CN102002100A

CN102002100A - 拟南芥tcp家族转录因子及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN102002100A
Application number: CN 201010519942
Authority: CN
Inventors: 蒯本科; 王晓彦; 魏强; 余进; 梁宁菁
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2010-10-26
Filing date: 2010-10-26
Publication date: 2011-04-06

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体为一种拟南芥TCP家族转录因子及其编码基因与应用。本发明所提供的TCP8蛋白，来源于拟南芥，名称为AtTCP8,其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。拟南芥TCP8转录因子的编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO:1所示序列，或者为编码SEQIDNO：2氨基酸序列的多核苷酸序列。本发明的基因可用于拟南芥调控开花分子机制的研究，并可用于调控植物开花进程。

Description

拟南芥TCP家族转录因子及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种拟南芥TCP家族转录因子及其编码基因与应用。

背景技术

开花是高等植物从营养生长向生殖生长转化的重要发育阶段，这一过程是受植物内部发育信号与外界环境共同决定的，它不仅是植物个体发育过程中极其重要的一个环节，对于物种的繁衍与进化也同样至关重要。对于农业生产，农作物开花时间的适宜性与一致性直接影响到农产品的产量与质量。过早、过晚的开花或者雌雄花期不遇都将导致农业生产的减产，同时花期不遇也对制种过程中种子质量的保障构成巨大的威胁。另外，植物开花的调控对园林花卉生产也有着重要的意义。因此，从模式植物拟南芥入手，了解调控植物开花的分子机制，获得宝贵的基因资源；培育具有合适花期的农作物及调控植物的开花具有重要的现实和战略意义。

通过对模式植物拟南芥的生理学与遗传学研究，目前认为调控拟南芥开花至少存在四个途径：光周期途径、赤霉素途径、自主途径和春化作用途径。这四条途径相对独立却又相互差错，许多基因间存在调控与反馈关系，如促进开花的整合子SOCI和FT，都同时受到多条途径的调控。这些交错最终形成复杂的网络，使得植物能综合内部发育与外界环境信号，实现对开花时间的精密调控（曾群等，遗传，28（8）：1031-1036,2006）。

TCP家族转录因子是植物古老而特有的转录因子家族，然而对它的认识研究却刚刚起步。1999年，Cubes根据玉米基因TB1、金鱼草基因CYC和水稻基因PCFs所拥有共同的保守domain，第一次提出TCP家族的概念。早期的研究发现TCP家族基因广泛参与调控植物的生长发育，如TB1参与抑制侧芽伸长；CYC参与花的对称性建立；PCF亚家族在分生组织调控细胞周期中有重要作用（雷娟等，分子植物育种，2005年，第3卷，第1期，第31-35页）。对拟南芥基因组分析显示拟南芥共有24个潜在的TCP家族转录因子，可分为TCP-C和TCP-P两个亚家族。近年来随着研究的深入，人们对TCP家族的作用有了更多的认识，如AtTCP1可以调控油菜素内酯的合成；AtTCP4可以调控甲基茉莉酸的合成；AtTCP14在种子胚的萌发过程中有重要作用。

目前对AtTCP8的研究基本上是一片空白，对于TCP家族调控植物开花的研究也为数不多，大多仅停留在生理观察阶段，人们对其遗传和分子机制也几乎一无所知。因此借助拟南芥模式生物，挖掘TCP家族中调控开花的重要基因资源，并应用到农作物性状改良上具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种拟南芥TCP家族转录因子AtTCP8及其编码基因，并提供该编码基因的应用。

本发明所提供的拟南芥TCP家族转录因子AtTCP8，是具有SEQ ID NO. 2所示氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID NO. 2所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加具有与SEQ ID NO. 2所示的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID NO. 2衍生的蛋白质。

