CN111926023A

CN111926023A - 一种桃休眠相关PpTCP20基因及其应用

Info

Publication number: CN111926023A
Application number: CN202010772862.1A
Authority: CN
Inventors: 李玲; 王庆杰; 杜桂英; 陈修德; 肖伟; 李冬梅; 付喜玲
Original assignee: Wulian Agricultural And Rural Bureau; Shandong Agricultural University
Current assignee: Wulian Agricultural And Rural Bureau; Shandong Agricultural University
Priority date: 2020-08-04
Filing date: 2020-08-04
Publication date: 2020-11-13

Abstract

本发明公开了一种桃休眠相关PpTCP20基因及其应用。属于基因工程技术领域。桃休眠相关PpTCP20基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，利用强启动子驱动原理的转基因技术将桃休眠相关PpTCP20基因的超量表达载体转入烟草中，获得转基因烟草，发现转基因烟草中过表达桃休眠相关PpTCP20基因能够促进种子萌芽率的提高，并能促进转基因烟草开花。

Description

一种桃休眠相关PpTCP20基因及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及一种桃休眠相关PpTCP20基因及其应用。

背景技术

种子休眠是指种子由于内在的一些原因不能在一定的环境下萌发的现象。种子休眠是普遍存在的，可以使物种逃避自然灾害，减少种内个体间竞争及防止种子在不合时宜的季节萌发，是物种在长期进化过程中获得的一种对环境及季节性变化的适应性，是高等植物受基因和环境因子共同影响的复杂性状，具有普遍的生物学意义。在栽培过程中种子休眠具有双重性：一方面，要求播种后种子能发芽迅速、整齐；另一方面，需要种子具有一定的休眠性，防止种子在收获季节遇到不适宜的气候而影响产量和品质。

桃树是世界上重要的经济落叶果树，在世界上广泛地种植。桃是设施栽培果树中的主要树种。在设施栽培中，自然休眠是限制果品上市的主要因素。自然休眠受多种因素的调控(光照、激素和温度等)，而且桃没有转化体系，因此研究桃自然休眠具有重大的挑战。桃为多年生木本植物，通过常规育种选育设施栽培品种周期长。

综上，为了扩展人们对温带多年生落叶果树调控自然休眠分子机制的认识，研究和了解桃休眠相关基因是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种桃休眠相关PpTCP20基因及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种桃休眠相关PpTCP20基因，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

一种利用权利要求1所述桃休眠相关PpTCP20基因编码出的多肽，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

一种用于扩增权利要求1所述桃休眠相关PpTCP20基因的引物对，包括：

PpTCP20-F：ATGGATCCCAAGGGCTCA；SEQ.ID.NO.3；

PpTCP20-R：CTGTCCTGAGCCTTGAGAGTC；SEQ.ID.NO.4。

包括权利要求1所述的桃休眠相关PpTCP20基因的植物表达载体。

权利要求1所述的桃休眠相关PpTCP20基因在促进设施桃休眠的解除和促进桃品种选育中的应用。

PpTCP20转录因子能够通过直接抑制PpDAM5和PpDAM6基因的表达来促进桃自然休眠的解除。

权利要求1所述的桃休眠相关PpTCP20基因在烟草种植中的应用。

一种提高烟草种子萌芽率并促进烟草开花的方法，其特征在于，将桃休眠相关PpTCP20基因的超量表达载体转入烟草中，获得转基因烟草。

PpTCP20转录因子可影响烟草中开花基因SVP(PpDAM5和PpDAM6的同源基因)基因的表达，进而促进烟草开花。

本发明公开了一种桃休眠相关PpTCP20基因及其应用，利用强启动子(花椰菜花叶病毒35S启动子)驱动原理的转基因技术，将桃休眠相关PpTCP20基因的超量表达载体转入烟草中，从而获得转基因植株。实验证明，超量表达桃休眠相关PpTCP20基因的转基因烟草种子萌芽率相比于野生型明显增强，此外还促进烟草的开花，说明桃休眠相关PpTCP20基因在休眠及生长发育过程发挥重要作用。本发明为设施果树育种和确定休眠提供了一种新的快速的途径。PpTCP20基因的发掘不仅为桃休眠基因工程和品种改良提供候选基因，丰富植物休眠的理论体系，对于其他物种的休眠材料的培育具有重要的现实意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明实施例1中PCR扩增产物凝胶电泳图；

