CN113396821A

CN113396821A - 一种农杆菌介导转化生菜组织培养方法

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Publication number: CN113396821A
Application number: CN202110659231.3A
Authority: CN
Inventors: 武永军; 张翰卿; 杨振超; 梅延豪; 刘齐
Original assignee: Yangling Lingyu Modern Agriculture Research Institute Co ltd; Northwest A&F University
Current assignee: Yangling Lingyu Modern Agriculture Research Institute Co ltd; Northwest A&F University
Priority date: 2021-06-15
Filing date: 2021-06-15
Publication date: 2021-09-17

Abstract

本发明提供了一种农杆菌介导转化生菜组织培养方法，属于农杆菌介导植物组织培养技术领域。本发明包括用农杆菌菌液侵染生菜无菌苗的外植体，将侵染后的生菜外植体相继置于愈伤‑发芽培养基、生根培养基上进行诱导，驯化移栽；所述愈伤‑发芽培养基组成为：蔗糖25.0‑35.0g/L+琼脂7.0‑8.0g/L+IAA 1.0‑1.5mg/L+6‑BA 0.5‑0.9mg/L。本发明通过特定的愈伤‑发芽培养基，省略了共培养过程且不必添加抗生素，缩短了组培周期，保证了生菜组织培养过程中高发芽率、高生根率、低污染率和低褐化率。

Description

一种农杆菌介导转化生菜组织培养方法

技术领域

本发明属于农杆菌介导植物组织培养技术领域，尤其涉及一种农杆菌介导转化生菜组织培养方法。

背景技术

生菜(Lactuca sativa.L.)属菊科莴苣属莴苣种中的叶用类型，是叶用莴苣的俗称，为一、二年生草本植物。生菜极富营养，含有抗氧化物、胡萝卜素及维生素B₁、B₂、B₆和V_C、V_E，它还含有丰富的微量元素，如钙、磷、钾、钠、镁及少量的铜、铁、锌，此外，还含有膳食纤维素，茎叶的乳状汁液还含有大量的有机物，如糖、有机酸、蛋白质、苦苣素等。

生物技术在生菜育种中得到广泛应用，其中，在生菜上的转基因方法有农杆菌介导法和电激法等，其中农杆菌介导法为主要的方法。稳定的植物组织和细胞培养再生系统是利用农杆菌介导转化法进行植物转基因的重要前提。在现有的农杆菌介导生菜组织培养体系中，常经过无菌苗培养、农杆菌侵染、暗环境共培养2-3天、诱导愈伤组织培养、诱导发芽培养、生根培养、移栽过程。如CN106794570A公开了一种农杆菌介导生菜遗传转化培养基体系，将生菜子叶放到共培养培养基中在28℃黑暗培养2天，再进行诱导愈伤组织、诱导发芽、生根培养；罗淑萍等(2005年)公开了一种根癌农杆菌介导的叶用莴苣基因转化系统的建立，同样将不定芽在28℃黑暗条件下培养3 天，再进行不定芽培养。现有研究通常认为被感染的受体材料在用抗生素筛选除菌前与根癌农杆菌进行共培养是根癌农杆菌T-DNA转化和整合到植物染色体的关键时期，其共培养的时间长短则直接影响到目的基因的整合及转化细胞的数量，从而影响遗传转化率。然而，共培养时间过短，T-DNA转移过程不能完成；延长共培养时间，农杆菌在培养基及受体材料表面会过分生长，又不利于植物外植体的存活和随后抗性愈伤组织筛选时对根癌农杆菌的抑制。

此外，采用农杆菌介导转化法，在培养过程中必须在筛选培养基添加抗生素以抑制农杆菌生长，但不同的抗生素对植物转化效率也有影响。用于抑制根癌农杆菌生长的抗生素如羧苄青霉素、头孢霉素等会对某些植物的转化效率及外植体的生长和分化产生影响。如羧苄青霉素可刺激愈伤组织的增殖，而头孢霉素则对杂种杨的愈伤组织形成有明显的抑制作用。