拟南芥TCP家族转录因子AtTCP8的编码基因，是下列核苷酸之一：

1）SEQ ID NO.1 所示的DNA序列；

2）编码SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列的多核苷酸。

SEQ ID NO.1由1630个碱基组成，该基因的读码框为自5’端第129位至1334位碱基；SEQ ID NO.2由401个氨基酸残基组成。

本发明还包括上述基因的表达载体和细胞系。

本发明的基因可用于拟南芥调控开花分子机制的研究，并用于调控植物开花进程。

附图说明

图1为AtTCP8全长扩增产物凝胶电泳图谱。

图2 为AtTCP8和部分拟南芥TCP家族转录因子TCP domain同源性分析。

图3 为AtTCP8和其它拟南芥TCP家族转录因子系统发生树。

图4为长日照生长45天野生型拟南芥和转基因植株抽苔表型。

图5为野生型拟南芥和转基因株系AtTCP8表达水平检测。

图6为抽苔达2cm时野生型拟南芥和转基因植株莲座叶片数统计。

具体实施方式

实施例1、拟南芥TCP家族转录因子AtTCP8编码基因的获得。

1.1 拟南芥材料准备

取在16h L/8h D光照, 23℃条件下培养30天拟南芥Col-0的花分生组织、花序分生组织和幼嫩的花苞。

1.2 RNA提取

取拟南芥材料约0.1g。液氮充分研磨后，转移到1.5ml离心管，加1ml

Figure 2010105199422100002DEST_PATH_IMAGE001

( invitrogen公司 )，混匀后，室温放置15分钟，加0.2ml氯仿:异戊醇（24:1），剧烈摇动15秒后室温放置5分钟，13000rpm, 4℃离心15分钟。取上清液并加入等体积异丙醇，小心混匀，室温放置15分钟，13000rpm，4℃离心15分钟。70％乙醇洗涤沉淀，室温干燥15分钟。溶解于适量的经0.1% DEPC处理过的ddH₂O水中，贮存于-80℃备用。

1.3 cDNA第一链合成和反转录PCR

采用上海申能博彩生物技术公司(SHBC)的cDNA第一链合成试剂盒，按照操作指南将总RNA反转录成cDNA。反应体系和反应条件分别为：2μg制备的总RNA，0.5μl Rnase inhibitor，加DEPC处理过的去离子水至8.5μl, 2μl的Oligo(dT)18 primer. 65℃,5min,室温放置10min， 13000rpm 简短离心5s。再依次加入4μl 5×First-Strand buffer，0.5μl RNase Inhibitor，2μl 100mM DTT, 2μl dNTP, 1μl MMLV Reverse Transcriptase。小心混匀；37℃反转录1小时，90℃5分钟；冰上冷却；13000rpm 短暂离心5秒钟，存放于-20℃待用。

1.4 AtTCP8全序列的获得

根据TAIR（http://www.arabidopsis.org/）上提供的AtTCP8全长CDS序列，设计了两条引物AtTCP8OE-S（5' ATAGAGCTCATGGATCTCTCCGACATCCGAAACA 3'）和AtTCP8OE-A：（5' ATACTGCAGTCACTCAGAGCTATTTGAGTTCTCC 3'）（SEQ ID NO.3）作为PCR反应的引物。PCR 反应体系为50μl，反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性40s，55℃复性40s，72℃延伸70s，循环38次。72℃充分延伸5min。将所得的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离获得一段约1200bp的片断，如图1所示。回收并且通过TA克隆至TAKARA pMD-19-T载体后，由上海英骏公司测序，获得AtTCP8全序列，获得的全序列和TAIR上公布的序列完全一致。

实施例2：拟南芥TCP家族转录因子AtTCP8功能分析。

2.1序列比较分析

用Genedoc软件分析了AtTCP8与其他拟南芥TCP家族蛋白的同源性。分析结果表明AtTCP8具有典型保守的TCP domain，如图2所示，图中显示的是TCP domain，加黑部分是一致性的氨基酸序列。使用MEGA软件建立了AtTCP8同其他拟南芥TCP家族蛋白的系统进化树，结果表明AtTCP8属于TCP-P亚家族，与AtTCP22、AtTCP23亲缘关系最近，如图3所示。在水稻、玉米等植物中也有和AtTCP8同源性较高基因，如OsTCP21就和AtTCP8有很大的同源性。

2.2 拟南芥转基因分析。

2.2.1植物表达载体构建

利用引物AtTCP8OE-S和 AtTCP8OE-A扩增出全长CDS，并克隆至pMD19-T vector(Takara)，测序无误之后。使用SacI和PstI双酶切，回收纯化目的片断，并连接到经过同样两个酶酶切，纯化的pCHF3载体上。

