CN116491417A - 马铃薯野生种S. commersonii的再生方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于马铃薯育种技术领域，特别涉及一种马铃薯野生种S.commersonii的再生方法。所述再生方法包括如下步骤：S1、获取外植体；S2、愈伤组织分化培养；S3、芽诱导分化培养；S4、生根培养；S5、驯化炼苗。本发明提供的再生方法，从外植体取材到成苗仅需3个月，成活率高，再生周期短、效率高，特别适合于马铃薯野生种S.commersonii的快速育种和繁殖。
Description
技术领域
本发明属于马铃薯育种技术领域，特别涉及一种马铃薯野生种S.commersonii的再生方法。
背景技术
马铃薯(Solanum tuberosum L.)为中国第四大主要粮食作物，中国为世界上马铃薯种植面积和总产量最大的国家，随着马铃薯产业的快速发展，亟需培养特色、优质的新品种。
S.commersonii是一种原产于中南美洲的野生马铃薯，具有极强的抗逆性，尤其是低温胁迫，是改良马铃薯耐冻性的重要基因资源。在植物基因工程中，植物组织培养是遗传转化体系的建立、突变体的筛选、优良种苗的快速繁殖及体细胞杂交等技术的基础。但目前报道的再生方案均无法解决此野生种诱导率低、再生难等问题，极大地限制了此野生种马铃薯的种植推广，成为亟待解决的技术难题。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种马铃薯野生种S.commersonii的再生方法及其培养基组合，所述方法以马铃薯野生种S.commersonii无菌苗的茎段和叶片为外植体，通过优化植物组织培养过程的培养基组成，能够实现此野生种马铃薯的高效离体再生。
本发明的第一方面，提供一种马铃薯野生种S.commersonii的再生培养基组合，其包括无菌苗培养基、愈伤组织分化培养基、芽诱导分化培养基和生根培养基；
所述无菌苗培养基和生根培养基均为MS培养基；
所述愈伤组织分化培养基由第一培养基和第二培养基组成，所述第一培养基用于诱导马铃薯野生种S.commersonii无菌苗的茎段形成茎段愈伤组织，所述第二培养基用于诱导马铃薯野生种S.commersonii无菌苗的叶片形成叶片愈伤组织；所述第一培养基以MS培养基为基础培养基，还包括以下质量浓度的植物激素组分：0～10mg/L ZT、0～0.01mg/LIAA、0～0.1mg/LGA3、0～0.2mg/L 6-BA和0～3mg/L NAA；所述第二培养基以MS培养基为基础培养基，还包括以下质量浓度的植物激素组分：0～1.5mg/L ZT、0～2mg/LIAA、0～1.5mg/L 6-BA、0～0.5mg/L NAA和0～1.5mg/L 2,4-D；
所述芽诱导分化培养基由第三培养基和第四培养基组成，所述第三培养基用于诱导所述茎段愈伤组织形成不定芽，所述第四培养基用于诱导所述叶片愈伤组织形成不定芽；所述第三培养基以MS培养基为基础培养基，还包括以下质量浓度的植物激素组分：2～3mg/L ZT、0.5～1mg/L IAA；所述第四培养基以MS培养基为基础培养基，还包括以下质量浓度的植物激素组分：2～3mg/L ZT、0.5～1mg/L IAA。
ZT：玉米素，分子式：C10H13N5O，分子量：255.2，是植物体内天然存在的一种天然细胞分裂素，它是从甜玉米灌浆期的籽粒中提取并结晶出的第1个天然细胞分裂素，已能人工合成。生产中使用的外源玉米素属生物源植物生长调节剂，能促进植物细胞分裂，阻止叶绿素和蛋白质降解，减慢呼吸作用，保持细胞活力，延缓植株衰老。
IAA：吲哚乙酸，分子式：C10H9O2N，分子量：175.19，促进细胞的分裂、伸长、扩大，诱发组织的分化，促进RNA合成，提高细胞膜透性，使细胞壁松弛，加快原生质的流动。低浓度与赤霉酸、激动素协同促进植物的生长发育，髙浓度则是诱导内源乙烯的生成，促进其成熟和衰老。
NAA：萘乙酸，分子式：C12H10O2，分子量：186.2，刺激生长、插条生根、疏花疏果、防止落花落果、诱导开花、抑制抽芽、促进早热和增产等。
2,4-D：2,4-二氯苯氧乙酸，分子式：C8H6O3Cl2，分子量：221，是一种苯氧类植物生长调节剂，低浓度具有促进插枝生根，阻止器官脱落等作用，高浓度可杀死多种阔叶杂草。
GA3：赤霉酸，分子式：C19H22O6，分子量：346.4，使茎伸长，部分代替低温长日照，促进叶的扩大和侧枝生长，促进雄花形成，种子发芽，单性结实和果实形成，储藏保鲜，抑制成熟和衰老，抑制侧芽休眠和地下块茎形成。