因此，现有的农杆菌介导的生菜组织培养过程受到的影响因素较多，如共培养时间、共培养条件、抗生素的选择与用量等，不易人工调控，容易对组织培养过程产生负面影响，且培养周期过长，不利于育种工作的进行。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种农杆菌介导转化生菜组织培养方法，直接利用特定愈伤-发芽培养基对侵染生菜外植体进行培养，省略了共培养过程，缩短生菜组织培养周期，且无需添加抗生素，提升愈伤组织诱导发芽率，减少褐化率。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种农杆菌介导转化生菜组织培养方法，用农杆菌菌液侵染生菜无菌苗的外植体，将侵染后的生菜外植体相继置于愈伤-发芽培养基、生根培养基上进行诱导，驯化移栽；所述愈伤-发芽培养基组成为：蔗糖25.0-35.0g/L+ 琼脂7.0-8.0g/L+IAA 1.0-1.5mg/L+6-BA 0.5-0.9mg/L。

优选的是，所述生菜无菌苗苗龄为5-8天。

优选的是，所述生菜外植体为叶片。

优选的是，所述农杆菌菌液OD₆₀₀＝0.3-0.5。

优选的是，所述侵染时间为5-10分钟。

优选的是，所述愈伤组织诱导条件为：温度为25±3℃，光照周期为 16L/8D，光照强度为200-300umol·m^-2·s^-1。

优选的是，所述愈伤组织诱导至长出2cm以上芽苗时转移至生根培养基培养。

优选的是，所述生根培养基组成为：蔗糖25.0-35.0g/L+琼脂7.0-8.0g/L。

优选的是，所述生根培养条件为：温度为25±2℃，光照周期为16L/8D，光照强度为200-300umol·m^-2·s^-1。

优选的是，所述驯化移栽的基质为体积比为3-5:1的土和蛭石。

相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明通过调整愈伤-发芽培养基的生长素的种类和浓度比例，可提升农杆菌介导转化生菜组织培养过程中的发芽率和生根率。

(2)利用本发明的农杆菌介导转化生菜组织培养方法，在组织培养过程中，即便培养基不添加抗生素，同样能够保持生菜组织培养的低污染率(高抑菌率)，且褐化率低。

(3)本发明省略了传统农杆菌介导转化植物组织培养的共培养过程，愈伤培养基与发芽培养基使用混合培养基，不用中途更换，大大减少了污染率，周期缩短了30天，为步骤简化、周期缩短的成熟高效组培体系。

具体实施方式

本发明提供了一种农杆菌介导转化生菜组织培养方法，包括：培育生菜无菌苗获得外植体，农杆菌菌液侵染外植体，将侵染后的生菜外植体相继置于愈伤-发芽培养基、生根培养基上进行诱导，驯化移栽。

作为一种可实施方式，本发明生菜无菌苗的培育过程如下：

将生菜种子置于烧杯中，用自来水浸种2h，然后在超净工作台中先用75％乙醇消毒30s，无菌蒸馏水冲洗2次，再用0.1％升汞消毒3-5min，无菌蒸馏水冲6次，用无菌滤纸片吸干种子表面水分。将处理过的种子分别种植于培养基(MS或1/2MS培养基，30g/L蔗糖，7.5g/L琼脂，pH5.8，121℃， 110Kpa下灭菌25min)上，于光照培养室培养，温度25±1℃、光照周期为 16L/8D，光照强度200umol·m^-2·s^-1。

本发明优选苗龄5-8天的生菜无菌苗，将叶片切至大小0.8-1.2cm²，作为外植体；进一步优选苗龄7天的生菜无菌苗，叶片切至大小1cm²作为外植体。

根癌农杆菌介导法是植物基因转化中施用最普遍的方法之一，其Ti质粒具有将DNA整合到植物染色体上，并使之与植物内源基因同步表达的能力。本发明对T-DNA的筛选、农杆菌菌株筛选、Ti质粒的构建及农杆菌培养等步骤没有特殊限定，采用本领域常用手段即可。

本发明主要涉及农杆菌菌液的制备及侵染过程。农杆菌菌液浓度过低，侵染时间过短，进行转化的外植体因为不能附着足够的菌体，从而导致转化率较低；农杆菌菌液浓度过高，侵染时间过长，农杆菌侵染过度，不利于外植体成活及后续的组织培养过程。本发明优选农杆菌菌液OD₆₀₀＝0.3-0.5，侵染时间为5-10分钟；进一步优选农杆菌菌液OD₆₀₀＝0.5，侵染时间7-9分钟。

