CN116262931A - 一种黍属植物的遗传转化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种黍属植物的遗传转化方法，具体地，本发明提供了一种对黍属植物进行遗传转化的方法，包括步骤：(i)提供待遗传转化的黍属植物和外源DNA；(ii)将所述外源DNA转染所述待遗传转化的黍属植物的植物胚胎，使得所述DNA与所述植物胚胎中的染色体发生重组，从而获得经遗传转化的植物胚胎，其中所述植物胚胎的大小为0.3‑2mm，较佳地，0.5‑1.8mm，更佳地，0.8‑1.6mm；(iii)对所述植物胚胎进行诱导培养，从而获得黍属植物植株；(iv)任选地，对所述黍属植物植株进行遗传转化情况的检测。本发明的方法可获得优异的分化率、生根率、遗传转化效率，而且尽可能的缩短遗传转化时间，并且再生效率稳定。

Description

一种黍属植物的遗传转化方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种黍属植物的遗传转化方法。
背景技术
糜子(Panicum miliaceum L)是禾本科黍属一年生草本作物。糜子是一种极度耐旱的谷物，在亚洲、欧洲的半干旱地区广泛种植。它起源于中国北方，也是世界上最早驯化的农作物之一。糜子在我国栽培历史悠久，栽培历史甚至可以追溯到公元前一万年左右，是中国的“五谷”之一，在我国农业发展中起着非常重要的作用。
糜子生长周期短(60-90天)，株型较小，与其他作物相比糜子的水分利用率(WUE)很高，可以作为旱地栽培的先锋作物或者温带地区的夏季轮作作物。糜子是典型的C4植物，是研究C4植物光合作用机制的潜在模式植物。糜子不含麸质且营养丰富，与大多数其他谷物相比，其蛋白质、多种矿物质和抗氧化剂含量更高，是潜在的帮助确保粮食安全和农业多样化的作物。但是，与近缘的小米相比，糜子的产量较低。因此，建立高效的糜子遗传转化体系是非常重要的。
因此，本领域迫切需要开发一种能够提高黍属植物，比如，糜子遗传转化效率的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够提高黍属植物，比如，糜子遗传转化效率的方法。
本发明第一方面提供了一种对黍属植物进行遗传转化的方法，包括步骤：
(i)提供待遗传转化的黍属植物和外源DNA；
(ii)将所述外源DNA转染所述待遗传转化的黍属植物的植物胚胎，使得所述DNA与所述植物胚胎中的染色体发生重组，从而获得经遗传转化的植物胚胎，其中所述植物胚胎的大小为0.3-2mm，较佳地，0.5-1.8mm，更佳地，0.8-1.6mm；
(iii)对所述植物胚胎进行诱导培养，从而获得黍属植物植株；
(iv)任选地，对所述黍属植物植株进行遗传转化情况的检测。
在另一优选例中，所述黍属植物选自下组：糜子、铺地黍、或其组合。
在另一优选例中，所述胚胎包括未成熟的和成熟的胚胎。
在另一优选例中，所述步骤(iii)包括以下子步骤：
(a1)对所述的植物胚胎进行胚性愈伤诱导培养，从而获得胚性愈伤组织；
(a2)任选的，对所述胚性愈伤组织进行筛选；
(a3)对所述胚性愈伤组织进行出芽处理，从而获得不定芽；
(a4)对所述不定芽进行生根处理，从而获得黍属植物植株。
在另一优选例中，所述的转染采用农杆菌侵染法或基因枪轰击法。
在另一优选例中，在步骤(ii)中，通过基因枪将外源DNA转入所述植物细胞中。
在另一优选例中，所述方法还包括对所述的植物胚胎或所述胚性愈伤组织进行高渗处理的步骤。
在另一优选例中，将所述的植物胚胎或所述胚性愈伤组织置于含0.05-5mol/L(较佳地，0.08-2mol/L，更佳地，0.1-1mol/L)的甘露醇、0.1-50g/L(较佳地，0.5-30g/L，更佳地，0.8-10g/L)的植物凝胶的N6培养基上，在4-7(较佳地，5.5-6)的pH值下进行高渗处理1-20小时，较佳地，2-16小时，更佳地，3-12小时。
在另一优选例中，将所述的植物胚胎置于胚性愈伤诱导培养基中进行诱导培养，从而获得经诱导培养的胚性愈伤组织。
