CN117683109A

CN117683109A - ScF3'H基因在提高马铃薯抗寒性中的应用

Info

Publication number: CN117683109A
Application number: CN202410154241.5A
Authority: CN
Inventors: 祝光涛; 暴会会; 陈凯园; 罗永超
Original assignee: Yunnan Normal University
Current assignee: Yunnan Normal University
Priority date: 2024-02-04
Filing date: 2024-02-04
Publication date: 2024-03-12
Anticipated expiration: 2044-02-04
Also published as: CN117683109B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及ScF3'H基因在提高马铃薯抗寒性中的应用。本发明公开的一种蛋白，为（a）或（b）所示；（a）由SEQ ID NO.1所示的氨基酸组成的蛋白；（b）由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的衍生蛋白。本发明的ScF3'H基因可以显著增强马铃薯抗寒性，可应用于马铃薯抗低温育种和品种改良，为马铃薯抗性育种提供更多选择。

Description

ScF3'H基因在提高马铃薯抗寒性中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及ScF3'H基因在提高马铃薯抗寒性中的应用。

背景技术

马铃薯(Solanum tuberosumL.)是世界上第四大粮食作物和最重要的块茎作物，在全世界范围内广泛种植和消费，在保障全球粮食安全以及满足未来人口增长对粮食的进一步需求等方面起着重要作用。霜冻损害是主要的环境胁迫因素之一，它极大地影响植物的生长、发育、生产效率和地理分布。随着马铃薯主粮化战略的实施，南方冬闲田将会是马铃薯面积增加主要贡献区域，但冻害是此产区最主要的气象性灾害。马铃薯普通栽培种几乎都不耐霜冻，一旦发生低温寒潮，农业生长会受到严重的影响，这严重阻碍了南方冬闲田的开发与利用，并将严重影响我国马铃薯产业的进一步发展。

虽然马铃薯普通栽培种抗寒资源匮乏，但马铃薯野生种中具有丰富的抗性基因资源，研究发现S. commersonii、S. acaule、S. albicans、S. demissum、S. malmeanum等马铃薯种质具有抗寒性，但由于倍性和EBN介导的合子前和合子后的种间杂交障碍，导致抗寒野生种不能与普通栽培种直接进行有性杂交从而阻止了抗性基因交流，因此迫切需要通过遗传改良创造具有抗冻性的马铃薯新品种。

发明内容

为了克服上述技术缺陷的不足，本发明提供一种来源于马铃薯野生种S. commersonii的ScF3'H编码序列及其所编码的蛋白质，并证明其可以显著增强马铃薯抗寒性，可应用于马铃薯抗低温育种和品种改良，为马铃薯抗性育种提供更多选择。

为实现上述目的，本发明提供一种蛋白，所述蛋白为（a）或（b）；

（a）由SEQ ID NO .1所示的氨基酸组成的蛋白；

（b）由SEQ ID NO .1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的衍生蛋白；

上述（a）或（b）之一的蛋白，其与野生型植株相比，提高马铃薯低温胁迫下的生存率。

一些具体的实施例中，本发明提供了一种蛋白，氨基酸序列与SEQ ID NO .1所示序列具有80％同一性的具有抗寒性增强的氨基酸序列；优选的具有85％同一性，更优选的具有 90％同一性，更优选的具有95％同一性，最优选的，具有99％同一性。

本发明还提供一种编码上述所述蛋白的基因，所述的基因的核苷酸序列为（a）、（b）或（c）；

（a）如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列；

（b）与SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列杂交且编码的核苷酸序列；

（c）与SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列具有80％以上同源性且编码的核苷酸序列。

本发明还提供一种含有蛋白的基因。

本领域技术人员充分了解的是，由于同一氨基酸可能有多种不同的密码子来决定，所以编码上述蛋白的核苷酸序列并不仅仅局限于一种，可以是由SEQ ID NO. 1所示Rnase inhibator突变体核苷酸序列突变一个或多个核苷酸形成同义突变得到同样可编码本发明所述突变体氨基酸序列的核苷酸序列，也可以根据密码子优化设计能够编码本发明所述突变体氨基酸序列的核苷酸序列。

