发生改变如NIA1、NiR、NRT1.1、NRT2.1等。长期效应是指硝态氮处理较长时间后，对植物生长发育产生的影响，包括种子萌发、根的形态建成、植物开花、气孔运动等。目前已鉴定出多个调控硝态氮信号的基因，如硝态氮感应子NRT1.1、转录因子NLP7、TGA1/4、TCP20、可变剪切因子CPSF30、FIP1、蛋白激酶CIPK8、CIPK23等。

在农业生产中，为了维持作物的高产，大量的氮肥施用到土壤中，但是作物对氮肥的利用效率是有限的。因此，大量的氮素会流失到环境中，造成土壤酸性化、水体富营养化、空气污染等一系列环境问题，影响人类的生存与发展。提高作物的氮素利用效率是解决这些问题的关键。作为世界上四大粮食作物之一，玉米需氮量很高，但目前为止玉米中关于NO₃ ^-调控基因的研究尚未见报道。因此，研究植物对氮素吸收机理对提高玉米对氮素的利用率、农业的持续发展有重要的意义。

发明内容

本发明研究发现，过表达ZmNRG2.7能促进植物对硝态氮信号的初级响应且能提高植物对硝态氮的同化利用效率，由此提出了本发明。

本发明的第一方面，提供一种来源于玉米的硝态氮调控基因，命名为ZmNRG2.7，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

进一步的，本发明还提供用于扩增上述ZmNRG2.7的引物对，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

含有上述ZmNRG2.7基因的植物表达载体和/或重组菌也是本发明的保护范围。

本发明的第二方面，提供ZmNRG2.7基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第三方面，提供上述ZmNRG2.7基因、ZmNRG2.7基因编码的蛋白、植物表达载体或重组菌在如下a)-f)至少一项中的用途：

a)增强植物体内硝态氮还原酶的活性；

b)增加植物体内氨基酸的含量；

c)增加植物体内全氮的含量；

d)提高植物体内响应硝态氮的基因的表达水平；

e)促进植物对硝态氮信号的初级响应；

f)提高植物对硝态氮的同化利用效率。

优选的，上述d)中，所述植物体内响应硝态氮的基因包括：基因NIA1、NIR和NRT2.1。

本发明的第四方面，提供一种提高植物对氮素利用率的方法，包括：将ZmNRG2.7基因或者含有上述ZmNRG2.7基因的植物表达载体和/或重组菌导入目标植物或植物组织，并使ZmNRG2.7基因过表达。

本发明的第五方面，提供上述ZmNRG2.7、植物表达载体或重组菌在植物育种中的用途。

所述植物育种为培育高氮效作物品种。

本发明的第六方面，提供一种高氮效作物品种的培育方法，所述培育方法包括：将ZmNRG2.7基因转入出发植株中，获得高氮效作物；或者上调出发植株基因组中ZmNRG2.7基因的表达，筛选得到氮利用率提高的植株。

优选的，将ZmNRG2.7基因转入出发植株中的方法包括：聚乙二醇法、农杆菌介导法或基因枪轰击法。

本发明的第七方面，提供如下任一物质在提高植物主根长度和侧根数目中的应用：

(1)SEQ ID NO.2所示的蛋白；

(2)SEQ ID NO.2所示蛋白的编码基因；

(3)含有(2)所述编码基因的植物表达载体、转基因细胞系或重组菌。

本发明的第八方面，提供如下任一物质在提高植株鲜重和干重中的应用：

(1)SEQ ID NO.2所示的蛋白；

(2)SEQ ID NO.2所示蛋白的编码基因；

(3)含有(2)所述编码基因的植物表达载体、转基因细胞系或重组菌。

本发明的有益效果：

本发明首次发现了ZmNRG2.7在硝态氮信号及代谢中发挥重要的作用，为提高作物的氮素利用率、培育高氮效作物新品种提供了新的思路与方向。

附图说明

图1：荧光互补表型观察。

图2：NO₃ ^-处理后，转基因株系中硝态氮响应基因表达量的检测。将WT、nrg2-2、ZmNRG2.7/nrg2-2-1(C1)、ZmNRG2.7/nrg2-2-7(C7)在只有NH₄ ⁺为氮源的培养基上生长7天后，分别用10mM KNO₃和10mM KCl(作为对照)处理2小时，取根并提取RNA用于qPCR检测，其中WT：野生型，nrg2-2：NRG2的T-DNA插入突变体，ZmNRG2.7/nrg2-2-1、ZmNRG2.7/nrg2-2-7：ZmNRG2.7在突变体的转基因株系。