在另一优选例中，在步骤(a1)中，将所述植物胚胎置于含0.05-100mg(较佳地，0.08-50mg，更佳地，0.1-20mg)的2,4-D(二氯苯氧乙酸)或6-BA(6-苄氨基嘌呤)或ZA(玉米素)、0.1-150g/L(较佳地，0.5-120g/L，更佳地，0.8-100g/L)的蔗糖，0-80g/L(较佳地，0.5-50g/L，更佳地，0.8-20g/L)的水解酪蛋白，0-100g/L(较佳地，0-50g/L，更佳地，0-30g/L)的L-脯氨酸，0.1-50g/L(较佳地，0.5-20g/L，更佳地，0.8-12g/L)的植物凝胶的1/2MS或者MS培养基(或N6培养基)上，pH为4-7(较佳地，5.5-6)，在15-40℃(较佳地，16-36℃)下进行培养，从而获得胚性愈伤组织。
在另一优选例中，所述步骤(a1)中，在避光条件下进行培养。
在另一优选例中，所述步骤(a2)中，将所述胚性愈伤组织置于筛选培养基中进行筛选。
在另一优选例中，所述筛选包括抗生素筛选、除草剂筛选等。
在另一优选例中，将所述胚性愈伤组织置于分化培养基中进行诱导培养，从而获得不定芽。
在另一优选例中，所述步骤(a3)中，将所述胚性愈伤组织置于含0.01-20mg/L(较佳地，0.05-10g/L，更佳地，0.1-5g/L)的NAA(1-萘乙酸)或IBA(吲哚丁酸)或IAA(生长素)、0.1-150g/L(较佳地，0.5-100g/L，更佳地，0.8-80g/L)的麦芽糖、0.1-50g/L(较佳地，0.5-20g/L，更佳地，0.8-12g/L)的植物凝胶的1/2MS或者MS培养基(或N6培养基)上，PH为4-7(较佳地，5.5-6)，在15-40℃(较佳地，16-36℃)下进行培养，从而获得不定芽。
在另一优选例中，将所述不定芽置于生根培养基中进行培养，从而获得不定根和植株。
在另一优选例中，所述步骤(a4)中，将所述不定芽置于含任选的筛选剂、0.1-150g/L(较佳地，0.5-120g/L，更佳地，0.8-100g/L)的蔗糖、0.1-50g/L(较佳地，0.5-20g/L，更佳地，0.8-12g/L)的植物凝胶的1/2MS或者MS培养基上，PH为4-7(较佳地，5.5-6)，在15-40℃(较佳地，16-36℃)下进行培养，从而获得不定根和植物植株。
在另一优选例中，所述筛选剂选自下组：抗生素(潮霉素，卡那霉素)、除草剂(草铵膦，草甘膦)、或其组合。
在另一优选例中，所述步骤(a1)-(a4)中，培养条件选自下组的一种或多种：
(i)温度为15-40℃，较佳地，16-36℃；
(ii)光照度为400-8000Lux，较佳地，500-5000Lux；
(iii)培养时间为5-50天，较佳地，6-35天，更佳地，10-30天。
在另一优选例中，用选自下组的方法对遗传转化情况进行鉴定和筛选：PCR、测序、标记基因筛选。
在另一优选例中，所述外源DNA来源于目标载体或者由目标载体而来的线性化片段。
在另一优选例中，所述目标载体选自下组：双元表达载体中的过表达质粒、基因编辑质粒、基因沉默质粒、或其组合。
在另一优选例中，所述目标载体中还含有筛选标记基因。
在另一优选例中，所述外源DNA整合于选自下组的一种或多种质粒：质粒PC3301、pBSE401、pC1300。
在另一优选例中，所述的筛选标记基因选自下组：抗除草剂基因、抗生素基因(如抗潮霉素基因)、荧光蛋白基因、或其组合。
在另一优选例中，所述外源DNA选自下组：由目标载体而来的线性化片段(比如p35S::HYG-polyA)。
在另一优选例中，所述方法还包括将步骤(iii)获得的植株进行炼苗后，移植入栽培土中培养的步骤。
本发明第二方面提供了一种制备遗传转化植物胚胎的方法，包括步骤：
(i)提供待遗传转化的黍属植物和外源DNA；
(ii)将所述外源DNA转染所述待遗传转化的黍属植物的植物胚胎，使得所述DNA与所述植物胚胎中的染色体发生重组，从而获得经遗传转化的植物胚胎，其中所述植物胚胎的大小为0.3-2mm，较佳地，0.5-1.8mm，更佳地，0.8-1.6mm。
本发明第三方面提供了一种制备经遗传转化的植物的方法，包括步骤：
(a)用本发明第二方面所述方法制备一经遗传转化的植物胚胎；和