一些具体的实施例中，本发明提供了一种蛋白的基因核苷酸序列与SEQ ID NO. 2所示序列具有80％同一性；优选的具有85％同一性，更优选的具有90％同一性，更优选的具有95％同一性，最优选的，具有99％同一性。

含有上述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

含有上述任一项蛋白、基因、重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在马铃薯栽培种抗低温胁迫中的应用也属于本发明的保护范围。

一种制备转基因植物的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤：将上述蛋白的编码基因导入出发植物中，得到转基因植物；与野生型植株相比，转基因植物的抗冻性增强。

进一步地，所述编码基因是通过重组表达载体导入所述植物中的；所述重组表达载体是将所述编码基因插入初始载体pCAMBIA2300-eYGFPuv的多克隆位点得到的。

进一步地，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 2中所示。

进一步地，所述植物为马铃薯。

有益效果：本发明提供的ScF3'H基因在马铃薯栽培种Desiree中过表达可提高转基因马铃薯植株的抗冻性，为遗传转化阳性植株筛选及马铃薯低温胁迫抗性机制研究提供了重要的理论支持，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为ScF3'H全长cDNA的扩增图；

图2为低温胁迫下ScF3'H基因表达模式分析；

图3为ScF3'H过表达阳性植株筛选；

图4为Kan抗性基因NptII检测；

图5为转基因马铃薯ScF3'H基因相对表达量。

图6为ScF3'H过表达阳性植株和阴性植株低温胁迫下表型差异。

具体实施方式

为使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明作详细说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1ScF3'H基因和表达模式研究

本研究中使用的植物材料为耐寒野生马铃薯材料S. commersonii，简称CM，在添加3%蔗糖和0.31%琼脂的MS培养基上，20±1°C条件下生长2周，之后将2周龄的组培苗植株移植到塑料盆（10×10 cm）中，种植于植物生长气候室（22±2°C，16 h光照/8 h黑暗光周期）；将正常条件下生长的4周龄植株移入4°C冷室中，在16小时光照/8小时黑暗光照周期下进行3天的冷驯化，然后，将驯化后的植株在-3°C下处理3h、6h、12h；分别将处理后的植株取叶片，提取RNA，用于RNA-Seq。ScF3'H基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，ScF3'H蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

实验表明，马铃薯野生材料CM进行低温（-3°C）胁迫处理后，ScF3'H的表达量在低温处理6h时显著上调（图2）。因此，本发明以马铃薯CM的ScF3'H为对象，对ScF3'H的表达变化是否引起马铃薯栽培种的低温抗性进行研究。

实施例 2 ScF3'H基因克隆及过表达载体构建

RNA提取以实施例1中马铃薯测序完成的无菌组培苗为材料，使用TIANGEN多糖

多酚植物总RNA提取试剂盒（DP441）进行RNA提取；具体操作步骤如下：

1、取液氮中磨成粉末的马铃薯叶片于2 mL离心管，加入475μL裂解液SL（加有25ulβ-巯基乙醇），立即涡旋震荡混匀。

2、12,000 rpm 离心2 min。

3、将上清液转移至带有收集管的过滤柱CS中，12,000 rpm离心2 min，吸取收集管中的上清液并转移至新的RNase-Free离心管中，尽量避免接触收集管的沉淀。

4、缓慢加入0.4倍步骤3所得上清液体积的无水乙醇，混匀，然后将混合液转移到吸附柱CR3中，12,000rpm转速离心15s，弃掉废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

5、向步骤4吸附柱CR3中加入350μL的去蛋白液RW1，然后12,000rpm离心15s，弃掉废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

6、将10μLDNaseI储存液加入到70μL缓冲液RDD中以形成DNaseI工作液，混匀。

7、向吸附柱CR3中加入80μL的DNaseI工作液，室温放置15min。

8、向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12,000rpm离心15s，弃掉废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

9、向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW，12,000rpm离心15s，弃掉废液，然后将吸附柱CR3放回收集管中。