图3-图6：ZmNRG2.7过表达对NO₃ ^-同化利用的调控。WT、nrg2-2、ZmNRG2.7/nrg2-2-1(C1)、ZmNRG2.7/nrg2-2-7(C7)在1/2MS培养基上生长7天，取全苗用于相关实验的检测。(图3-图6)ZmNRG2.7过表达株系中NO₃ ^-含量(图3)、硝态氮还原酶(NR)活性(图4)、氨基酸含量(图5)的检测；全氮含量(图6)的检测。其中WT：野生型，nrg2-2：NRG2的T-DNA插入突变体，ZmNRG2.7/nrg2-2-1、ZmNRG2.7/nrg2-2-7：ZmNRG2.7在突变体的转基因株系。

图7-图12：ZmNRG2.7过表达株系提高氮素利用率的研究。WT、nrg2-2、ZmNRG2.7/nrg2-2-1(C1)、ZmNRG2.7/nrg2-2-7(C7)分别在0.2mM、5mM和10mM KNO₃培养基上水平、竖直生长10d，观察表型(图7-图8)，统计主根长度(图9)、侧根数目(图10)、鲜重(图11)和干重(图12)。

ZmNRG2.7/nrg2-2-1(C1)和ZmNRG2.7/nrg2-2-7(C7)都是ZmNRG2.7在nrg2-2中的过表达株系，只是不同的转化事件形成的不同株系，其中存在ZmNRG2.7过表达倍数上的差异。采用两个不同株系主要是为了排除我们看到的硝态氮利用指标的变化并不是由于插入位点导致的。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

术语说明：

硝态氮调控基因：发挥硝态氮信号调控作用的上游基因，可以调控包括响应基因在内的多个硝态氮利用基因的功能。

硝态氮响应基因：受硝态氮处理后能够发生转录水平变化的一些较下游的基因。

正如背景技术部分所介绍的，玉米硝态氮信号及代谢方面研究还没有报道。基于此，本发明在ZmNRG2.7调控硝态氮信号及代谢方面进行了深入研究。

本发明利用生物信息学的方法找到了玉米中ZmNRG2家族23个基因，根据其在染色体上的定位进行了命名；对玉米NRG2家族进行了进化分析，发现有2个保守的结构域DUF630和DUF632。目前对于玉米ZmNRG2家族中23个基因的功能尚不清楚，我们在拟南芥中的前期研究结果显示，拟南芥NRG2家族中15个成员中并不是所有基因都存在硝态氮调控的功能。所以我们推测NRG2家族并不是所有基因都是调控基因；加之拟南芥中的信号通路本就不清楚，并且其与玉米中的调控方式存在差异，玉米NRG2家族的基因具有什么样的功能更是不得而知。为深入研究玉米NRG2家族的基因功能，我们选取了ZmNRG2.7进行了克隆，并转化了拟南芥的nrg2-2突变体。

本发明利用qPCR技术检测了ZmNRG2.7在拟南芥野生型、突变体和转基因株系中的NO₃ ^-诱导量，实验结果表明ZmNRG2.7表达直接受NO₃ ^-的诱导。

为研究ZmNRG2.7在硝态氮信号及利用方面的功能，发明人首先利用PCR技术克隆了该ZmNRG2.7的基因片段，以生长至三叶期的玉米野生型B73基因组为模板，利用下述引物扩增ZmNRG2.7的基因片段：

上游引物：5’-TTTACTAGTATGGGTTGCTCCAACTCTAAAGT-3’，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；

下游引物：5’-TTTGGTACCCGAGGAAATAGCAGGTGAAGCT-3’，其核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。

在获得上述ZmNRG2.7之后发明人将其转入受体植物拟南芥中，获得ZmNRG2.7过量表达的转基因株系。在1/2MS培养基上培养转入ZmNRG2.7基因的拟南芥和受体拟南芥，并检测两种植物对硝态氮的吸收利用，结果发现过表达ZmNRG2.7基因能够明显增强硝态氮还原酶的活性、增加植物体内氨基酸的含量、全氮的含量。发明人还发现经硝态氮处理后，转入ZmNRG2.7基因的拟南芥植株体内响应硝态氮的相关基因表达量显著升高，促进了植物对硝态氮的初级响应。