本发明提供了一种农杆菌介导转化生菜组织培养的愈伤-发芽培养基，组成为蔗糖25.0-35.0g/L+琼脂7.0-8.0g/L+IAA 1.0-1.5mg/L+6-BA 0.5-0.9mg/L。在植物组织培养过程中，需要添加外源激素，不同种类、不同浓度外源激素对芽诱导、芽增殖、生根的影响不同。本发明以IAA 1.0-1.5mg/L+6-BA 0.5-0.9mg/L作为农杆菌介导转化生菜组织培养诱导、发芽阶段外源激素，能够明显提升发芽率。另外，将愈伤组织诱导阶段和发芽培养阶段统一在愈伤-发芽培养基培养，在愈伤组织诱导和发芽阶段不必中途更换，大大减少了污染率，组织培养周期缩短了30天。进一步优选的是，本发明愈伤-发芽培养基组成为蔗糖30.0g/L+琼脂7.5g/L+IAA 1.0mg/L+6-BA 0.7mg/L。

作为一种可实施方式，本发明愈伤-发芽培养基由以下步骤制得：

培养基中添加蔗糖和琼脂，在121℃，110Kpa灭菌锅灭菌20-30min，待培养基温度降至40-60℃加入IAA和6-BA，得到愈伤-发芽培养基。

在植物组织培养中，温度、光照等各种环境条件会影响组织培养的生长和发育，植物组织培养在最适宜的温度下生长分化才能更好，温度过高或过低都会影响生长，且不同培养目标的培养温度也不相同。光照条件，即光强、光周期及光质也影响着细胞的增殖和器官的分化。本发明优选芽诱导培养条件为：温度为25±3℃，光照周期为16L/8D，光照强度为200-300umol·m^-2·s^-1；进一步优选的是，温度为25℃，光照周期为16L/8D，光照强度为250umol·m^-2·s^-1。

作为一种可实施方式，本发明进行愈伤-发芽培养基培养时，将侵染的叶片外植体置于培养基上，叶片正面朝上，保证伤口与培养基充分接触。

待愈伤-发芽培养阶段完成，将长至2cm以上的芽苗转接至生根培养基上，进行生根培养。本发明生根培养基组成为蔗糖25.0-35.0g/L+琼脂7.0-8.0g/L；进一步优选的是蔗糖30.0g/L+琼脂7.5g/L。优选生根培养阶段的培养条件为：温度为25±2℃，光照周期为16L/8D，光照强度为 200-300umol·m^-2·s^-1；进一步优选的是温度为25℃，光照周期为16L/8D，光照强度为250umol·m^-2·s^-1。

组培再生苗虽然具有一定的光合作用，但长期在高湿、弱光、高CO₂浓度、恒温、异养条件下生长，其组织分化不完善，光合自养能力弱，适应能力差。本发明对生根试管苗进行炼苗驯化和移栽，炼苗过程可逐步改变其生长环境使其组织发育完全，以适应外界环境。本发明优选在生根培养3-4 周后，挑选生根粗壮苗进行开盖驯化培养1-3天，驯化移栽的基质为体积比为3-5:1的土和蛭石；进一步优选的是，驯化移栽基质为体积比3:1的土和蛭石。更优选的是，驯化移栽条件为：温度为25±2℃、光照周期为16L/8D、光照强度为200-300umol·m^-2·s^-1。作为一种可实施方式，本发明将生根苗移栽至填满移栽基质的育苗盆，从盆底浇水，让水倒吸防止基质结块，提升转基因苗的存活率。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种农杆菌介导转化生菜组织培养方法，包括以下步骤：

(1)生菜无菌苗的培养

将生菜种子置于烧杯中，用自来水浸种2h，然后在超净工作台中先用 75％乙醇消毒30s，无菌蒸馏水冲洗2次，再用0.1％升汞消毒4min，无菌蒸馏水冲6次，用无菌滤纸片吸干种子表面水分。将处理过的种子分别种植于培养基(MS培养基，30g/L蔗糖，7.5g/L琼脂，pH5.8，121℃，110Kpa下灭菌25min)上，于光照培养室培养，温度25℃、光照16/8hrs(光照/黑暗)，光照强度200umol·m^-2·s^-1。