6-BA：6-苄基腺嘌呤，分子式：C12H11N5，分子量：225.3，促进细胞分裂，诱导组织分化，提高座果率，促进果实生长；防衰保鲜。
进一步地，所述第一培养基包括以下质量浓度的植物激素组分：10mg/LZT、0.01mg/L IAA、0.1mg/L GA3。
进一步地，所述第二培养基包括以下质量浓度的植物激素组分：1.5mg/L ZT、1mg/L IAA。
进一步地，所述第三培养基包括以下质量浓度的植物激素组分：3mg/LZT、0.5mg/LIAA。
进一步地，所述第四培养基包括以下质量浓度的植物激素组分：2mg/LZT、1mg/LIAA。
本发明的第二方面，提供一种采用前述培养基组合进行马铃薯野生种S.commersonii的再生方法，包括如下步骤：
S1、获取外植体：于无菌条件下，将马铃薯野生种S.commersonii的顶芽接种于无菌苗培养基中进行培养，得马铃薯野生种S.commersonii无菌苗；选取苗龄25～30天的所述马铃薯野生种S.commersonii无菌苗，剪取0.5-1cm长度不带腋芽的茎段和0.5～1cm2大小幼嫩叶片，备用；
S2、愈伤组织分化培养：将步骤S1所得茎段和叶片分别接种于第一培养基和第二培养基中进行继代培养至愈伤组织形成，得茎段愈伤组织和叶片愈伤组织；
S3、芽诱导分化培养：将步骤S2所得茎段愈伤组织和叶片愈伤组织分别接种于第三培养基和第四培养基中进行继代培养至不定芽形成，分离出生长良好的丛芽，备用；
S4、生根培养：将步骤S3所得丛芽分成单芽，然后接种至生根培养基中进行培养直至生根，得带根苗；
S5、驯化炼苗：将步骤S4所得带根苗进行驯化炼苗，即得。
进一步地，步骤S1～S4中，所述培养的条件均作如下设置：ⅰ)温度为22～25℃；ⅱ)光照培养和暗培养交替进行，所述光照培养的光照强度为2000～3000lx,所述光照培养的光照时间为16h，所述暗培养的时间为8h；ⅲ)每两周更换一次培养基。
进一步地，步骤S4中，所述接种的密度为培养瓶每瓶接入4～6个单芽。
进一步地，步骤S5中，所述驯化炼苗的温度为22～25℃，所述驯化炼苗的时间为2d。
本发明的第三方面，提供前述培养基组合在马铃薯野生种S.commersonii的再生中的应用。
本发明的有益效果为：
1、本发明提供的再生培养基组合，对愈伤组织分化培养基和芽诱导分化培养基的植物激素组成进行了特别优化，能够高效诱导愈伤组织形成以及进一步诱导愈伤组织分化形成不定芽，试验显示，本发明实施例1的愈伤组织分化培养基对茎段和叶片的愈伤诱导率均为100％，芽诱导分化培养基诱导茎段的愈伤分化率为80％，诱导叶片的愈伤分化率为66.67％；
2、本发明提供的再生方法，从外植体取材到成苗仅需3个月，成活率高，再生周期短、效率高，特别适合于马铃薯野生种S.commersonii的快速育种和繁殖。
附图说明
图1为不同培养时间的茎段和叶片的不定芽分化情况。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地说明，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1一种马铃薯野生种S.commersonii的再生方法
S1、获取外植体：
将马铃薯野生种S.commersonii的顶芽接种于MS培养基，置于培养箱中，22℃，16h光照(光照强度2000lx)/8h黑暗交替培养，待植株长出后，选取苗龄28天的马铃薯野生种S.commersonii无菌苗，剪取长度为0.5cm的不带腋芽的茎段和0.5cm2大小的幼嫩叶片，备用；
S2、愈伤组织分化培养：
将剪取的茎段接种于MS+10.00mg/L ZT+0.01mg/L IAA+0.10mg/LGA3的培养基，叶片接种于MS+1.00mg/L IAA+1.50mg/L ZT的培养基，置于培养箱中，22℃，16h光照(光照强度2000lx)/8h黑暗交替培养，两周更换一次培养基，至愈伤组织形成，得茎段愈伤组织和叶片愈伤组织；
S3、芽诱导分化培养：
将茎段愈伤组织接种于MS+0.50mg/L IAA+3.00mg/L ZT的培养基，叶片愈伤组织接种于MS+1.00mg/L IAA+2.00mg/L ZT的培养基，置于培养箱中，22℃，16h光照(光照强度2000lx)/8h黑暗交替培养，两周更换一次培养基，至愈伤组织分化成芽，分离出生长良好的丛芽；
S4、生根培养：