综上，本发明克隆出玉米中一个新的硝态氮调控基因，并将其命名为ZmNRG2.7，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该基因的表达受硝态氮的强烈诱导；利用该基因转入后的拟南芥与受体拟南芥相比，其体内硝态氮含量升高、硝酸盐还原酶活性、氨基酸含量和全氮含量显著升高；经硝态氮处理后，其体内响应硝态氮的基因的表达水平明显升高。结果表明，过表达ZmNRG2.7能促进植物对硝态氮信号的初级响应且能提高植物对硝态氮的同化利用效率，由此提出了本发明。

由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO.1所示多核苷酸的变体，只要其与该核苷酸具有90％以上同源性，且具有相同的功能，则均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以是包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。

基于本发明的ZmNRG2.7的性能，可以用于提高植物对氮素的利用率。在本发明的一种实施方案中，给出了提高植物对氮素利用率的方法，包括下列步骤：

(1)获得玉米ZmNRG2.7的核苷酸序列；

(2)用PCR技术获得ZmNRG2.7基因的片段，并将其连接至植物表达载体上；

(3)将带有目的基因质粒的农杆菌转入目标植物，获得ZmNRG2.7过表达的植物。

综上所述，本发明所提供的ZmNRG2.7的表达受NO₃ ^-的强烈诱导，在植株体内过表达该ZmNRG2.7能增强植物对硝态氮的初级响应，促进植物对硝态氮的同化利用。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

实施例1：荧光互补实验

荧光互补实验是鉴定某基因是否是硝态氮调控基因的重要手段，为确定ZmNRG2.7是否为硝态氮的调控基因，本发明筛选出ZmNRG2.7/nrg2-3的纯合转基因株系，其中nrg2-3是经EMS诱变筛选得到的突变体，在5mM KNO₃固体培养基上生长5天，观察荧光(图1)。

由于AtNRG2基因突变，导致其体内受硝态氮信号诱导的黄色荧光蛋白荧光量显著下降，故nrg2-3显示出弱荧光的表型。当我们将ZmNRG2.7基因转化到nrg2-3中时，其转化纯合株系中受硝态氮信号诱导的黄色荧光蛋白荧光量恢复至系统野生型水平(图1)，说明ZmNRG2.7可以发挥硝态氮信号调控的作用，其是硝态氮调控基因。

5mM KNO₃培养基配方：

实施例2：ZmNRG2.7植物表达载体的构建

将正常生长至三叶期的玉米幼苗野生型B73在1/2MS培养基上生长7天，取全苗并提取基因组DNA。以提取的DNA为模板，利用高保真DNA聚合酶扩增ZmNRG2.7的基因片段，PCR所用的引物序列为：

上游引物：5’-TTTACTAGTATGGGTTGCTCCAACTCTAAAGT-3’，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；

下游引物：5’-TTTGGTACCCGAGGAAATAGCAGGTGAAGCT-3’，其核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。将PCR产物在1％的琼脂糖中进行电泳，根据DNA Marker找到目的条带并将此胶块切下。利用胶回收试剂盒(购自Omega公司)回收目的DNA，对回收的目的DNA及植物表达载体1300进行酶切(SpeI和KpnI)，然后将酶切的DNA片段和载体用T₄DNA连接酶连接。随后利用热激法将连接产物转化至大肠杆菌Mach1感受态中，于37℃摇床，230rpm震荡培养1小时，将摇好的菌液涂布于含K⁺抗性的LB平板上，37℃倒置培养12小时。通过菌落PCR技术筛选成功转入重组载体的阳性克隆，挑取阳性克隆的菌体于5mL LB培养液中培养并提取质粒用于测序。将测序结果与ZmNRG2.7的序列进行比对，确认无误后将该质粒转化至农杆菌GV3101感受态中，放置于28℃摇床，230rpm震荡培养3小时，将菌液均匀地涂布于含K⁺抗性的LB平板上，28℃倒置培养36小时。菌落PCR鉴定成功转入重组质粒的农杆菌并将菌种在-80℃中保存。

