CN113430223A - 一种马铃薯叶片的快速遗传转化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种马铃薯叶片的快速遗传转化方法，属于基因工程技术领域；本发明提供的快速遗传转化方法，以无菌Desiree马铃薯叶片为外植体，经过重组菌株侵染外植体材料、叶片材料的共培养、愈伤的诱导及增殖、诱导不定芽分化以及不定芽的生根筛选等步骤，最终获得完整的植株；本发明直接选用MS作为侵染前重组载体的培养液，有助于载体适应MS的培养环境，从而增加了对外植体的侵染效率，且相比于直接采用茎段和薯块作为外植体材料而言，本发明不会出现腋芽或薯片上芽眼部位长出假阳性幼苗的影响，从而增加了转化效率，缩短了转化时间。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种马铃薯叶片的快速遗传转化方法。
背景技术
马铃薯(Solanum tuberosum L.)属于茄科一年生草本植物，是重要的粮菜兼用作物，不仅适应性强、生长周期短，而且耐贮藏。
高效的马铃薯遗传转化体系是研究人员进行基因功能验证及品种改良的基础。根癌农杆菌介导的遗传转化法是目前植物转基因技术的基本方法，使用范围广泛，被应用于植物的叶盘，茎段，子叶，愈伤组织等材料中；马铃薯的转化中常用的材料包括：叶盘，茎段，块茎等不同类型。农杆菌介导的马铃薯遗传转化过程受到多个因素影响，如外植体材料的品种及类型选择、农杆菌的类型及侵染浓度、侵染时间。
外植体经脱分化后形成愈伤组织，可再次分化出新的植株，愈伤组织的诱导及再分化与外植体的选择和激素配伍有关，外植体的选择决定了细胞可再次分化的可能性，适宜的激素比例可促使愈伤细胞重新分化成植株。对于外植体选择方面，传统技术最常使用的是茎段、块茎、叶片靠近叶柄部分，但是存在以下问题：1.遗传转化所需时间漫长；2.转化过程中愈伤组织分化困难；3.利用薯块微型作为转化材料时材料本身培养时间久；4.茎段作为材料时易叶腋处易长出假阳性植株；基于以上问题，我们提供一种新的马铃薯叶片的快速遗传转化方法。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种马铃薯叶片的快速遗传转化方法，以无菌Desiree马铃薯叶片为外植体，能有效地缩短遗传转化时间，可在较短时间内获得大量幼苗，提高了侵染效率和转化效率。
本发明采用的技术方案如下：
为实现上述目的，本发明提供一种马铃薯叶片的快速遗传转化方法，包括以下步骤：
S1、马铃薯无菌植株培养：于无菌操作台中剪取长度1cm的马铃薯茎段，竖直插入3％MS中，光照培养箱中培养18-22d作为后续材料；
S2、农杆菌重组菌株的活化：将提前构建好的含目的基因重组菌株在含卡那霉素的LB培养基平板上培养36-48h活化后待用；
S3、外植体的准备：剪取S1中培养好的幼叶，去掉叶片尖端和叶柄部位，将其切成0.5cm×0.5cm的方形，置于3％MS平板上待用；
S4、重组菌株侵染外植体材料：挑取S2中活化好的单一菌株，接种于30mL IM-D液体培养基中继续培养6-8h，培养结束后的菌液加入乙酰丁香酮冰上放置1h，将S3中准备好的叶片材料放置于菌液中侵染10-40min；
S5、叶片材料的共培养：将S4中侵染完成的叶片材料用无菌滤纸吸干水分，按正面朝上均匀摆放在IM-D固体培养基上，每个培养基摆放20片，共培养2-3d，培养条件为23℃，8h黑暗/16h光照循环，光照强度15000xL；
S6、愈伤的诱导及增殖：将S5中培养后的叶片材料转移至IPCM培养基平板上，正面朝上，培养条件与S5相同，培养6d，并加入抗生素抑制农杆菌；
S7、诱导不定芽分化：将S6中完成愈伤诱导的叶片转移至ADM-G培养基平板上，正面朝上，培养条件与S5相同，从转移至ADM-G平板开始计算，每隔14d换一次平板，直至分化出幼芽；
S8、不定芽的生根筛选：待S7中已分化出的幼芽生长14d后剪取1-2cm的茎段，竖直插入含抗生素的MS-H培养基上培养。
作为优选，所述步骤S4中，菌液浓度为OD＝0.3。
作为优选，所述步骤S4中，IM-D液体培养基成分包括：MS粉、2-吗啉乙磺酸、乙酰丁香酮和2，4-二氯苯氧乙酸；调节pH为5.8。
作为优选，所述步骤S4中，侵染期间以50r/min的转速搅拌进行悬浮培养。