将生长良好的丛芽分成单芽，然后接种于MS培养基，培养瓶每瓶接入4个单芽，置于22℃，16h光照(光照强度2000lx)/8h黑暗交替培养的培养箱生长，直至生根，得带根苗；
S5、驯化炼苗：
当带根苗高度达4cm时，打开培养瓶盖子，加入2mL的蒸馏水，培养箱中22℃炼苗2d，然后将带根苗取出，洗去根部培养基残渣，移栽至营养基质(前2d天覆盖薄膜保湿)，即得。
实施例2一种马铃薯野生种S.commersonii的再生方法
S1、获取外植体：
将马铃薯野生种S.commersonii的顶芽接种于MS培养基，置于培养箱中，25℃，16h光照(光照强度3000lx)/8h黑暗交替培养，待植株长出后，选取苗龄30天的马铃薯野生种S.commersonii无菌苗，剪取长度为1cm的不带腋芽的茎段和1cm2大小的幼嫩叶片，备用；
S2、愈伤组织分化培养：
将剪取的茎段接种于MS+10.00mg/L ZT+0.01mg/L IAA+0.10mg/LGA3的培养基，叶片接种于MS+1.00mg/L IAA+1.50mg/L ZT的培养基，置于培养箱中，25℃，16h光照(光照强度3000lx)/8h黑暗交替培养，两周更换一次培养基，至愈伤组织形成，得茎段愈伤组织和叶片愈伤组织；
S3、芽诱导分化培养：
将茎段愈伤组织接种于MS+0.50mg/L IAA+3.00mg/L ZT的培养基，叶片愈伤组织接种于MS+1.00mg/L IAA+2.00mg/L ZT的培养基，置于培养箱中，25℃，16h光照(光照强度3000lx)/8h黑暗交替培养，两周更换一次培养基，至愈伤组织分化成芽，分离出生长良好的丛芽；
S4、生根培养：
将生长良好的丛芽分成单芽，然后接种于MS培养基，培养瓶每瓶接入6个单芽，置于25℃，16h光照(光照强度3000lx)/8h黑暗交替培养的培养箱生长，直至生根，得带根苗；
S5、驯化炼苗：
当带根苗高度达5cm时，打开培养瓶盖子，加入2mL的蒸馏水，培养箱中25℃炼苗2d，然后将带根苗取出，洗去根部培养基残渣，移栽至营养基质(前2d天覆盖薄膜保湿)，即得。
试验例一愈伤组织分化培养基组成对诱导愈伤组织形成的影响
按实施例1步骤S1～S2获得茎段愈伤组织和叶片愈伤组织，其中，愈伤组织分化培养基的植物激素部分组成如表1所示，诱导愈伤组织形成结果如表2所示：
表1愈伤组织诱导培养基的植物激素部分组成(单位：mg/L)
表2不同激素配比对茎段和叶片愈伤组织诱导
注:不同字母表示差异显著(P<0.05),相同字母表示差异不显著。
从上述结果可以看出，1)茎段方面，采用CMSC1、CMSC2、CMSC5、CMSC6的植物激素配比处理效果较好，诱导率均达到50％以上，分别为85％、80％、71.67％、100％，以CMSC6的诱导率最优，为100％，即培养基组成为MS+10.00mg/L ZT+0.01mg/L IAA+0.10mg/L GA3时对于茎段诱导愈伤组织形成效果最好。2)叶片方面，采用CMLC1、CMLC2、CMLC3、CMLC4、CMLC5的植物激素配比处理效果较好，诱导率均达到50％以上，分别为96.67％、100％、76.67％、80％、96.67％，以CMLC2的诱导率最优，为100％，即培养基组成为MS+1.00mg/L IAA+1.50mg/L ZT时对于叶片诱导愈伤组织形成效果最好。
试验例二芽诱导分化培养基组成对诱导不定芽形成的影响
按实施例1步骤S1～S3获得不定芽，其中，芽诱导分化培养基的植物激素部分组成如表3所示，诱导不定芽形成结果如表4所示，实施例1不同培养时间的茎段和叶片的不定芽分化情况如图1所示：
表3芽诱导分化培养基的植物激素部分组成
| Medium | IAA(mg/L) | ZT(mg/L) |
| CMB1 | 1 | 2 |
| CMB2 | 0.5 | 2 |
| CMB3 | 1 | 3 |
| CMB4 | 0.5 | 3 |
表4不同激素配比对茎段和叶片不定芽诱导
注:不同字母表示差异显著(P<0.05),相同字母表示差异不显著。
从上述结果可以看出，采用CMB1、CMB2、CMB3、CMB4的激素配比处理茎段或叶片愈伤组织均能较佳的诱导形成不定芽，茎段分化率57.78％～80％，增值系数1.00～2.75，叶片分化率31.11％～66.67％，增值系数1.5～3，其中，以CMB4的激素配比(3mg/L ZT、0.5mg/L IAA)处理茎段和CMB1的激素配比(2mg/L ZT、1mg/L IAA)处理叶片诱导不定芽形成效果最好。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种马铃薯野生种S.commersonii的再生培养基组合，其特征在于，其包括无菌苗培养基、愈伤组织分化培养基、芽诱导分化培养基和生根培养基；