1/2MS培养基配方：

注：定容后，用KOH调pH值为5.7。

LB液体培养基配方：

实施例3：转基因阳性植株的鉴定

挑取-80℃保存的农杆菌菌体于250mL LB培养液中，放置于28℃摇床，震荡培养16小时。利用浸花法将农杆菌侵染至拟南芥野生型植株。待植株成熟后，收取种子，并将种子铺在含H⁺抗性的1/2MS平皿上，筛选阳性苗即转基因株系T1代。将筛选的T1代种子移植至蛭石中培养，收获T2代种子。将T2代种子在含H⁺抗性的1/2MS平皿上培养，发现其存活率为3/4，将存活的T2植株移至蛭石中培养，单株收获T3代种子。将T3代种子在含H⁺抗性的1/2MS平皿上培养，筛选纯合的转基因株系并移至蛭石中扩繁。

实施例4：ZmNRG2.7转基因植株的功能鉴定

利用RT-PCR技术检测上述实验获得的纯合转基因株系中ZmNRG2.7的表达量，获得ZmNRG2.7过表达的转基因株系。首先利用qPCR技术检测了ZmNRG2.7过表达株系在NO₃ ^-处理后，检测硝态氮响应基因NIA1、NIR、NRT2.1的表达，发现这些基因的NO₃ ^-诱导量在ZmNRG2.7过表达株系中明显增加(图2)。同时对转基因株系的硝态氮含量、硝酸还原酶活性、氨基酸含量以及全氮含量进行检测(图3-图6)，结果发现，ZmNRG2.7过表达株系中硝态氮含量、NR活性、氨基酸含量和全氮含量升高。以上这些实验结果表明ZmNRG2.7能促进植物对硝态氮的响应及同化。

实施例5：ZmNRG2.7转基因植株提高氮素利用率的研究

ZmNRG2.7过表达株系提高氮素利用率的研究。将WT、nrg2-2、ZmNRG2.7/nrg2-2-1、ZmNRG2.7/nrg2-2-7分别在0.2mM、5mM和10mM KNO₃培养基上水平、竖直生长10d，观察表型(图7-图8)，统计主根长度(图9)、侧根数目(图10)、鲜重(图11)和干重(图12)，结果发现ZmNRG2.7能促进植物对氮素的利用率。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 一种来源于玉米的硝态氮调控基因ZmNRG2.7及其用途

<130> 2019

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2106

<212> DNA

<213> 玉米（Zea mays）

<400> 1

atgggttgct ccaactctaa agtggacaat gaggagcctg tgaggcgctc caaggacagg 60

aggcagctca tgaagcagct ggtgcgccgc cgccctgagc ttgcagctgt gcacattgcg 120

tacctgcacg ccctccgtaa cacaggagcc actctccggc aatttgtgga gctggagtct 180

gcattgtcac agcagcctcc cgtagacctt gtggtgccgc cctcgcctac tccacagcct 240

cctcctcctc ctcctcctga actctcggtg acatcctcat tgccaccctc gccatgcccc 300

ccgccgcctg tcccttttag tccagtaaca accataagaa agatggagaa gagggatggt 360

gagctcccac caccaccacc acctctggtt ttgagtccga taagattaag gaagatggag 420

gatgagttcc atgggggtga ttttactgat gatgacgaca ctgacagctg ctcgactcct 480

ctaccaccac ccctgccacc cggcatagat tgggaggact tggatcccta caatgtgtgc 540

cccttgagtt tcccatctcc atttgctgat aggaatgata aagaagtggc ctcgcatgtg 600

accatggaca atgatcctga agtagacaca gaattttatg gagaggagga tgaaagcatg 660

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ctgggtgatg gcaactcttc aacggtgagc tgggtgacaa aggattcaga ctctatggcg 780

gtgccttgga ggagtaagaa gtcgcttgta gagattgtta aggagattga tgagtacttc 840

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tatgacgagg aacaaaaact ctacaagtta atcaaggatg aagaatttgc aaggctccag 1140

tataagaaac atgtctcagt gctacaaaag ctggaatcag gagggcatga tagactgcat 1200

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acaagtgaca ctcatcgcca ggcaacatct cagctggaaa ttgaggtgtc tggatggcac 1500