(2)外植体农杆菌侵染

取苗龄7天的生菜无菌苗，将叶片切至大小1cm²，在OD₆₀₀＝0.5的农杆菌菌液中侵染5分钟。

(3)生菜诱导愈伤-发芽培养基培养

将侵染的外植体置于愈伤-发芽培养基上，叶片正面朝上，保证伤口与培养基充分接触，其中培养基为添加蔗糖30g/L，琼脂7.5g/L，在121℃， 110Kpa灭菌锅灭菌30min，待培养基温度降至50℃加入生长素IAA 1.0mg/L 和6-BA 0.7mg/L。在光照培养室中进行愈伤诱导和发芽，温度25℃、光照 16/8hrs(光照/黑暗)，光照强度250umol·m^-2·s^-1。

(4)生根培养

将长至2cm以上的芽苗转接至生根培养基上，生根培养基组成为蔗糖 30g/L+琼脂7.5g/L，在121℃，110Kpa灭菌锅灭菌30min。生根在光照培养室中进行，温度25℃、光照16/8hrs(光照/黑暗)、光照强度250umol·m^-2·s^-1。

(5)生菜再生苗驯化移栽

生根培养3周后挑选生根粗壮苗进行开盖驯化培养2天，然后移植在土 /蛭石＝3：1的花盆中，从盆底浇水，让水倒吸防止土结块，影响转基因苗存活率，温度25℃、光照16/8hrs(光照/黑暗)、光照强度250umol·m^-2·s^-1。

实施例2

一种农杆菌介导转化生菜组织培养方法，包括以下步骤：

(1)生菜无菌苗的培养

将生菜种子置于烧杯中，用自来水浸种2h，然后在超净工作台中先用 75％乙醇消毒30s，无菌蒸馏水冲洗2次，再用0.1％升汞消毒3min，无菌蒸馏水冲6次，用无菌滤纸片吸干种子表面水分。将处理过的种子分别种植于培养基(1/2MS培养基，30g/L蔗糖，7.5g/L琼脂，pH5.8，121℃，110Kpa 下灭菌25min)上，于光照培养室培养，温度24℃、光照16/8hrs(光照/黑暗)，光照强度200umol·m^-2·s^-1。

(2)外植体农杆菌侵染

取苗龄5天的生菜无菌苗，将叶片切至大小0.8cm²，在OD₆₀₀＝0.3农杆菌菌液中侵染10分钟。

(3)生菜诱导愈伤-发芽培养基培养

将侵染的外植体置于愈伤-发芽培养基上，叶片正面朝上，保证伤口与培养基充分接触，其中愈伤诱导培养基为添加蔗糖25g/L，琼脂7.0g/L，在 121℃，110Kpa灭菌锅灭菌25min，待培养基温度降至40℃加入生长素IAA 1.2mg/L，6-BA 0.5mg/L。在光照培养室中进行愈伤诱导和发芽，温度22℃、光照16/8hrs(光照/黑暗)，光照强度200umol·m^-2·s^-1。

(4)生根培养

将长至2cm以上的芽苗转接至生根培养基上，生根培养基组成为蔗糖 25g/L，琼脂7.0g/L，在121℃，110Kpa灭菌锅灭菌25min。生根在光照培养室中进行，温度23℃、光照16/8hrs(光照/黑暗)、光照强度200umol·m^-2·s^-1。

(5)生菜再生苗驯化移栽

生根培养3周后挑选生根粗壮苗进行开盖驯化培养2天，然后移植在土 /蛭石＝3：1的花盆中，从盆底浇水，让水倒吸防止土结块，影响转基因苗存活率，温度23℃、光照16/8hrs(光照/黑暗)、光照强度200umol·m^-2·s^-1。