AtTCP8OE-S： 5' ATAGAGCTCATGGATCTCTCCGACATCCGAAACA 3'

AtTCP8OE-A： 5' ATACTGCAGTCACTCAGAGCTATTTGAGTTCTCC 3'（SEQ ID NO.4）

2.2.2农杆菌转化。

2.2.2.1GV3101农杆菌感受态细胞制备

1) 在含利福霉素20μg/ml, 庆大霉素20μg/ml 的YEB固体培养基上划线， 28℃培养48h-72h；

2) 挑单菌落到含利福霉素20μg/ml, 庆大霉素20μg/ml 的YEB液体培养基中28℃培养至OD₆₀₀0.5；

3) 冰上冷却菌液，5000rpm, 4℃ 10分钟收集菌体；

4) 1mM Hepes pH 7.0洗涤3次，再用10％甘油洗涤一次；

5) 悬浮菌体于3ml 10％甘油中，分装到1.5ml离心管中，每管40μl。

2.2.2农杆菌转化

1）200ng质粒DNA，加100μl农杆菌感受态细胞混匀后按以下条件进行热激转化。

冰上放置5分钟，液氮中放置5分钟，37℃水浴5分钟，冰上放置5分钟；

2）热激后添加800μl SOC液体培养基，28℃ 培养1h；

3) 4000rpm， 10分钟收集菌体，悬浮于200μl SOC中，涂在含100μg/ml壮观霉素，利福平20μg/ml, 庆大霉素20μg/ml YEB固体培养基上，28℃倒置培养48h-72h。

2.2.3农杆菌介导的拟南芥转化。

2.2.3.1 拟南芥基质培养:

基质组分：蛭石：黑土：珍珠岩 9 : 3 : 0.5

营养液组分：

。

基质浸透营养液后，将种子播于钵子中，用保鲜膜覆盖，置于4℃黑暗条件下，2天后转入（16h L/8h D）光照, 23℃条件下进行培养。拟南芥生长到抽苔开花即可供转化。

2.2.3.2农杆菌准备

1) 接种携带目的表达载体的农杆菌到含适量抗生素的YEB培养基中，28℃，220rpm摇菌培养至OD₆₀₀1.2；

2) 5000rpm, 4℃ 10分钟离心收集菌体；

3) 菌体重新悬浮于5％的蔗糖溶液中，并调至OD₆₀₀0.8；

4）加入Silwet L-77至终浓度为0.03%。

2.2.3.3拟南芥转化

取拟南芥材料，倒置浸泡地上部分于预备好的农杆菌溶液中，晃动约3秒，取出，放置到荫蔽条件下，保湿24h，转入正常条件培养。

2.2.3.4拟南芥转化子筛选

收集转化后拟南芥的种子。种子用0.01% HgCl₂ 表面灭菌8分钟，无菌水冲洗4次，悬浮在0.1 %的琼脂糖中，然后按每平板（直径15cm）2000粒种子（约40mg），铺在卡那霉素50mg/L, 1/2MS培养基上。将平板置于4℃黑暗冰箱中2天，转移到（16h L/8h D）光照, 23℃条件下进行培养。约10天左右可筛选出具卡那霉素抗性的转基因植株，将具抗性的植株转移到基质培养。如此经过2代筛选，可得纯合的T3代种子。

2.2.4 转基因植株开花时间观察

纯合的T₃代转基因植株种子直接点种于基质上，在16h L/8h D光照, 23℃条件下培养。培养时每隔四天浇水一次，发芽后25天左右，野生型拟南芥Col-0开始抽苔开花，而转基因植株表现出明显的抑制开花。发芽后45天左右，野生型拟南芥Col-0抽苔基本已完成，转基因植株则处于不同的抽苔阶段，如图4所示。在8h L/16h D光照条件下培养也能得到类似结果。对各个转基因株系取生长相似的叶片，抽提RNA反转录对AtTCP8的表达量进行Real-time PCR分析定量，结果显示AtTCP8的表达量与抑制开花的强度呈显著正相关，如图5所示。

Real-time PCR检测AtTCP8所用引物：

RT-TCP8-S： 5’CAACACTCGCAACAACCTCATCT　3’