作为优选，所述步骤S5中，IM-D固体培养基成分包括：MS粉、蔗糖、琼脂粉、2-吗啉乙磺酸、乙酰丁香酮和2，4-二氯苯氧乙酸；调节pH为5.8。
作为优选，所述S6中，IPCM培养基成分包括：MS粉、蔗糖、琼脂粉、2-吗啉乙磺酸、玉米素、2，4-二氯苯氧乙酸、6-苄氨基嘌呤，抗生素Cef；调节pH为5.8。
作为优选，所述S7中，ADM-G培养基成分包括：MS粉、蔗糖、琼脂粉、2-吗啉乙磺酸、玉米素、赤霉素、抗生素Cef和Kan；调节pH为5.8。
作为优选，所述S8中，MS-H培养基成分包括：MS粉、蔗糖、琼脂粉，抗生素Cef和Hyg；调节pH为5.8。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明提供的快速遗传转化方法直接选用MS作为侵染前重组载体的培养液，相对于传统的方法中利用LB培养基培养重组载体，本发明有助于载体适应MS的培养环境，从而增加了对外植体的侵染效率。
2、本发明以生长3周左右的无菌Desiree马铃薯叶片为外植体，通过愈伤的诱导增值、不定芽的诱导培养，利用适宜的激素复配培养基，有利于细胞中的分裂和分化从而提升不定芽的分化效率，通过使用本发明的激素复配培养基，可以有效地缩短遗传转化时间，可在较短时间内获得大量幼苗，这有助于科研工作者快速获得目标突变株，且可以为相关企业开发利用带来良好的经济效益。
3、本发明相对于利用薯块作为转化外植体，节省了3个月左右的结薯时间，叶片材料的准备仅需要18d-35d，不受薯块材料的影响且只需要少量的植株作为外植体材料，从而节省了材料培养所需的空间和时间；本发明从开始转化到分化出芽最快3周时间，极大的缩短了马铃薯遗传转化中面临的周期漫长的问题。
4.本发明提供的叶片转化相比于直接采用茎段和薯块作为外植体材料而言，本发明不会出现腋芽或薯片上芽眼部位长出假阳性幼苗的影响，从而增加了转化效率。
附图说明
本发明将通过例子并参照附图的方式说明，其中：
图1是本发明实施例1Desiree叶片转化法中的共培养过程图；
图2是本发明中Desiree叶片转化法与对照组的愈伤诱导和增殖过程图；
图3是本发明中Desiree叶片转化法与对照组的不定芽分化结果图；
图4是本发明实施例1Desiree叶片转化法中不定芽的生根筛选过程图；
图5是以块茎作为外植体的遗传转化结果图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供的一种马铃薯叶片的快速遗传转化方法，主要包括以下步骤：
S1、马铃薯无菌植株培养：于无菌操作台中剪取长度1cm的马铃薯茎段，竖直插入3％MS(成分为MS粉，加入蔗糖30g/L和琼脂6.5g/L)中，光照培养箱中培养18-22d作为后续材料；
S2、农杆菌重组菌株的活化：将提前构建好的含目的基因重组菌株在含卡那霉素(Kan)的LB培养基平板上培养36-48h活化后待用；
S3、外植体的准备：剪取S1中培养好的幼叶，所选叶片需靠近顶部较大者为佳，但不宜选取与芽尖相近的叶片，将选好的叶片去掉叶片尖端和叶柄部位，将其切成0.5cm×0.5cm的方形，置于3％MS(成分为MS粉，加入蔗糖30g/L和琼脂6.5g/L)平板上待用；
S4、重组菌株侵染外植体材料：挑取S2中活化好的单一菌株，接种于30mL IM-D液体培养基中继续培养6-8h，培养结束后的菌液加入乙酰丁香酮(ACE)冰上放置1h，将S3中准备好的叶片材料放置于菌液中侵染10-40min；
S5、叶片材料的共培养：将S4中侵染完成的叶片材料用无菌滤纸吸干水分，按正面朝上均匀摆放在IM-D固体培养基上，每个培养基摆放20片，共培养2-3d，培养条件为23℃，8h黑暗/16h光照循环，光照强度15000xL；
S6、愈伤的诱导及增殖：将S5中培养后的叶片材料转移至IPCM培养基平板上，正面朝上，培养条件与S5相同，培养6d，并加入抗生素抑制农杆菌；
S7、诱导不定芽分化：将S6中完成愈伤诱导的叶片转移至ADM-G培养基平板上，正面朝上，培养条件与S5相同，从转移至ADM-G平板开始计算，每隔14d换一次平板，直至分化出幼芽；
S8、不定芽的生根筛选：待S7中已分化出的幼芽生长14d后剪取1-2cm左右的茎段，竖直插入含抗生素的MS-H培养基上培养。
作为优选，所述步骤S4中，菌液浓度为OD＝0.3时，侵染时间为30min。
作为优选，所述步骤S4中，IM-D液体培养基成分包括：MS粉、2-吗啉乙磺酸(MES)、乙酰丁香酮(ACE)和2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)；调节pH为5.8。