实施例3

一种农杆菌介导转化生菜组织培养方法，包括以下步骤：

(1)生菜无菌苗的培养

将生菜种子置于烧杯中，用自来水浸种2h，然后在超净工作台中先用 75％乙醇消毒30s，无菌蒸馏水冲洗2次，再用0.1％升汞消毒5min，无菌蒸馏水冲6次，用无菌滤纸片吸干种子表面水分。将处理过的种子分别种植于培养基(MS培养基，30g/L蔗糖，7.5g/L琼脂，pH5.8，121℃，110Kpa下灭菌25min)上，于光照培养室培养，温度26℃、光照16/8hrs(光照/黑暗)，光照强度200umol·m^-2·s^-1。

(2)外植体农杆菌侵染

取苗龄8天的生菜无菌苗，将叶片切至大小1.2cm²，在OD₆₀₀＝0.4农杆菌菌液中侵染7分钟。

(3)生菜诱导愈伤-发芽培养基培养

将侵染的外植体置于愈伤-发芽培养基上，叶片正面朝上，保证伤口与培养基充分接触，其中愈伤诱导培养基为添加蔗糖35g/L，琼脂8.0g/L，在 121℃，110Kpa灭菌锅灭菌20min，待培养基温度降至60℃加入生长素IAA 1.5mg/L，6-BA 0.9mg/L。在光照培养室中进行愈伤诱导和发芽，温度28℃、光照16/8hrs(光照/黑暗)，光照强度300umol·m^-2·s^-1。

(4)生根培养

将长至2cm以上的芽苗转接至生根培养基上，生根培养基组成为蔗糖 35g/L，琼脂8.0g/L，在121℃，110Kpa灭菌锅灭菌20min。生根在光照培养室中进行，温度27℃、光照16/8hrs(光照/黑暗)、光照强度300umol·m^-2·s^-1。

(5)生菜再生苗驯化移栽

生根培养3周后挑选生根粗壮苗进行开盖驯化培养2天，然后移植在土 /蛭石＝3：1的花盆中，从盆底浇水，让水倒吸防止土结块，影响转基因苗存活率，温度27℃、光照16/8hrs(光照/黑暗)、光照强度300umol·m^-2·s^-1。

实施例4

不同农杆菌菌液浓度对生菜外植体成活率和侵染率的影响

取苗龄5天的生菜无菌苗，将叶片切至大小1cm²，置于菌液浓度 OD₆₀₀＝0.1-1.0的农杆菌菌液中进行侵染，侵染时间为10分钟，统计叶片外植体的成活率和侵染率。每个处理20个外植体，重复2次，统计平均值。

表1农杆菌菌液浓度对生菜外植体成活率和侵染率的影响

侵染菌液浓度OD<sub>600</sub>	成活率	侵染率
			0.1	100％	73％
0.2	100％	88％
			0.3	99％	96％
0.4	98％	96％
			0.5	98％	97％
0.6	96％	98％
			0.7	91％	98％
0.8	86％	98％
			0.9	78％	98％
1.0	63％	98％

根据表1所示，在农杆菌菌液低浓度时，虽然外植体成活率较高，但侵染率低；在高浓度时，虽然外植体侵染率高，但后期外植体污染率提高，造成外植体成活率降低。以菌液浓度OD₆₀₀＝0.3-0.5的农杆菌菌液进行侵染，能够保持较高水平的侵染率和外植体成活率。

实施例5

不同农杆菌菌液侵染时间对生菜外植体成活率和侵染率的影响

在不同菌液浓度侵染外植体试验的基础上，进一步研究不同侵染时间对外植体成活率和侵染率的影响。在菌液浓度OD₆₀₀＝0.5的农杆菌菌液中侵染 1-20分钟，每个处理20个外植体，重复2次，统计平均值。

表2农杆菌菌液侵染时间对生菜外植体成活率和侵染率的影响

菌液侵染时间(min)	成活率	侵染率
			1	100％	45％
3	100％	63％
			5	99％	89％
7	98％	96％
			9	96％	96％
11	95％	95％
			13	89％	96％
15	83％	96％
			17	76％	96％
19	72％	96％

根据表2所示，在1-20分钟的侵染时间内，5-9分钟最适宜，时间过短导致侵染效率低，时间过长外植体容易死亡，经调整，农杆菌菌液侵染时间5-10分钟，利于农杆菌侵染及后续组织培养。