图2附图为本发明实施例2中桃休眠相关PpTCP20基因在桃花芽休眠时期表达情况，其中a、b、c表示基因表达量差异显著性分析；

图3附图为本发明实施例3中转基因烟草鉴定结果，其中，A为PCR鉴定结果，WT为野生烟草株系、PpTCP20-L1、PpTCP20-L2、PpTCP20-L4为三个转基因烟草株系；B为RT-PCR鉴定结果，WT为野生烟草株系、PpTCP20-L1、PpTCP20-L2、PpTCP20-L4为三个转基因烟草株系；

图4附图为本发明实施例4中野生型和转基因烟草种子萌发情况和表型，其中，A为种子萌发图，WT为野生烟草株系、PpTCP20-L1、PpTCP20-L2、PpTCP20-L4为三个转基因烟草株系；B为表型图，WT为野生烟草株系、PpTCP20-L1、PpTCP20-L2、PpTCP20-L4为三个转基因烟草株系，红色圆圈标识花朵的位置。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明未提及材料均采购自市售渠道；未提及的实验方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。

实施例1桃休眠相关PpTCP20基因的克隆

一、桃花芽RNA提取及反转录

1.利用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(天根，北京)提取植物RNA，按照说明书步骤进行：

(1)取100mg‘中油四号’桃花芽，液氮研磨成粉末，加入500μL裂解液SL(加入25μLβ-巯基乙醇至终体积浓度为5％)，涡旋震荡混匀。

(2)12,000rpm离心10min。

(3)取上清液A加入过滤柱CS上，12,000rpm离心5min，将收集管中的上清液B倒入新的离心管中，避免吸取细胞碎片及沉淀。

(4)在离心管中缓慢加入0.4倍上清液B体积的无水乙醇，混匀后并一起倒入吸附柱CR3中，12,000rpm离心30s，弃掉废液。

(5)向吸附柱CR3继续加入350μL去蛋白液RW1，12,000rpm离心30s，倒掉废液。

(6)配制DNase I工作液：取10μL DNase I储存液加入70μL RDD溶液，混匀。

(7)向吸附柱CR3继续加入DNase I工作液80μL，室温静置20min。

(8)向吸附柱CR3继续加入去蛋白液RW1350μL，12,000rpm离心1min，倒掉废液。

(9)向吸附柱CR3继续加入漂洗液RW 500μL，12,000rpm离心30s，倒掉废液；重复一次。

(10)12,000rpm高速离心5min，将吸附柱CR3放入无RNA酶离心管中，向中间部位滴加30～50μL RNase Free water，室温静置10min，12,000rpm高速离心2min，获得RNA溶液。

2.反转录cDNA

首先对上述提取的RNA进行浓度和纯度检测，当RNA符合标准时(A260/A230值为大于2.0，A260/A280值为介于1.8-2.0之间)，利用诺维赞公司HiScript Q RT SuperMix forqPCR(+gDNA wiper)反转录试剂盒说明步骤进行，具体如下：

(1)基因组DNA去除

在RNase-free的离心管中配制如下表所示混合液。

表1混合液成分

轻轻吹打混匀。42℃反应2min。

(2)配制反转录反应体系

在第(1)步的离心管中直接加入5×qRT SuperMix II溶液4μL，得到反应液。

(3)进行反转录反应

反应液50℃反应15min，然后85℃反应2min。产物(桃花芽cDNA)可立即用于qPCR反应，或者保存-20℃。

二、cDNA全长序列的获得

根据phytozome网站查到的拟南芥中TCP20基因保守氨基酸序列并进行同源序列比对获得桃休眠相关PpTCP20基因的核苷酸序列，设计特异引物PpTCP20-F和PpTCP20-R，然后以反转录合成的桃花芽cDNA为模板进行PCR扩增，得到cDNA全长序列；其中，特异性引物的序列如下：

PpTCP20-F：ATGGATCCCAAGGGCTCA；SEQ.ID.NO.3；

PpTCP20-R：CTGTCCTGAGCCTTGAGAGTC；SEQ.ID.NO.4。。

所述PCR扩增反应体系如表2所示：

表2 PCR扩增反应体系

PCR反应程序为98℃预变性15s，98℃变性10s，58℃退火20s，72℃延伸1min，(共30个循环)；最后72℃延伸10min。

PCR反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示。并利用天根琼脂糖凝胶回收试剂盒将PCR产物进行回收,连接克隆载体、转化大肠杆菌感受态细胞，测序得到桃休眠相关PpTCP20基因，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，编码的多肽氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

实施例2桃休眠相关PpTCP20基因在桃花芽休眠时期表达情况

通过培养25d后调查桃枝条上的芽的萌芽率，确定桃芽的休眠状态。10月15日至12月15日处于自然休眠阶段；11月15日至12月15日处于自然休眠的解除阶段。12月30日到次年1月30日花芽萌芽率都超过50％，此阶段为生态休眠时期。