(b)将所述的经遗传转化的植物胚胎再生为植物体，从而获得所述经遗传转化的植物。
本发明第四方面提供了一种经遗传转化的植物，所述的植物是用本发明第三方面所述的方法制备的。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了合适的糜子的胚胎。
图2显示了去芽之后的胚性愈伤。
图3显示了经过筛选的胚性愈伤、
图4显示了长在分化培养基上的不定芽。
图5显示了长在生根培养基中的再生植株。
图6显示了移栽到土中的再生植株。
图7为长在筛选培养基上的野生型和T1代植物。
图8为通过PCR鉴定转基因T1代植物的转基因情况。
图9为TADEA-PCR鉴定转基因T1代植物。
图10为TAEEA-PCR产物进行Sanger测序结果。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现一种可提高黍属植物，比如，糜子遗传转化效率的方法，具体地，本发明直接用基因枪对黍属植物，比如糜子进行浸染，将外源基因直接导入到黍属植物，比如糜子的胚胎中，经一系列诱导培养(比如胚型愈伤诱导培养、不定芽诱导培养、生根诱导培养)后经鉴定、筛选获得黍属植物，比如糜子的转基因阳性植株。本发明具有极大的应用价值，并能产生巨大的经济效益和社会效益。在此基础上，本发明人完成了本发明。
外源DNA
本文所用的术语“外源DNA”指天然和合成脱氧核糖核酸(DNA)序列，其可任选包括合成核酸类似物。本发明所述核酸可任选是优化的密码子。密码子优化指DNA的密码子使用适合感兴趣细胞或生物体以提高所述重组核酸在感兴趣细胞或生物体中的转录率。技术人员深深了解，核酸由于密码子简并能在一个位置被修饰，而此修饰在翻译后的该位置仍产生同一氨基酸序列，因此可以通过密码子优化以考虑靶细胞或生物体的物种特异性，实现核酸的高效表达。本申请所述的DNA序列可以是特异密码子优化的，用于以下非限制性生物体：黍属植物的任何变种或亚种(如糜子)。
在一优选实施方式中，所述外源DNA选自下组：由目标载体而来的线性化片段(比如p35S::HYG-polyA)。
目标载体
本文所用的术语“目标载体”指整合有外源DNA，并将其递送到靶细胞的转运工具。载体因而包括核酸序列，任选包括调控序列或定位序列以用于直接或间接递送到感兴趣靶细胞或植物所需细胞区室中的植物靶结构。载体也能用于引入氨基酸序列到靶细胞或靶结构。通常，本文所用的载体可以是质粒载体。本发明所述“转染”或“转化”指将本发明所述含有外源DNA的目标载体导入所述植物靶细胞或靶结构，并与靶细胞或靶结构中的基因组发生整合，其中用载体递送的材料会在转染或转化过程中发挥其作用。具体的可以包括农杆菌侵染、基因枪轰击法及其他本领域技术人员所公知的技术。所述“基因枪轰击法”是指将外源基因在Ca+和亚精胺等作用下吸附在重金属金或者钨表面(直径0.6-1.5um左右)，制成DNA微弹，利用基因枪将DNA微弹高速射入植物受体细胞，释放出的DNA分子随机的整合到植物基因组中，然后通过组织培养技术，从而得到再生植株，从而实验遗传转化。经过基因枪轰击的糜子胚胎，会受到一定的损伤，其再生能力也会受到影响，不同基因型的糜子对这种损伤的修复和抵御能力也不同，因此要选择合适的基因型。基因枪的具体操作见下文具体实施方式。
在本发明中，目标载体选自下组：双元表达载体中的过表达质粒、基因编辑质粒、基因沉默质粒、或其组合。
在本发明中，合适载体可以是质粒、线性化片段等，比如，质粒PC3301、pBSE401、pC1300等。
本发明的方法
本发明提供了一种对黍属植物进行遗传转化的方法，包括步骤：
一种对黍属植物进行遗传转化的方法，其特征在于，包括步骤：
(i)提供待遗传转化的黍属植物和外源DNA；
(ii)将所述外源DNA转染所述待遗传转化的黍属植物的植物胚胎，使得所述DNA与所述植物胚胎中的染色体发生重组，从而获得经遗传转化的植物胚胎，其中所述植物胚胎的大小为0.3-2mm，较佳地，0.5-1.8mm，更佳地，0.8-1.6mm；
(iii)对所述植物胚胎进行诱导培养，从而获得黍属植物植株；
(iv)任选地，对所述黍属植物植株进行遗传转化情况的检测。