实施例6

不同外源激素种类及浓度对生菜外植体发芽率的影响

将侵染的生菜外植体进行愈伤-发芽培养基培养，愈伤-发芽培养基组成包括蔗糖30.0g/L+琼脂7.5g/L。培养条件为温度为25℃，光照周期为16L/8D，光照强度为250umol·m^-2·s^-1。选择不同生长素IAA、NAA、2,4-D和细胞分裂素6-BA、KT进行组配，研究不同生长素和细胞分裂素对生菜外植体发芽率的影响，并进一步筛选各外源激素的添加量。每个处理100个外植体，重复2次，4周后统计发芽率平均值。

表3外源激素种类和浓度对生菜外植体发芽率的影响

根据表3所示，以IAA和6-BA作为生菜外植体愈伤-发芽培养基的外源激素，更有利于外植体发芽，其中IAA 1.0-1.5mg/L+6-BA 0.5-0.9mg/L可使生菜外植体发芽率达到90％以上，IAA 1.0+6-BA 0.7mg/L发芽率最高，达到98％。

实施例7

抗生素浓度对侵染外植体抑菌率和褐化率的影响

在农杆菌介导转化生菜组织培养时，在培养过程中通常在筛选培养基添加抗生素以抑制农杆菌生长。本发明在愈伤-发芽培养基(蔗糖30.0g/L+琼脂 7.5g/L+IAA 1.0mg/L+6-BA 0.7mg/L)中添加0-500mg/L头孢霉素，以得到适宜的抗生素浓度。每个处理20个外植体，重复2次，统计平均值。

表4不同浓度抗生素添加量对外植体抑菌率和褐化率的影响

头孢霉素浓度	抑菌率	褐化率
			500mg/L	98％	35％
400mg/L	98％	34％
			300mg/L	97％	32％
200mg/L	97％	28％
			100mg/L	96％	18％
0％	95％	2％

根据表4所示，利用本发明愈伤-发芽培养基，即便不添加抗生素，其与添加100-500mg/L或常规农杆菌侵染外植体的抑菌率和褐化率水平相近。不添加抗生素对本发明愈伤-发芽培养基的培养效果没有影响。

实施例8

本发明农杆菌介导转化生菜组织培养方法与普通传统农杆菌介导植物组织培养方法比较：

普通传统方法：生菜无菌苗培养-无菌苗农杆菌侵染-共培养培养基暗培养3天-诱导愈伤培养基培养-诱导发芽培养基培养-生根培养基培养-驯化移栽；

本发明：生菜无菌苗培养-无菌苗农杆菌侵染-诱导愈伤发芽培养基培养- 生根培养基培养-驯化移栽。

表5

根据表5所示，采用本发明的组织培养方法，省略了共培养步骤及培养基中抗生素的添加，其组织培养周期短，步骤简洁，发芽率、生根率高，褐化率、污染率低(抑菌率高)，成本低，效率高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种农杆菌介导转化生菜组织培养方法，其特征在于，用农杆菌菌液侵染生菜无菌苗的外植体，将侵染后的生菜外植体相继置于愈伤-发芽培养基、生根培养基上进行诱导，驯化移栽；所述愈伤-发芽培养基组成为：蔗糖25.0-35.0g/L+琼脂7.0-8.0g/L+IAA 1.0-1.5mg/L+6-BA 0.5-0.9mg/L。

2.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述生菜无菌苗苗龄为5-8天。

3.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述生菜外植体为叶片。

4.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述农杆菌菌液OD₆₀₀＝0.3-0.5。

5.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述侵染时间为5-10分钟。

6.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导条件为：温度为25±3℃，光照周期为16L/8D，光照强度为200-300umol·m^-2·s^-1。

7.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导至长出2cm以上芽苗时转移至生根培养基培养。

8.根据权利要求1或7所述的组织培养方法，其特征在于，所述生根培养基组成为：蔗糖25.0-35.0g/L+琼脂7.0-8.0g/L。

9.根据权利要求1或7所述的组织培养方法，其特征在于，所述生根培养条件为：温度为25±2℃，光照周期为16L/8D，光照强度为200-300umol·m^-2·s^-1。

10.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述驯化移栽的基质为体积比为3-5:1的土和蛭石。