actgccttct gcaatcttat cacatcgcag cgtgaatacg ttagcatcct tagccaatgg 1560

attggtctca cagactgcct tccggatgat ggtggcttaa tgagaagttc atctggaatc 1620

cttagcctct ctgaggaact ccagcgtgct cttgacaggc taccagagaa ggtagcagct 1680

gaagcgataa agacctttat gtcagtcata cactctatag ttgtacagca aagtgaagag 1740

cgccaactaa agaagaagtc agataacatg gatagcaagt tccagaccca gttagagaaa 1800

cacagtgaaa atacaatgca aaactcggcc cagcctccaa ataagaataa ctattcagca 1860

tcaaagaatg gaacgaaact ggatgcattt ataaagcagg tcgaggagga gaaagccaga 1920

tacctaacct ctgtgagggt aagccgagcc atgacactga acagtctgca gacaagcctt 1980

cgaaatgtgt tccatgctct ggagggattc tcaggagtgt gcgtacaggc atttgaaggt 2040

atcagcagat gcagtgaagt tgctgttatt cactcgggag cagcttcacc tgctatttcc 2100

tcgtga 2106

<210> 2

<211> 701

<212> PRT

<213> 玉米（Zea mays）

<400> 2

Met Gly Cys Ser Asn Ser Lys Val Asp Asn Glu Glu Pro Val Arg Arg Ser Lys Asp Arg

1 5 10 15 20

Arg Gln Leu Met Lys Gln Leu Val Arg Arg Arg Pro Glu Leu Ala Ala Val His Ile Ala

25 30 35 40

Tyr Leu His Ala Leu Arg Asn Thr Gly Ala Thr Leu Arg Gln Phe Val Glu Leu Glu Ser

45 50 55 60

Ala Leu Ser Gln Gln Pro Pro Val Asp Leu Val Val Pro Pro Ser Pro Thr Pro Gln Pro

65 70 75 80

Pro Pro Pro Pro Pro Pro Glu Leu Ser Val Thr Ser Ser Leu Pro Pro Ser Pro Cys Pro

85 90 95 100

Pro Pro Pro Val Pro Phe Ser Pro Val Thr Thr Ile Arg Lys Met Glu Lys Arg Asp Gly

105 110 115 120

Glu Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Val Leu Ser Pro Ile Arg Leu Arg Lys Met Glu