在一优选实施方式中，本发明提供了一种高效的糜子遗传转化的方法，所述方法包括下述步骤：
(1)高效的糜子再生体系的建立：糜子再生体系的建立是基于，
a.选择合适基因型的糜子，不同基因型的糜子诱导效率差别很大，且不同基因型的糜子对基因枪轰击带来的损伤的修复和抵御能力也不同，因此选择合适基因型的糜子对于建立高效的再生体系是至关重要的。
b.选择合适的外植体，外植体的选择对于糜子的再生体系也是至关重要的，对于大部分第一次建立再生体系的单子叶植物来说，使用未成熟胚作为外植体建立再生体系是一个很好的选择，其中未成熟胚状态的选择也是不容忽视的环节。因此在本发明中我们优先选择的是大小为0.4-2mm的糜子未成熟胚，但我们的外植体不仅限于未成熟胚，成熟的种子，花序等都是合适的外植体。
c.筛选最佳的培养基组合，胚性愈伤诱导培养基、抗性筛选培养基、再生培养基和生根培养基的合理选择，对于再生率的高低起着决定性的作用。培养基的最佳配方如前面权力要求书中所述，在此不在赘述。
d.培养条件：胚性愈伤诱导和筛选时培养条件为，温度16-36度，避光。
再生和生根时的培养条件为，光照1000-4000Lux,温度16-36度，光周期为16/8h。
(2)基因枪法：基因枪转化是将外源基因在Ca+和亚精胺等作用下吸附在重金属金或者钨表面(直径0.6-1.5um左右)，制成DNA微弹，利用基因枪将DNA微弹高速射入植物受体细胞，释放出的DNA分子随机的整合到植物基因组中，然后通过组织培养技术，从而得到再生植株，从而实验遗传转化。经过基因枪轰击的糜子胚胎，会受到一定的损伤，其再生能力也会受到影响，不同基因型的糜子对这种损伤的修复和抵御能力也不同，因此要选择合适的基因型。基因枪的具体操作见具体实施例。
本发明的方法可获得优异的分化率、生根率、遗传转化效率，并且尽可能的可缩短遗传转化时间，而且再生效率稳定。
培养基
本文所用的N6培养基是本领域目前使用的最普遍的培养基，N6培养基是由我国朱至清等学者为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。其特点是KNO3和(NH4)2SO4含量高,不含钼。目前在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花粉和花药培养。增加2,4-D等植物生长素类似物之后还可以用于愈伤组织的诱导。
本文所用的MS培养基是本领域目前使用最普遍的培养基之一，Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要,因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基(Murashige and Skoog A revised medium for rapid growth and bio assays withtobacco tissue cultures.Physiol Plant,1962.15(3):473.)。除非另有说明，采用本领域已知的配方配制MS培养基或MS固体培养基即可。
本文所用的1/2MS培养基是本领域目前使用最普遍的培养基之一，1/2MS是在MS培养基的基础上，大量元素减半，其他元素保持不变。
在本发明中，所采用的培养基可在本领域的黍属植物，比如糜子植物的常规培养基的基础上进行构建，添加一定浓度的甘露醇、植物凝胶，从而获得高渗培养基，培养基的pH为4-7(较佳地，5.5-6)。
在本发明中，所采用的培养基可在本领域的黍属植物，比如糜子植物的常规培养基的基础上进行构建，添加一定浓度的2,4-D(二氯苯氧乙酸)或6-BA(6-苄氨基嘌呤)或ZA(玉米素)、蔗糖、水解酪蛋白、L-脯氨酸、植物凝胶，从而获得胚性愈伤组织诱导的培养基(即胚性愈伤诱导培养基)，培养基的pH为5-7(较佳地，5.5-6)
在本发明中，所采用的培养基可在本领域的黍属植物，比如糜子植物的常规培养基的基础上进行构建，添加一定浓度的NAA(1-萘乙酸)或IBA(吲哚丁酸)或IAA(生长素)、麦芽糖、植物凝胶，从而获得不定芽诱导培养基(即分化培养基)，培养基的pH为5-7(较佳地，5.5-6)。