10、重复步骤9。

11、12,000rpm离心2min，将吸附柱CR3置于新的RNase-Free离心管中，向吸附柱CR3滴加50μL RNase-Free ddH2O，室温放置2min，12,000rpm离心1min，可得RNA溶液。

cDNA合成使用TaKaRa（Code No. RR047A）反转录试剂盒将实施例2中的RNA反转录为cDNA；具体操作如下：

冰上配置去除基因组DNA反应混合液1：

42°C，2 min；置于冰上冷却；

冰上配置反转录反应混合液2：

37°C,15min;85°C,5sec;

ScF3'H基因克隆以上述cDNA为模版，根据SEQ ID NO. 2的cDNA序列，引物两侧加入pCAMBIA 2300-YeGFPuv载体同源臂序列；

ScF3'H-F：

5'-CTCTCTCTCAAGCTTGGATCCATGGCTATTTTTTCCTTAATTCTATACAC-3'

(SEQ ID NO. 3)

ScF3'H-R：

5'-GATACGAACGAAAGCTCTAG ATCACCCACCGTATACTTGGGC-3'

(SEQ ID NO. 4)

引物组合扩增cDNA全长1545bp（图2），操作按照Vazyme的2x Rapid Taq MasterMix（P222）说明书进行，反应体系如下：

反应程序如下：

4. 过表达载体构建

（1）将BamHI和XbaI酶切载体质粒pCAMBIA 2300-eYGFPuv，反应体系如下：

置于37°C烘箱，过夜；

（2）将 PCR产物^a和酶切后的载体质粒^b进行纯化，使用Vazyme ClonE expressionII One Step Cloning Kit（C112）操作说明进行连接，具体操作如下：

冰上配置以下连接体系：

37°C，连接30min；

（3）转化

使用唯地生物DH5αChemically Competent Cell产品说明书进行大肠杆菌转化，具体操作如下：

a. DH5α感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入5ul上述连接产物并用手拨打EP管底轻轻混匀，冰中静置25分钟；

b. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟(晃动会降低转化效率)；

c. 加入700μl不含抗生素的LB，混匀后37℃，200rpm复苏60分钟；

d. 5000rpm离心1min收集菌体，留取100ul左右上清轻轻吹打重悬菌体并涂布到含有Kan的LB平板；

e. 将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

（4）阳性克隆鉴定

使用载体上的特异引物p2300-sF/sR进行扩增，并将阳性克隆测序，将测序正确的阳性克隆提取质粒命名为pCAMBIA 2300-eYGFPuv-ScF3'H 备用;

p2300-sF：5'-tctctctctcaagcttggatcc-3' (SEQ ID NO. 5)

p2300-sR：5'-aaacagttttcccaatgccat-3' (SEQ ID NO. 6)

实施例 3 农杆菌介导的马铃薯遗传转化

1. 农杆菌转化

将质粒pCAMBIA 2300-eYGFPuv-ScF3'H，使用唯地生物GV3101 ChemicallyCompetent Cell产品说明书进行农杆菌转化，具体操作如下：

（1）取-80℃保存的GV3101农杆菌感受态细胞于冰上融化；

（2）每50ul感受态细胞中加入1μl需要转化的质粒DNA，轻轻混匀，冰上静置5min、液氮5min、37℃水浴5min、冰浴5min；

（3）加入700μl无抗生素的LB液体培养基，于28℃震荡培养2小时；

（4）吸取100μl左右菌液，涂布于含有Kan的LB平板上，倒置平板，28℃培养2-3天。

（5）菌落PCR鉴定。

2. 农杆菌介导的马铃薯遗传转化

遗传转化受体材料为Desiree，包含以下过程：

（1）预培养：选取苗龄28天的马铃薯无菌苗，剪取长度为0.5～1cm不带腋芽的茎段置于平板上进行预培养2d；

（2）共培养：将转化成功的农杆菌摇菌20 mL（LB+Kan+Rif），OD600=0.6～0.8，8000rpm，离心10min，用20 ml液体MS20重悬菌体，将上述茎段转移至菌液中，侵染10～15min，转移至无菌滤纸上吸干菌液，置于平板上，用锡纸封闭进行共培养2d；