RT-TCP8-A： 5’GAAGCCATTCAATAGTTTCACCA　3’ （SEQ ID NO.5）

Real-time PCR检测内参基因AtACT2所用引物：

RT-ACT2-S： 5’GGCTCCTCTTAACCCAAAGGC 3’

RT-ACT2-A： 5’CACACCATCACCAGAATCCAG 3’ （SEQ ID NO.6）。

2.2.5 转基因植株开花时莲座叶片数统计

纯合的T₃代转基因植株种子直接点种于基质上，分别在16h L/8h D、8h L/16h D光照条件下生长，当植株抽苔达2 cm时，对莲座叶片数进行统计。统计结果显示AtTCP8表达量高的株系抽苔时的莲座叶数显著多于野生型拟南芥，如图6所示。

<110> 复旦大学

<120> 拟南芥TCP家族转录因子及其编码基因与应用

<130> 001

<160> 6

<170> PatentInversion3.3

<210> 1

<211> 1630

<212> DNA

<213> 拟南芥（Arabidopsisthaliana）

<400> 1

ctcgagacaaagaagaagacaagagtcaaacttgaaggcgacaatcggagcttccatggc 60

cgtttcttcctctttcaccaaaccctaatttcaatttcatcttcttttcccttctttctc 120

accggaaaatggatctctccgacatccgaaacaacaacaacgacaccgccgccgtcgcca 180

ccggaggaggagcaagacagctagttgacgcatctctctcaatcgttcccagatctacac 240

ctcccgaagactcaacactcgcaacaacctcatctacggcaacggcgactacaacgaagc 300

ggtcgactaaagaccgtcacacgaaagtcgacggaagaggacgtcggattcgtatgccgg 360

cgctatgtgcagctagagtttttcagttaacgagagagttaggtcataaatccgatggtg 420

aaactattgaatggcttcttcaacaagctgagccagctattgttgctgctacaggtacag 480

gaactattccggcgaacttctctactttaagtgtttcgttacgaagtagtggatcgactc 540

tctctgctccgccgtcgaaatcggtgccgctttacggtgctcttggattgactcatcatc 600

agtatgatgaacaaggaggcggcggtgtgtttgctgctcatacgtcgccgcttttagggt 660

ttcatcatcagcttcaacaccaccagaaccagaatcagaatcaagatccggtggaaacta 720

ttcctgaaggtgagaatttctctaggaaacggtatagatcggttgatttgtctaaagaaa 780

acgatgatcggaaacagaacgagaataaatctttgaaagaaagtgaaacgtcgggtccta 840

cggcggcgccgatgtgggcggttgcgccgccgagtaggtctggtgctgggaacacttttt 900

ggatgcttccggtaccgacaacggccggtaatcaaatggagagtagtagcaacaataaca 960

ccgccgcaggccaccgtgctcctcctatgtggccatttgtgaactctgctggaggaggag 1020

cgggaggtggaggcggagcagcgactcactttatggcgggaacggggtttagttttccga 1080

tggatcagtacagaggaagtccacttcagttaggttcttttttagctcagccgcagccga 1140

ctcagaacttaggactaagtatgccggactcgaatctcgggatgttagccgctttgaact 1200

cggcttattcaagaggcggaaacgcaaacgcgaatgcggaacaagcgaacaatgcggtgg 1260

agcatcaagagaagcagcaacagagtgatcatgatgatgatagtagagaggagaactcaa 1320

atagctctgagtgagtgatgtaaactaatcttgtgaaatcattgaatgtggtaagaaatt 1380

gatttaaagcgtttgtagcggtttggttgattgttttattgtgagattttgtgtgttgtt 1440

gtttagtagtgtttagacaagaacaatttatgtgtgaaggaattgttaggtttgggtcca 1500

aatggactctcatgggtagagaatgttttcaatgtatagaaggaatgatagtcttttcga 1560

tttttcagttttcattgttgagtttcttatatttttgtaggataaaattgcattcaaacc 1620

aaaagaataa 1630

<210> 2

<211> 401

<212> PRT

<213> 拟南芥（Arabidopsisthaliana）

<400> 2

MetAspLeuSerAspIleArgAsnAsnAsnAsnAspThrAlaAlaVal

1 5 10 15