桃休眠相关PpTCP20基因在桃花芽休眠时期表达情况如图2所示。

由图2结果可知，桃休眠相关PpTCP20基因在自然休眠解除期(11与15日到12月15日)表达量上调，说明桃休眠相关PpTCP20基因可调控桃花芽自然休眠的解除。

实施例3转基因烟草的获得

为了验证桃休眠相关PpTCP20基因的功能，扩增桃休眠相关PpTCP20基因ORF全长，连接PRI-GFP表达载体，转化农杆菌GV3101。采用农杆菌介导的叶盘法转化烟草，步骤如下：

(1)取本氏烟(Nicotiana benthamiana)烟草种子用75％酒精消毒5min,用无菌水洗一次，然后使用5％的次氯酸钠溶液消毒10min，无菌水洗5次。

(2)将消毒后烟草种子种植在灭菌的培养瓶中，待长出完全健康的绿色叶片。

(3)选取上述叶片，去掉叶柄和叶尖，切成正方形，中间连续切割几刀，不要切断，在预分化培养基(MS+6-BA 3mg L^-1+NAA 0.2mg L^-1)培养2天。

(4)挑选农杆菌单菌落，28℃摇菌过夜培养。次日放置摇床中二次活化，当菌液浓度为OD₆₀₀＝0.8，离心5min，收集菌体，用来侵染烟草叶片。

(5)将步骤(3)得到的烟草叶片置于农杆菌菌液中侵染10min，之后倒掉农杆菌菌液，吸净烟草叶片上多余菌液，将烟草叶片放置预分化培养基上培养2d，得预培养烟草叶片。

(6)取预培养烟草叶片，表面朝上放置在含有抗生素的分化培养基(MS+6-BA 3mgL^-1+NAA 0.2mg L^-1+卡那霉素50μg mL^-1)上培养。

(7)当叶缘长出芽并可以分离时(1cm以上)，将芽切下放置在含有抗生素的生根培养基(MS+IAA 0.1mg L^-1+卡那霉素50μg mL^-1)上培养。

(8)两周后长出根后，炼苗，炼苗一周后，取烟草的叶片DNA和RNA，PCR和RT-PCR鉴定是否为转基因培养株系，鉴定结果如图3所示。

选取在含有抗生素的生根培养基上生长良好的烟草幼苗，利用35S引物和PpTCP20基因的特异性引物(PpTCP20-F和PpTCP20-R)以烟草基因组DNA为模板进行扩增，在转基因烟草株系PpTCP20-L1、PpTCP20-L2、PpTCP20-L4中检测到了目的条带的表达(图3A)。利用荧光定量PCR对获得的转基因烟草进行表达量的测定，如图3B所示，与野生型烟草相比，烟草转基因株系PpTCP20-L1、PpTCP20-L2、PpTCP20-L4中桃休眠相关PpTCP20基因的表达量分别提高了18倍、10倍和5倍。综上所述，PpTCP20-L1、PpTCP20-L2、PpTCP20-L4为桃休眠相关PpTCP20基因过量表达的转基因烟草。

实施例4种子萌芽率和开花表型

对野生型和转基因烟草种子的萌芽率进行分析。将T2代转基因烟草种子在MS培养基上生长5d后，观察种子萌芽率，结果如图4A所示。

经统计，野生型烟草种子的萌芽率为73％，PpTCP20转基因烟草种子(PpTCP20-L1、PpTCP20-L2、PpTCP20-L4)的萌芽率分别为92％、96％和100％，说明转基因烟草种子的萌芽率明显提高。

选取长势一致的野生型和转基因烟草进行表型观察，在65d后观察野生型和转基因品系的开花表型，结果如图4B所示。

由图4B可以看出，野生型烟草没有开花，而转基因烟草PpTCP20-L1、PpTCP20-L2、PpTCP20-L4均已开花，说明转基因烟草开花时间明显早于野生型烟草。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 山东农业大学

五莲县农业农村局

<120> 一种桃休眠相关PpTCP20基因及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 936

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggatccca agggctcaaa gcagacacaa gagataccca gcttcttgag cctcccacag 60