（3）再生培养：转移共培养的马铃薯茎段到再生培养基的平板中，置于光照培养箱22℃，16h光照(光照强度2000lx)/8h黑暗交替培养，两周更换一次培养基，至再生苗长出。

（4）阳性植株筛选：载体中含有eYGFPuv标签，使用365nm紫外手电筒照射，筛选得到阳性植株（图3），将阳性苗转移至生根培养基。

3. NptII抗性基因检测

为确定eYGFPuv标签筛选阳性植株的可靠性，进行Kan抗性基因NptII PCR 检测，具体操作如下：

（1）剪取荧光植株和非荧光植株的叶片，采用CTAB法提取DNA；

（2）使用以下引物对Kan抗性基因进行扩增:

NptII-F：5'-tcagaagaactcgtcaagaaggcgatagaaggcg-3' (SEQ ID NO. 7)

NptII-R：5'-atggggattgaacaagatggattgcacgc-3' (SEQ ID NO. 8)

（3）PCR 反应体系如下：

（4）PCR 扩增条件如下：

（5）用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

结果表明：通过PCR扩增过表达载体所携带的Kan抗性基因NptII，经过琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定的12株荧光苗均可以检测出预期大小（798bp）的特异性目的条带（图4）。这说明利用农杆菌介导的植物转化方法将pCAMBIA 2300 -eYGFPuv-ScF3'H载体转化马铃薯后，再生出的植株使用365nm手电筒筛选阳性株是可靠的。

实施例4转基因马铃薯抗寒性验证

转基因马铃薯F3'H表达水平检测将荧光苗和非荧光苗取样，提取RNA并反转录为cDNA，具体操作参考实施例2。

使用下列引物进行RT-PCR，延伸因子1α(elongation factor 1α, EF1α)为内参基因，采用2^–ΔΔCT计算基因的相对表达量。

反应体系如下：

反应程序如下：

通过对转基因马铃薯和野生型的ScF3'H基因转录水平进行鉴定，结果表明：ScF3'H基因过表达后，3个独立lines中的该基因表达量均显著上调（图5），选取表达量最高的lines：OE-2#进行后续的低温胁迫处理。

低温胁迫处理将上述低温胁迫处理后的材料进行室温恢复24h后统计马铃薯植株存活率。结果表明：ScF3'H基因超量表达后，茎杆呈现红棕色，而对照组呈现绿色，说明该基因超量表达后显著提高了花青素生物合成；经过低温胁迫处理后，过表达组存活率为70%，而对照组的存活率仅为30%（图6）。以上结果表明ScF3'H基因超量表达后，可以显著提高马铃薯的抗寒性，为马铃薯抗性育种奠定基础。

最后需要说明，上述描述仅为本发明的优选实施例，本领域的技术人员在本发明的启示下，在不违背本发明宗旨及权利要求的前提下，可以做出多种类似的表示，这样的变换均落入本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种蛋白，其特征在于：所述蛋白为（a）或（b）；

（a）由SEQ ID NO .1所示的氨基酸组成的蛋白；

（b）由SEQ ID NO .1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的衍生蛋白。

2.一种编码权利要求1所述蛋白的基因，所述的基因的核苷酸序列为（a）、（b）或（c）；

（a）如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列；

3.一种含有权利要求1所述的蛋白的基因。

4.一种含有权利要求2或3所述的基因的重组载体、表达盒、转基因系或重组菌。

5.一种权利要求1所述的蛋白、权利要求2或3所述的基因、权利要求4所述的重组载体、表达盒、转基因系或重组菌在马铃薯栽培种抗低温胁迫中的应用。

6.一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：将权利要求1所述蛋白的编码基因导入出发植物中，得到转基因植物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述编码基因是通过重组表达载体导入所述植物中的；所述重组表达载体是将所述编码基因插入初始载体pCAMBIA2300-eYGFPuv的多克隆位点得到的。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNo. 2中所示。

9.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述植物为马铃薯。