在本发明中，所采用的培养基可在本领域的黍属植物，比如糜子植物的常规培养基的基础上进行构建，添加一定浓度的任选的筛选剂、蔗糖、植物凝胶，从而获得生根培养基，培养基的pH为5-7(较佳地，5.5-6)。
在一优选实施方式中，高渗培养基：N6培养基(货号，SLBH7859V，购自，SIGMA)中加入甘露醇(货号，WXBD1141V，购自，SIGMA)、植物凝胶(货号，WXBC9170V，购自，SIGMA)。
在一优选实施方式中，胚性愈伤诱导培养基：1/2MS或者MS培养基(货号，M519，购自，PhytoTech)中加入2,4-D(二氯苯氧乙酸)或6-BA(6-苄氨基嘌呤)或ZA(玉米素)(2,4-D:货号，D309，购自，PhytoTech)、蔗糖(货号，10021418，购自，沪试)、水解酪蛋白(货号，LP0041，购自，OXOID)、L-脯氨酸(货号，P698，购自，PhytoTech)、植物凝胶(货号，WXBC9170V，购自，SIGMA)。
在一优选实施方式中，分化培养基：1/2MS或者MS培养基(货号，M519，购自，phytoTech)中加入NAA(1-萘乙酸)或IBA(吲哚丁酸)或IAA(生长素)(NAA:货号，N605，购自，Phyto Technology Laboratories)、麦芽糖(货号，M588，购自，Phyto TechnologyLaboratories)、植物凝胶(货号，WXBC9170V，购自，SIGMA)。
在一优选实施方式中，生根培养基：1/2MS或者MS培养基(货号，M519，购自，PhytoTech)中加入任选的筛选剂(比如，潮霉素：，货号，H044-65US，购自，invitrogen)、蔗糖(货号，10021418，购自，沪试)、植物凝胶(货号，WXBC9170V，购自，SIGMA)。
在本发明中，还可含有筛选培养基，一种优选的为常规筛选培养基的基础上加入筛选剂(比如，潮霉素，货号：H044-65US，购自，invitrogen)。
甘露醇
如本文所用，甘露醇是指D-甘露醇、D-Mannitol。在培养基中添加一些高渗化合物，如蔗糖、甘露醇、山梨醇等,本发明中甘露醇在培养基中主要用于调节培养基的渗透压。。
水解酪蛋白
水解酪蛋白，为酪蛋白水解产物，是一种含10个氨基酸的三维结构多肽。水解酪蛋白在组织培养中具有促进愈伤组织和悬浮细胞的生长的作用，因此本发明中，水解酪蛋白被用于诱导胚性愈伤培养基中，促进胚性愈伤的生长。
L-脯氨酸
L-脯氨酸，化学式为C5H9NO2，分子量为115.13，是一种环状的亚氨基酸。脯氨酸为常用的生化试剂，主要用于生化及营养研究，微生物试验，制备培养基。L-脯氨酸作为氨基酸可以补充养分，并且可以提高组织的抗性，增加愈伤组织成活率。
6-苄氨基嘌呤
如本文所用，术语“6-苄氨基嘌呤”、“6-苄基腺嘌呤”、“6-苄腺嘌呤”、“6-苯甲基腺嘌呤”、“6-BA”、“苄基腺嘌呤”、“BA”等均可以与互换使用。
6-苄氨基嘌呤是一种广谱性植物生长调节剂，可促进植物细胞生长，抑制植物叶绿素、核酸、蛋白质的分解，提高氨基酸的含量，延缓叶片衰老，将氨基酸、生长素、无机盐等向处理部位调运等多种效能，广泛用在农业、果树和园艺作物的从发芽到收获的各个阶段。
本领域的普通技术人员可以使用常规方法获得6-苄氨基嘌呤，如市场购买或用常规方法制取。
蔗糖
如本文所用，术语“蔗糖”、“sugar”和“Sugar”等均可以与互换使用。
蔗糖是食糖的主要成分，是双糖的一种，由一分子葡萄糖的半缩醛羟基与一分子果糖的半缩醛羟基彼此缩合脱水而成。蔗糖在组培中的作用包含作为碳源，提供能量。蔗糖可形成相对稳定的渗透压，这样不会造成植物细胞脱水而生长不良。同时选用蔗糖也可以在一定程度上减少微生物的污染。蔗糖的浓度在一定程度上影响愈伤组织中维管束的类型和数量。
本领域的普通技术人员可以使用常规方法获得蔗糖，如市场购买或用常规方法制取。
2,4-D(二氯苯氧乙酸)
如本文所用，术语“2,4-D”和“二氯苯氧乙酸”等均可以与互换使用。
2,4-D是一种生长素类似物，它是一种人工合成的植物激素,具有与生长素(IAA)相似的生理效应,可用作植物生长调节,是用于诱导愈伤组织形成的常用的生长素类似物的一种.