所述无菌苗培养基和生根培养基均为MS培养基；
所述愈伤组织分化培养基由第一培养基和第二培养基组成，所述第一培养基用于诱导马铃薯野生种S.commersonii无菌苗的茎段形成茎段愈伤组织，所述第二培养基用于诱导马铃薯野生种S.commersonii无菌苗的叶片形成叶片愈伤组织；所述第一培养基以MS培养基为基础培养基，还包括以下质量浓度的植物激素组分：0～10mg/L ZT、0～0.01mg/LIAA、0～0.1mg/LGA3、0～0.2mg/L 6-BA和0～3mg/L NAA；所述第二培养基以MS培养基为基础培养基，还包括以下质量浓度的植物激素组分：0～1.5mg/L ZT、0～2mg/LIAA、0～1.5mg/L 6-BA、0～0.5mg/L NAA和0～1.5mg/L 2,4-D；
所述芽诱导分化培养基由第三培养基和第四培养基组成，所述第三培养基用于诱导所述茎段愈伤组织形成不定芽，所述第四培养基用于诱导所述叶片愈伤组织形成不定芽；所述第三培养基以MS培养基为基础培养基，还包括以下质量浓度的植物激素组分：2～3mg/LZT、0.5～1mg/L IAA；所述第四培养基以MS培养基为基础培养基，还包括以下质量浓度的植物激素组分：2～3mg/L ZT、0.5～1mg/L IAA。
2.根据权利要求1所述马铃薯野生种S.commersonii的再生培养基组合，其特征在于，所述第一培养基包括以下质量浓度的植物激素组分：10mg/L ZT、0.01mg/L IAA、0.1mg/LGA3。
3.根据权利要求1所述马铃薯野生种S.commersonii的再生培养基组合，其特征在于，所述第二培养基包括以下质量浓度的植物激素组分：1.5mg/L ZT、1mg/L IAA。
4.根据权利要求1所述马铃薯野生种S.commersonii的再生培养基组合，其特征在于，所述第三培养基包括以下质量浓度的植物激素组分：3mg/LZT、0.5mg/L IAA。
5.根据权利要求1所述马铃薯野生种S.commersonii的再生培养基组合，其特征在于，所述第四培养基包括以下质量浓度的植物激素组分：2mg/LZT、1mg/L IAA。
6.一种采用权利要求1-5之一所述培养基组合进行马铃薯野生种S.commersonii的再生方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、获取外植体：于无菌条件下，将马铃薯野生种S.commersonii的顶芽接种于无菌苗培养基中进行培养，得马铃薯野生种S.commersonii无菌苗；选取苗龄25～30天的所述马铃薯野生种S.commersonii无菌苗，剪取0.5～1cm长度不带腋芽的茎段和0.5～1cm2大小幼嫩叶片，备用；
S2、愈伤组织分化培养：将步骤S1所得茎段和叶片分别接种于第一培养基和第二培养基中进行继代培养至愈伤组织形成，得茎段愈伤组织和叶片愈伤组织；
S3、芽诱导分化培养：将步骤S2所得茎段愈伤组织和叶片愈伤组织分别接种于第三培养基和第四培养基中进行继代培养至不定芽形成，分离出生长良好的丛芽，备用；
S4、生根培养：将步骤S3所得丛芽分成单芽，然后接种至生根培养基中进行培养直至生根，得带根苗；
S5、驯化炼苗：将步骤S4所得带根苗进行驯化炼苗，即得。
7.根据权利要求6所述马铃薯野生种S.commersonii的再生方法，其特征在于，步骤S1～S4中，所述培养的条件均作如下设置：ⅰ)温度为22～25℃；ⅱ)光照培养和暗培养交替进行，所述光照培养的光照强度为2000～3000lx,所述光照培养的光照时间为16h，所述暗培养的时间为8h；ⅲ)每两周更换一次培养基。
8.根据权利要求6所述马铃薯野生种S.commersonii的再生方法，其特征在于，步骤S4中，所述接种的密度为培养瓶每瓶接入4～6个单芽。
9.根据权利要求6所述马铃薯野生种S.commersonii的再生方法，其特征在于，步骤S5中，所述驯化炼苗的温度为22～25℃，所述驯化炼苗的时间为2d。
10.权利要求1-5之一所述培养基组合在马铃薯野生种S.commersonii的再生中的应用。
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