作为优选，所述步骤S4中，侵染期间以50r/min的转速搅拌进行悬浮培养，可以提高侵染效率。
作为优选，所述步骤S5中，IM-D固体培养基成分包括：MS粉、蔗糖、琼脂粉、2-吗啉乙磺酸(MES)、乙酰丁香酮(ACE)和2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)；调节pH为5.8。
作为优选，所述S6中，IPCM培养基(愈伤诱导培养基)成分包括：MS粉、蔗糖、琼脂粉、2-吗啉乙磺酸(MES)、玉米素(ZT)、2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、6-苄氨基嘌呤(6-BA)，抗生素噻孢霉素(Cef)；调节pH为5.8。
作为优选，所述S7中，ADM-G培养基(分化培养基)成分包括：MS粉、蔗糖、琼脂粉、2-吗啉乙磺酸(MES)、玉米素(ZT)、赤霉素(GA3)、抗生素噻孢霉素(Cef)和卡那霉素(Kan)；调节pH为5.8。
作为优选，所述S8中，MS-H培养基(筛选培养基)成分包括：MS粉、蔗糖、琼脂粉，抗生素噻孢霉素(Cef)和潮霉素(Hyg)；调节pH为5.8。
本发明中所提及的培养基中，所使用到的MS粉为市售1/2MS培养基(不含琼脂和蔗糖)，品牌Solarbio，货号：M8526；培养基的灭菌条件均为：在温度为121℃、压力为101KPa的条件下灭菌25min，待培养基冷却到60℃时再加入抗生素。
实施例1
本实施例提供一种马铃薯叶片的快速遗传转化方法，主要包括以下步骤：
S1、马铃薯无菌植株培养：于无菌操作台中剪取长度1cm的野生型Desiree马铃薯茎段，竖直插入3％MS(成分为MS粉，加入蔗糖30g/L和琼脂6.5g/L)中，光照培养箱中培养21d作为后续材料；
S2、农杆菌重组菌株的活化：将提前构建好的含目的基因重组菌株在含卡那霉素(Kan)的LB培养基平板上培养48h活化后待用；
S3、外植体的准备：剪取S1中培养好的幼叶，所选叶片需靠近顶部较大者为佳，但不宜选取与芽尖相近的叶片，将选好的叶片去掉叶片尖端和叶柄部位，将其切成0.5cm×0.5cm的方形，置于3％MS(成分为MS粉，加入蔗糖30g/L和琼脂6.5g/L)平板上待用；
S4、重组菌株侵染外植体材料：挑取S2中活化好的单一菌株，接种于30mL IM-D液体培养基中继续培养7h，培养结束后的菌液加入乙酰丁香酮(ACE)冰上放置1h，将S3中准备好的叶片材料放置于菌液中侵染30min；
其中，IM-D液体培养基成分为：MS粉+MES+ACE+2,4-D；调节培养基pH为5.8；所述菌液浓度为OD＝0.3，且侵染期间以50r/min的转速搅拌进行悬浮培养，可以提高侵染效率；
S5、叶片材料的共培养：将S4中侵染完成的叶片材料用无菌滤纸吸干水分，按正面朝上均匀摆放在IM-D固体培养基上，每个培养基摆放20片，共培养2d，培养条件为23℃，8h黑暗/16h光照循环，光照强度15000xL，如图1所示，为Desiree叶片转化法中的共培养过程图；
其中，IM-D固体培养基成分为：MS粉4.24g/L+蔗糖20g/L+琼脂粉6.5g/L+MES200mg/L+ACE 0.3mg/L+2,4-D 2mg/L；调节培养基pH为5.8。
S6、愈伤的诱导及增殖：将S5中培养后的叶片材料转移至IPCM培养基平板上，并加入噻孢霉素(Cef)和卡那霉素(Kan)抑制农杆菌，正面朝上，培养条件与S5相同，培养6d；其中，IPCM培养基成分为：MS粉+蔗糖20g/L+琼脂粉6.5g/L+MES 200mg/L+ZT 0.5mg/L+2,4-D2mg/L+6-BA 1mg/L；调节培养基pH为5.8。
如图2所示，为Desiree叶片转化法与对照组的愈伤诱导和增殖过程图，其中，对照组以实验室原有的块茎转化法中激素配方作为对照，进行对比试验，对照组配方为：MS粉+蔗糖20g/L+琼脂粉6.5g/L+IAA 1mg/L+GA3 0.2mg/L+6-BA 0.5mg/L+ZT 2mg/L+Kan 50mg/L+羧苄青霉素(Carb)500mg/L。