AlaThrGlyGlyGlyAlaArgGlnLeuValAspAlaSerLeuSerIle

20 25 30

ValProArgSerThrProProGluAspSerThrLeuAlaThrThrSer

35 40 45

SerThrAlaThrAlaThrThrThrLysArgSerThrLysAspArgHis

50 55 60

ThrLysValAspGlyArgGlyArgArgIleArgMetProAlaLeuCys

65 70 75 80

AlaAlaArgValPheGlnLeuThrArgGluLeuGlyHisLysSerAsp

85 90 95

GlyGluThrIleGluTrpLeuLeuGlnGlnAlaGluProAlaIleVal

100 105 110

AlaAlaThrGlyThrGlyThrIleProAlaAsnPheSerThrLeuSer

115 120 125

ValSerLeuArgSerSerGlySerThrLeuSerAlaProProSerLys

130 135 140

SerValProLeuTyrGlyAlaLeuGlyLeuThrHisHisGlnTyrAsp

145 150 155 160

GluGlnGlyGlyGlyGlyValPheAlaAlaHisThrSerProLeuLeu

165 170 175

GlyPheHisHisGlnLeuGlnHisHisGlnAsnGlnAsnGlnAsnGln

180 185 190

AspProValGluThrIleProGluGlyGluAsnPheSerArgLysArg

195 200 205

TyrArgSerValAspLeuSerLysGluAsnAspAspArgLysGlnAsn

210 215 220

GluAsnLysSerLeuLysGluSerGluThrSerGlyProThrAlaAla

225 230 235 240

ProMetTrpAlaValAlaProProSerArgSerGlyAlaGlyAsnThr

245 250 255

PheTrpMetLeuProValProThrThrAlaGlyAsnGlnMetGluSer

260 265 270

SerSerAsnAsnAsnThrAlaAlaGlyHisArgAlaProProMetTrp

275 280 285

ProPheValAsnSerAlaGlyGlyGlyAlaGlyGlyGlyGlyGlyAla

290 295 300

AlaThrHisPheMetAlaGlyThrGlyPheSerPheProMetAspGln

305 310 315 320

TyrArgGlySerProLeuGlnLeuGlySerPheLeuAlaGlnProGln

325 330 335

ProThrGlnAsnLeuGlyLeuSerMetProAspSerAsnLeuGlyMet

340 345 350

LeuAlaAlaLeuAsnSerAlaTyrSerArgGlyGlyAsnAlaAsnAla

355 360 365

AsnAlaGluGlnAlaAsnAsnAlaValGluHisGlnGluLysGlnGln

370 375 380

GlnSerAspHisAspAspAspSerArgGluGluAsnSerAsnSerSer

385 390 395 400

Glu

<210> 3

<211> 68

<212> DNA

<213> 拟南芥（Arabidopsisthaliana）

<400> 3

atagagctcatggatctctccgacatccgaaacaatactgcagtcactcagagctatttg 60

agttctcc 68

<210> 4

<211> 68

<212> DNA

<213> 拟南芥（Arabidopsisthaliana）

<400> 4

atagagctcatggatctctccgacatccgaaacaatactgcagtcactcagagctatttg 60

agttctcc 68

<210> 5

<211> 46

<212> DNA

<213> 拟南芥（Arabidopsisthaliana）

<400> 5

caacactcgcaacaacctcatctgaagccattcaatagtttcacca 46

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 拟南芥（Arabidopsisthaliana）

<400> 6

ggctcctcttaacccaaaggccacaccatcaccagaatccag 42

Claims

1.一种拟南芥TCP家族转录因子，其特征在于是SEQ ID NO.2所示氨基酸残基序列的蛋白质。

2.拟南芥转录因子AtTCP8编码基因，其特征在于其DNA序列为SEQ ID NO.1 所示序列，或者为编码SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列的多核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：该基因的编码框为自5’端第129位到第1334位碱基的DNA序列。

4.含有如权利要求2或3所述拟南芥转录因子AtTCP8编码基因的表达载体。

5.含有如权利要求2或3所述拟南芥转录因子AtTCP8编码基因的细胞系。

6.如权利要求2或3所述拟南芥转录因子AtTCP8编码基因在调控植物开花进程中的应用。