125 130 135 140

Asp Glu Phe His Gly Gly Asp Phe Thr Asp Asp Asp Asp Thr Asp Ser Cys Ser Thr Pro

145 150 155 160

Leu Pro Pro Pro Leu Pro Pro Gly Ile Asp Trp Glu Asp Leu Asp Pro Tyr Asn Val Cys

165 170 175 180

Pro Leu Ser Phe Pro Ser Pro Phe Ala Asp Arg Asn Asp Lys Glu Val Ala Ser His Val

185 190 195 200

Thr Met Asp Asn Asp Pro Glu Val Asp Thr Glu Phe Tyr Gly Glu Glu Asp Glu Ser Met

205 210 215 220

Leu Gly Asn Asn Asp Val Ile Val Asp Arg Val His Val Asn Pro Ala Lys Gly Arg Ala

225 230 235 240

Leu Gly Asp Gly Asn Ser Ser Thr Val Ser Trp Val Thr Lys Asp Ser Asp Ser Met Ala

245 250 255 260

Val Pro Trp Arg Ser Lys Lys Ser Leu Val Glu Ile Val Lys Glu Ile Asp Glu Tyr Phe

265 270 275 280

Leu Lys Ala Ala Ala Ser Gly Asn Asp Val Val Ile Phe Leu Asp Ser Ala Gly Gly Arg

285 290 295 300

Pro Asp Ala Leu Glu Val Glu Ala Lys Lys Gly Ala Gly Lys Asn Ser Lys Pro Ala Lys

305 310 315 320

Val Phe Ser Thr Leu Ser Trp Ser Trp Ser Phe Lys Ser Gln Gln Ala Ser Arg Glu Ala

325 330 335 340

Ser Val Leu Asn Ser Ser Ala Ser Gly Tyr Gly Tyr His Gly Lys Thr Leu Glu Lys Leu

345 350 355 360

Tyr Asp Glu Glu Gln Lys Leu Tyr Lys Leu Ile Lys Asp Glu Glu Phe Ala Arg Leu Gln

365 370 375 380

Tyr Lys Lys His Val Ser Val Leu Gln Lys Leu Glu Ser Gly Gly His Asp Arg Leu His

385 390 395 400

Ala Glu Arg Leu Arg Asp Ser Ile Glu Glu Leu Gln Thr Arg Ile Ile Ser Leu Glu Glu

405 410 415 420

Ala Val Ser Leu Ala Cys Phe Ser Ile Ser Asn Leu Arg Asp Glu Glu Leu Tyr Pro Gln

425 430 435 440

Ile Ile Glu Leu Ser Ala Gly Leu Val His Met Trp Lys Asn Met His Glu Cys His Gln

445 450 455 460

Val Gln Asn His Ile Ala Gln Gln Val Ser Leu Leu Gly Asn Arg Pro Gly Ser Glu Pro

465 470 475 480

Thr Ser Asp Thr His Arg Gln Ala Thr Ser Gln Leu Glu Ile Glu Val Ser Gly Trp His

485 490 495 500

Thr Ala Phe Cys Asn Leu Ile Thr Ser Gln Arg Glu Tyr Val Ser Ile Leu Ser Gln Trp

505 510 515 520

Ile Gly Leu Thr Asp Cys Leu Pro Asp Asp Gly Gly Leu Met Arg Ser Ser Ser Gly Ile

525 530 535 540

Leu Ser Leu Ser Glu Glu Leu Gln Arg Ala Leu Asp Arg Leu Pro Glu Lys Val Ala Ala

545 550 555 560

Glu Ala Ile Lys Thr Phe Met Ser Val Ile His Ser Ile Val Val Gln Gln Ser Glu Glu

565 570 575 580

Arg Gln Leu Lys Lys Lys Ser Asp Asn Met Asp Ser Lys Phe Gln Thr Gln Leu Glu Lys

585 590 595 600

His Ser Glu Asn Thr Met Gln Asn Ser Ala Gln Pro Pro Asn Lys Asn Asn Tyr Ser Ala

605 610 615 620

Ser Lys Asn Gly Thr Lys Leu Asp Ala Phe Ile Lys Gln Val Glu Glu Glu Lys Ala Arg

625 630 635 640

Tyr Leu Thr Ser Val Arg Val Ser Arg Ala Met Thr Leu Asn Ser Leu Gln Thr Ser Leu

645 650 655 660

Arg Asn Val Phe His Ala Leu Glu Gly Phe Ser Gly Val Cys Val Gln Ala Phe Glu Gly

665 670 675 680

Ile Ser Arg Cys Ser Glu Val Ala Val Ile His Ser Gly Ala Ala Ser Pro Ala Ile Ser

685 690 695 700

Ser*

701

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tttactagta tgggttgctc caactctaaa gt 32

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tttggtaccc gaggaaatag caggtgaagc t 31

Claims (10)

1.一种来源于玉米的硝态氮调控基因，命名为ZmNRG2.7，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的ZmNRG2.7基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求1所述的ZmNRG2.7基因的植物表达载体和/或重组菌。

4.权利要求1所述的ZmNRG2.7基因、权利要求2所述的蛋白或权利要求3所述的植物表达载体和/或重组菌在如下a)-f)至少一项中的用途：

a)增强植物体内硝态氮还原酶的活性；

b)增加植物体内氨基酸的含量；

c)增加植物体内全氮的含量；

d)提高植物体内响应硝态氮的基因的表达水平；

e)促进植物对硝态氮信号的初级响应；

f)提高植物对硝态氮的同化利用效率。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，上述d)中，所述植物体内响应硝态氮的基因包括：基因NIA1、NIR和NRT2.1。

6.一种提高植物对氮素利用率的方法，其特征在于，包括：将权利要求1所述的ZmNRG2.7基因或者权利要求3所述的植物表达载体和/或重组菌导入目标植物或植物组织，并使ZmNRG2.7基因过表达。

7.权利要求1所述的ZmNRG2.7基因或者权利要求3所述的植物表达载体和/或重组菌在植物育种中的用途；

优选的，所述植物育种为培育高氮效作物品种。

8.一种高氮效作物品种的培育方法，其特征在于，所述培育方法包括：将权利要求1所述的ZmNRG2.7基因转入出发植株中，获得高氮效作物；或者上调出发植株基因组中ZmNRG2.7基因的表达，筛选得到氮利用率提高的植株。

9.如下任一物质在提高植物主根长度和侧根数目中的应用：

(1)SEQ ID NO.2所示的蛋白；

(2)SEQ ID NO.2所示蛋白的编码基因；

(3)含有(2)所述编码基因的植物表达载体、转基因细胞系或重组菌。

10.如下任一物质在提高植株鲜重和干重中的应用：

(1)SEQ ID NO.2所示的蛋白；

(2)SEQ ID NO.2所示蛋白的编码基因；

(3)含有(2)所述编码基因的植物表达载体、转基因细胞系或重组菌。