S7、诱导不定芽分化：将S6中完成愈伤诱导的叶片转移至ADM-G培养基平板上，正面朝上，培养条件与S5相同，其中，ADM-G培养基成分为：MS粉+蔗糖20g/L+琼脂粉6.5g/L+MES 200mg/L+ZT 0.8mg/L+GA3 180mg/L+Cef 200mg/L+Kan 100mg/L；调节pH为5.8；从转移至ADM-G平板开始计算，每隔7d换一次平板，培养15d后可见愈伤组织部位形成较多胚状体，继续培养逐渐出现幼芽，幼芽的出现发生在诱导不定芽分化21d后。
如图3所示，为Desiree叶片转化法与对照组的不定芽分化结果图，箭头所示为培养25d分化产生的不定芽，由此可见，在相同的培养环境中，使用本发明的ADM-G分化培养基能够有效地缩短分化出芽时间。
S8、不定芽的生根筛选：待S7中已分化出的幼芽生长14d后剪取1-2cm左右的茎段，竖直插入含抗生素的MS-H培养基上培养；其中，MS-H培养基成分为：MS粉+蔗糖20g/L+琼脂粉6.5g/L+Cef 200mg/L+Hyg 50mg/L；调节pH为5.8。
如图4所示，为Desiree叶片转化法中不定芽的生根筛选过程图，a为刚接入培养基中的幼芽；b为在含抗生素的培养基上培养10d后正常生根的幼芽；c为最终获得的植株培养14d时的结果。
此外，还以块茎作为外植体进行对照试验，其他实验步骤与实施例1相同，如图5为以块茎作为外植体的遗传转化结果图，a、b、c分别为共培养2d，愈伤的诱导及增殖10d，诱导不定芽分化35d的结果图，从图5可以看出，以块茎作为外植体时，不定芽分化时间很长，幼芽的出现发生在诱导不定芽分化30d左右，在不定芽分化35d时仅可见少量且短的不定芽，而本发明实施例1中幼芽的出现发生在诱导不定芽分化21d左右，到25d时分化产生的不定芽量多且长。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。
Claims (8)
1.一种马铃薯叶片的快速遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、马铃薯无菌植株培养：于无菌操作台中剪取长度1cm的马铃薯茎段，竖直插入3％MS中，光照培养箱中培养18-22d作为后续材料；
S2、农杆菌重组菌株的活化：将提前构建好的含目的基因重组菌株在含卡那霉素的LB培养基平板上培养36-48h活化后待用；
S3、外植体的准备：剪取S1中培养好的幼叶，去掉叶片尖端和叶柄部位，将其切成0.5cm×0.5cm的方形，置于3％MS平板上待用；
S4、重组菌株侵染外植体材料：挑取S2中活化好的单一菌株，接种于30mL IM-D液体培养基中继续培养6-8h，培养结束后的菌液加入乙酰丁香酮冰上放置1h，将S3中准备好的叶片材料放置于菌液中侵染10-40min；
S5、叶片材料的共培养：将S4中侵染完成的叶片材料用无菌滤纸吸干水分，按正面朝上均匀摆放在IM-D固体培养基上，每个培养基摆放20片，共培养2-3d，培养条件为23℃，8h黑暗/16h光照循环，光照强度15000xL；
S6、愈伤的诱导及增殖：将S5中培养后的叶片材料转移至IPCM培养基平板上，正面朝上，培养条件与S5相同，培养6d，并加入抗生素抑制农杆菌；
S7、诱导不定芽分化：将S6中完成愈伤诱导的叶片转移至ADM-G培养基平板上，正面朝上，培养条件与S5相同，从转移至ADM-G平板开始计算，每隔14d换一次平板，直至分化出幼芽；
S8、不定芽的生根筛选：待S7中已分化出的幼芽生长14d后剪取1-2cm的茎段，竖直插入含抗生素的MS-H培养基上培养。
2.根据权利要求1所述的一种马铃薯叶片的快速遗传转化方法，其特征在于，所述S4中，菌液浓度为OD＝0.3。
3.根据权利要求1所述的一种马铃薯叶片的快速遗传转化方法，其特征在于，所述S4中，IM-D液体培养基成分包括：MS粉、2-吗啉乙磺酸、乙酰丁香酮和2，4-二氯苯氧乙酸；调节pH为5.8。
4.根据权利要求1所述的一种马铃薯叶片的快速遗传转化方法，其特征在于，所述S4中，侵染期间以50-100r/min的转速搅拌进行悬浮培养。
5.根据权利要求1所述的一种马铃薯叶片的快速遗传转化方法，其特征在于，所述S5中，IM-D固体培养基成分包括：MS粉、蔗糖、琼脂粉、2-吗啉乙磺酸、乙酰丁香酮和2，4-二氯苯氧乙酸；调节pH为5.8。
6.根据权利要求1所述的一种马铃薯叶片的快速遗传转化方法，其特征在于，所述S6中，IPCM培养基成分包括：MS粉、蔗糖、琼脂粉、2-吗啉乙磺酸、玉米素、2，4-二氯苯氧乙酸、6-苄氨基嘌呤，抗生素Cef；调节pH为5.8。