cctcaacagc agcagcaaca acaacaacag cagcagcagc agcagcagca gcccaacatg 120

agtgagaaca aacctgctga aatcaaagat ttccagattg tgattgcaga caaagaagag 180

gggaagaagc agttggcgcc caagagaagc tcaaacaaag acagacacac aaaggttgaa 240

ggcaggggaa ggaggatacg gatgcctgct ctgtgtgcag caagaatttt tcaattgacc 300

agagaattgg gccacaaatc tgatggggaa accatacagt ggcttttgca gcaggccgaa 360

ccgtcgataa ttgcagccac cgggaccggt acgataccag catcggcttt aacagcggca 420

ggaggctctg tttcacagca ggggacttct ctatcagctg gattgcacca aaagattgat 480

gaattggggg ggtccagtat tgggtcaggg agtaggacca gttgggcaat ggtaggtggg 540

aatttgggga gaccccatgt ggccactggg ctatggcccc ctgtcagtag ctttggtttc 600

cagtcatcat ctggtccatc aacaacaaat ctgggcagtg agagttcaaa ttacatgcaa 660

aagattggct ttcctggctt tgacttgcct gtctccaaca tgggtcctat gagtttcacc 720

tcaattttgg gtggtgggag taaccaacag cttcctggct tggagcttgg gttgtctcag 780

gatggtcata ttggggtttt gaactcacaa gccttgagcc agatttacca gcagatgggg 840

catgctagag tacaccagca ccagcaccag caccagcacc agcaccagca ccagcaaccc 900

cctgctaagg atgactctca aggctcagga cagtag 936

<210> 2

<211> 311

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Asp Pro Lys Gly Ser Lys Gln Thr Gln Glu Ile Pro Ser Phe Leu

1 5 10 15

Ser Leu Pro Gln Pro Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln

20 25 30

Gln Gln Gln Gln Gln Pro Asn Met Ser Glu Asn Lys Pro Ala Glu Ile

35 40 45

Lys Asp Phe Gln Ile Val Ile Ala Asp Lys Glu Glu Gly Lys Lys Gln

50 55 60

Leu Ala Pro Lys Arg Ser Ser Asn Lys Asp Arg His Thr Lys Val Glu

65 70 75 80

Gly Arg Gly Arg Arg Ile Arg Met Pro Ala Leu Cys Ala Ala Arg Ile

85 90 95

Phe Gln Leu Thr Arg Glu Leu Gly His Lys Ser Asp Gly Glu Thr Ile

100 105 110

Gln Trp Leu Leu Gln Gln Ala Glu Pro Ser Ile Ile Ala Ala Thr Gly

115 120 125

Thr Gly Thr Ile Pro Ala Ser Ala Leu Thr Ala Ala Gly Gly Ser Val

130 135 140

Ser Gln Gln Gly Thr Ser Leu Ser Ala Gly Leu His Gln Lys Ile Asp

145 150 155 160

Glu Leu Gly Gly Ser Ser Ile Gly Ser Gly Ser Arg Thr Ser Trp Ala

165 170 175

Met Val Gly Gly Asn Leu Gly Arg Pro His Val Ala Thr Gly Leu Trp

180 185 190

Pro Pro Val Ser Ser Phe Gly Phe Gln Ser Ser Ser Gly Pro Ser Thr

195 200 205

Thr Asn Leu Gly Ser Glu Ser Ser Asn Tyr Met Gln Lys Ile Gly Phe

210 215 220

Pro Gly Phe Asp Leu Pro Val Ser Asn Met Gly Pro Met Ser Phe Thr

225 230 235 240

Ser Ile Leu Gly Gly Gly Ser Asn Gln Gln Leu Pro Gly Leu Glu Leu

245 250 255

Gly Leu Ser Gln Asp Gly His Ile Gly Val Leu Asn Ser Gln Ala Leu

260 265 270

Ser Gln Ile Tyr Gln Gln Met Gly His Ala Arg Val His Gln His Gln

275 280 285

His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln Gln Pro Pro Ala Lys Asp

290 295 300

Asp Ser Gln Gly Ser Gly Gln

305 310

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggatccca agggctca 18

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctgtcctgag ccttgagagt c 21

Claims

1.一种桃休眠相关PpTCP20基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

2.一种利用权利要求1所述桃休眠相关PpTCP20基因编码出的多肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

3.一种用于扩增权利要求1所述桃休眠相关PpTCP20基因的引物对，其特征在于，包括：

PpTCP20-F：ATGGATCCCAAGGGCTCA；SEQ.ID.NO.3；

PpTCP20-R：CTGTCCTGAGCCTTGAGAGTC；SEQ.ID.NO.4。

4.包括权利要求1所述的桃休眠相关PpTCP20基因的植物表达载体。

5.权利要求1所述的桃休眠相关PpTCP20基因在促进设施桃休眠的解除和促进桃品种选育中的应用。

6.权利要求1所述的桃休眠相关PpTCP20基因在烟草种植中的应用。

7.一种提高烟草种子萌芽率并促进烟草开花的方法，其特征在于，将桃休眠相关PpTCP20基因的超量表达载体转入烟草中，获得转基因烟草。