本领域的普通技术人员可以使用常规方法获得2,4-D，如市场购买或用常规方法制取。
ZA(玉米素)
ZA(Zeatin)是存在于高等植物的一种天然植物细胞分裂素(cytokinins,CKs)，最初是从幼嫩的玉米芯中发现分离出来的，后来椰汁中也发现该物质及其衍生物。作为细胞生长调节剂，功能上不仅促进侧芽生长，刺激细胞分化(侧端优势)，促进愈伤组织和种子发芽，还能防止叶片衰老，逆转芽部受到的毒素伤害和抑制过度根部形成。高浓度的玉米素还能产生不定芽分化。
本领域的普通技术人员可以使用常规方法获得ZA，如市场购买或用常规方法制取。
NAA(1-萘乙酸)
NAA，中文名称1-萘乙酸，一种合成的植物生长激素，由根、茎、叶吸收，诱发不定形根形成，提高树木扦插成活率，提高座果率。常添加至植物细胞培养基中用于植物细胞培养，促进不定芽的形成。本领域的普通技术人员可以使用常规方法获得NAA，如市场购买或用常规方法制取。
IBA(3-吲哚丁酸)
IBA，一种生长素类植物激素，能促进植物扦插生根，提高发芽率、成活率等，是商业植物生根园艺产品中的重要原料。此外，IBA是吲哚-3-乙酸(IAA)的前体。本领域的普通技术人员可以使用常规方法获得IBA，如市场购买或用常规方法制取。
IAA(生长素，3-吲哚乙酸)
IAA，一种吲哚类具有生长素活性的广谱植物生长调节剂，是植物器官形成和生长调节的一种信号分子，具有促进细胞分裂、加速生根、增加座果等作用。本领域的普通技术人员可以使用常规方法获得IAA，如市场购买或用常规方法制取。
植物凝胶
如本文所用，术语“植物凝胶”、“pyhtal”和“phytagel”等均可以与互换使用。
植物凝胶是一种琼脂的替代物，是细菌(假单孢菌Pseudomonas elodea)经过发酵生产的，含有葡萄糖醛酸、鼠李糖和葡萄糖等物质，具有无色、透亮和高韧性的特点，是配制植物组织培养基和微生物培养基的主要成分。
本领域的普通技术人员可以使用常规方法获得植物凝胶，如市场购买或用常规方法制取。
筛选剂
凡能在含某种筛选剂(如抗生素、除草剂等)的培养液中正常生长的细胞，一定带有该筛选剂具有抗性的基因。基于该原理可筛选对抗生素具有抵抗作用的基因。常用的筛选剂有潮霉素，卡那霉素，草铵膦、除草剂等。本领域的普通技术人员可以使用常规方法获得筛选剂，如市场购买或用常规方法制取。
在本发明中，可以不用筛选剂。并且潮霉素，卡那霉素，草铵膦、除草剂等都是常规筛选剂，放在本发明中，都具有类似的作用。
应用
本发明可以用于植物基因工程领域，用于植物研究和育种，尤其是具有经济价值的农作物、林业作物或园艺植物的遗传改良。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明首次实现了黍属植物(比如糜子)的遗传转化，能够极大促进科学家对黍属植物(比如糜子)的基因功能研究，并加速黍属植物(比如糜子)的现代化育种进程，增加黍属植物(比如糜子)的种植规模。
(2)本发明首次建立的稳定的糜子再生体系。
(3)本发明以糜子胚胎为材料，再生效率很稳定，且能保持在50％以上。
(4)本发明耗时很短，一套完整的遗传转化体系，只需要大约3个月的时间。
(5)本发明的遗传转化效率较高，而且与其他作物相比工作量较小，倒板频率较低。
(6)本发明为糜子的遗传改良、种质资源创新和分子机制研究奠定了坚实的基础。
(7)本发明首次对黍属植物(比如糜子)的植物胚胎(比如未成熟的胚胎)进行遗传转化，获得了优异的分化率、生根率、遗传转化效率，并尽可能的缩短遗传转化时间，而且再生效率稳定。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。本发明中所涉及的实验材料和试剂如无特殊说明均可从市售渠道获得。
高渗培养基的制备：
配制高渗培养基，基于常规的N6培养基N6培养基(货号，SLBH7859V，购自，SIGMA)的配方，且培养基中的成分不作调整，添加有0.5mol/L甘露醇、3-5g/L植物凝胶，调节pH值至5.5-6，121℃灭菌10-30分钟。
胚性愈伤诱导培养基的制备：
配制胚性愈伤诱导培养基，基于常规的1/2MS或者MS培养基(货号，M519，购自，PhytoTech)的配方，且培养基中的成分不作调整，添加有1-3mg/L2,4-D(二氯苯氧乙酸)或6-BA(6-苄氨基嘌呤)或ZA(玉米素)、10-20g/L蔗糖、0.1-1g/L水解酪蛋白、2-4g/L的L-脯氨酸、3-5g/L的植物凝胶，调节pH值至5.5-6，121℃灭菌10-30分钟。
分化培养基的制备