7.根据权利要求1所述的一种马铃薯叶片的快速遗传转化方法，其特征在于，所述S7中，ADM-G培养基成分包括：MS粉、蔗糖、琼脂粉、2-吗啉乙磺酸、玉米素、赤霉素、抗生素Cef和Kan；调节pH为5.8。
8.根据权利要求1所述的一种马铃薯叶片的快速遗传转化方法，其特征在于，所述S8中，MS-H培养基成分包括：MS粉、蔗糖、琼脂粉，抗生素Cef和Hyg；调节pH为5.8。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116491417A (zh) * | 2023-03-29 | 2023-07-28 | 云南师范大学 | 马铃薯野生种S. commersonii的再生方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2469139A1 (en) * | 2004-06-22 | 2005-12-22 | Santosh Misra | Potato regeneration system and use thereof |
| CN101790935A (zh) * | 2010-03-31 | 2010-08-04 | 四川农业大学 | 马铃薯离体培养一步成苗培养基及其优化方法及成苗方法 |
-
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2469139A1 (en) * | 2004-06-22 | 2005-12-22 | Santosh Misra | Potato regeneration system and use thereof |
| CN101790935A (zh) * | 2010-03-31 | 2010-08-04 | 四川农业大学 | 马铃薯离体培养一步成苗培养基及其优化方法及成苗方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| MAHMOUD M’HAMDI 等: "Ribosome Inactivating Protein of barley enhanced resistance to Rhizoctonia solani in transgenic potato cultivar ‘Desirée’ in greenhouse conditions", AGRON. SOC. ENVIRON., 31 December 2013 (2013-12-31), pages 21 - 22 * |
| MAHMOUD M’HAMDI等: "Ribosome Inactivating Protein of barley enhanced resistance to Rhizoctonia solani in transgenic potato cultivar ‘Desirée’ in greenhouse conditions", BIOTECHNOL. AGRON. SOC. ENVIRON., vol. 17, no. 1, pages 21 - 22 * |
| 辛翠花;郭江波;黄三文;屈冬玉;: "马铃薯Desiree遗传转化体系的优化及转基因植株的获得", 中国蔬菜, no. 06, 15 March 2011 (2011-03-15), pages 1 - 1 * |
| 郭阳鑫等: "马铃薯离体再生与遗传转化研究进展", 安徽农业科学, vol. 44, no. 36, pages 29 - 32 * |
| 闫建俊等: "根癌农杆菌介导的马铃薯遗传转化的一些影响因素", 山西农业科学, vol. 41, no. 6, pages 532 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116491417A (zh) * | 2023-03-29 | 2023-07-28 | 云南师范大学 | 马铃薯野生种S. commersonii的再生方法 |
| CN116491417B (zh) * | 2023-03-29 | 2024-04-16 | 云南师范大学 | 马铃薯野生种S.commersonii的再生方法 |
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