配制分化培养基，基于常规的1/2MS或者MS培养基(货号，M519，购自，PhytoTech)的配方，且培养基中的成分不作调整，添加有0.1-1mg/LNAA(1-萘乙酸)或IBA(吲哚丁酸)或IAA(生长素)、10-30g/L麦芽糖、3-5g/L植物凝胶，调节pH值至5.5-6，121℃灭菌10-30分钟。
生根培养基的制备
配制生根培养基，基于常规的1/2MS或者MS培养基(货号，M519，购自，PhytoTech)的配方，且培养基中的成分不作调整，添加有筛选剂5-30mg/L潮霉素、20-40g/L蔗糖、3-5g/L植物凝胶，调节pH值至5.5-6，121℃灭菌10-30分钟。
筛选培养基的制备
配制筛选培养基，筛选培养基为，在常规培养基的基础上调节pH值至较佳地，5.5-6，121℃灭菌10-30分钟后添加筛选剂5-30mg/L潮霉素。
实施例
1.糜子种子灭菌
用无菌水清洗3遍，再用75％乙醇灭菌2-3分钟，无菌水清洗3遍，随后用10％NaClO洗10分钟，最后再用无菌水清洗3遍。
2.侵染液的配制
60-80g/L蔗糖、30-50g/L葡萄糖、0.1-2g/L水解酪蛋白、2-4g/L脯氨酸，PH 5.5-6的MS或者1/2MS混合液。
3.取糜子胚胎
选取合适的糜子种子，取出其中的胚胎。优选未成熟胚，其中糜子未成熟胚的大小优选0.8-1.6mm(图1)。将取好的糜子胚胎置于侵染液中，防止风干。
4.高渗处理
高渗培养基配方为，糜子胚胎或者糜子胚胎诱导的胚性愈伤组织置于含有0.5mol/L的甘露醇、3-5g/L植物凝胶的N6培养基中，PH优选调到5.5-6。进行高渗处理3-12小时，盾面朝上。
5.基因枪轰击
(1)金粉的制备
将混好的10-200mg/ml金粉，涡旋均匀并吸取50ul至1.5ml EP管中，边涡旋边慢慢加入DNA，本实验例中使用的DNA为线性化片段：p35S::HYG-polyA(50ul金粉最多加入5ul体积DNA溶液)、氯化钙(CaCl2)、亚精胺，加完之后充分涡旋均匀之后，静置沉淀2-3分钟，弃去上清液，随后分别用75％乙醇和无水乙醇洗一遍，最后加入合适体积的无水乙醇，充分混匀，备用。
(2)基因枪操作
a.将超净工作台用75％乙醇擦洗干净，打开超净工作台紫外灯灭菌，打开真空泵预热15分钟。
b.打开超净工作的风和光，打开氦气瓶阀门，将压力阀加压到1000-1500Pa,打开超净工作台里的基因枪设备。
c.吸取完全涡旋均匀的备用金粉-DNA悬浮液，吸取3-20ul均匀的涂布于飞行膜的中间，放置在超净工作台上吹干表面的无水乙醇，一皿准备两张飞行膜。
d.将可裂膜装入固定盖中，放平整，然后旋紧固定盖，如果旋不紧，可裂膜就很可能无法击穿。
e.将阻挡网和飞行膜装入子弹发射装置中。
f.将糜子胚胎或者胚性愈伤放在基因枪装置的第三格。
g.按VAC键，抽真空至-25以上，将VAC键快速的切换到HOLD键处。
h.按住FIRE键，直到可裂膜被击穿，然后快速的松手，并将VAC键调至VENT处，去真空，取出样品，完成轰击。
i.关闭基因枪设备。
6.胚性愈伤的诱导
将基因枪轰击完成的糜子胚胎，继续放在高渗培养基上，在暗处培养一天.然后将这些糜子胚胎转移到胚性愈伤诱导培养基上，继续保持盾面朝上，培养14-30天左右，待愈伤组织长到一定大小，将长出来的芽子掐掉，再放到胚性愈伤培养基上生长7-10天(图2)。胚性愈伤诱导培养基配方为，1-3mg/L 2,4-D(二氯苯氧乙酸)/6-BA(6-苄氨基嘌呤)/ZA(玉米素)等，10-20g/L蔗糖，0.1-1g/L水解酪蛋白，2-4g/L L-脯氨酸，3-5g/L植物凝胶的1/2MS或者MS培养基，pH值至5.5-6。培养条件为，温度16-36度，避光。
7.抗性筛选
将步骤6中的胚性愈伤，转移到筛选培养基上，培养10-15天(图3)。筛选培养基的配方是在胚性愈伤诱导培养基的基础上加上筛选剂5-30mg/L潮霉素。培养条件为，温度16-36度，避光。
8.诱导不定芽
将经过筛选的胚性愈伤转移到分化培养基上，在分化培养基上生长几天之后，可见绿色芽点，继续培养可见叶片长出(图4)。分化培养基本的配方为，含有0.1-1mg/LNAA(1-萘乙酸)/IBA(吲哚丁酸)/IAA(生长素)、10-30g/L麦芽糖、3-5g/L植物凝胶的1/2MS或者MS培养基，pH值至5.5-6。培养条件为，光照500-5000Lux，温度16-36度。
9.生根培养
将长出茎的不定芽移到生根培养基中，诱导其生根长出完整植株(图5)。生根培养基配方含有筛选剂潮霉素、20-40g/L蔗糖、3-5g/L植物凝胶的1/2MS或者MS培养基，pH值至5.5-6。培养条件与诱导不定芽相同。
10.移栽
将在生根培养基中完成生根的植物移栽到土里(图6)，使其完成生活史。
11.鉴定
使用PCR和sanger测序对转基因T1代植物进行转基因鉴定(图7-10)。
图7为长在抗性筛选培养基上的野生型和转基因株系，图8为使用PCR鉴定转基因片段，图9为理应TADEA PCR鉴定转基因株系，图10为对TADEA PCR扩增的片段进行测序，测序结果表明该片段序列一部分与转基因序列一致，另一部分与糜子基因组序列一致。综合上面的结果表明，转基因片段p35S::HYG-polyA被整合到了糜子基因组中。
遗传转化效率结果如表1和2所示。
表1
Figure BDA0003410980530000161
表2
Figure BDA0003410980530000162
结果表明，本发明的方法可获得优异的再生效率、生根率、成活率和遗传转化效率。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种对黍属植物进行遗传转化的方法，其特征在于，包括步骤：
(i)提供待遗传转化的黍属植物和外源DNA；
(ii)将所述外源DNA转染所述待遗传转化的黍属植物的植物胚胎，使得所述DNA与所述植物胚胎中的染色体发生重组，从而获得经遗传转化的植物胚胎，其中所述植物胚胎的大小为0.3-2mm，较佳地，0.5-1.8mm，更佳地，0.8-1.6mm；
(iii)对所述植物胚胎进行诱导培养，从而获得黍属植物植株；
(iv)任选地，对所述黍属植物植株进行遗传转化情况的检测。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述黍属植物选自下组：糜子、铺地黍、或其组合。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胚胎包括未成熟的和成熟的胚胎。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(iii)包括以下子步骤：
(a1)对所述的植物胚胎进行胚性愈伤诱导培养，从而获得胚性愈伤组织；
(a2)任选的，对所述胚性愈伤组织进行筛选；
(a3)对所述胚性愈伤组织进行出芽处理，从而获得不定芽；
(a4)对所述不定芽进行生根处理，从而获得黍属植物植株。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的转染采用农杆菌侵染法或基因枪轰击法。
6.如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对所述的植物胚胎或所述胚性愈伤组织进行高渗处理的步骤。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，将所述的植物胚胎置于胚性愈伤诱导培养基中进行诱导培养，从而获得经诱导培养的胚性愈伤组织。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤(a1)中，将所述植物胚胎置于含0.05-100mg(较佳地，0.08-50mg，更佳地，0.1-20mg)的2,4-D(二氯苯氧乙酸)或6-BA(6-苄氨基嘌呤)或ZA(玉米素)、0.1-150g/L(较佳地，0.5-120g/L，更佳地，0.8-100g/L)的蔗糖，0-80g/L(较佳地，0.5-50g/L，更佳地，0.8-20g/L)的水解酪蛋白，0-100g/L(较佳地，0-50g/L，更佳地，0-30g/L)的L-脯氨酸，0.1-50g/L(较佳地，0.5-20g/L，更佳地，0.8-12g/L)的植物凝胶的1/2MS或者MS培养基(或N6培养基)上，pH为4-7(较佳地，5.5-6)，在15-40℃(较佳地，16-36℃)下进行培养，从而获得胚性愈伤组织。
9.一种制备遗传转化植物胚胎的方法，其特征在于，包括步骤：
(i)提供待遗传转化的黍属植物和外源DNA；
(ii)将所述外源DNA转染所述待遗传转化的黍属植物的植物胚胎，使得所述DNA与所述植物胚胎中的染色体发生重组，从而获得经遗传转化的植物胚胎，其中所述植物胚胎的大小为0.3-2mm，较佳地，0.5-1.8mm，更佳地，0.8-1.6mm。
10.一种制备经遗传转化的植物的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)用权利要求9所述方法制备一经遗传转化的植物胚胎；和
(b)将所述的经遗传转化的植物胚胎再生为植物体，从而获得所述经遗传转化的植物。
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