CN110699379B - 一种农杆菌介导的以高粱成熟胚为外植体诱导愈伤组织的遗传转化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，针对传统的高粱遗传转化体系中，以幼胚及幼穗作外植体取材受季节限制的缺点，也针对其他作物以成熟胚作外植体要剥胚的繁琐操作，提供了一种农杆菌介导的以高粱成熟胚为外植体诱导愈伤组织的遗传转化方法；利用萌动后露白高粱种子作为农杆菌侵染对象，并以其做外植体诱导愈伤组织发生，经过筛选培养，得到抗性愈伤组织，再经过继代、分化、生根、移栽得到再生转化植株。避免了现有高粱遗传转化体系中以幼胚及幼穗作外植体取材受季节限制的缺点，也克服了其他作物以成熟胚作外植体时要剥胚的繁琐操作，大大提高高粱遗传转化的效率。本发明为利用生物技术对高粱进行遗传改良提供了参考和技术途径。

Description

一种农杆菌介导的以高粱成熟胚为外植体诱导愈伤组织的遗 传转化方法
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的以高粱成熟胚为外植体诱导愈伤组织的遗传转化方法。
背景技术
高粱(Sorghum bicolor (L.) Moench)是世界上重要的粮食、饲料和酿酒原料，因其本身具有抗旱耐涝、耐盐碱、耐贫瘠等特性，一直被作为旱作农田的先锋作物。目前，由于高粱的种质资源匮乏及有性杂交不亲和等原因，运用传统的育种方法进行品种改良进程缓慢，现代基因工程技术为高粱的快速遗传改良提供了新的途径。尽管高粱和其它农作物一样很早就开始了基因转化体系方面的研究，但进展缓慢，被公认为是基因转化最困难的作物之一。很大的原因是由于高粱组织培养愈伤诱导及再生频率较低，高效再生体系建立比较困难。
目前，常用的高粱基因转化方法有5 种：农杆菌介导法、基因枪法、PEG法、电激法和花粉管通道法。其中，前四种方法均依赖于植物高频率组织培养再生体系或原生质体培养体系的建立。近些年通过组织培养进行高粱遗传转化的报道逐渐增多，Zhao 等首次利用农杆菌介导法，利用高粱的幼胚作为受体材料，将外源基因bar 基因导入高粱，获得了转基因植株；朱莉等以甜高粱幼穗愈伤组织为转化受体，通过农杆菌介导法将Bt cry1Ah基因导入2个甜高粱品种“BABUSH”和“MN-3025”中；Lu 等和Wu 等使用高粱幼胚、幼穗等为外植体分别建立了高粱高效的遗传转化体系并分别获得了高达20.7%和33% 的遗传转化率。但这些成果仍然集中在少数模式材料中（Tx430、P898012及一些甜高粱品种上）。花粉管通道法进行高粱转基因，虽然不经过组织培养，但其存在操作难度大，转化率低，可重复性差等缺点，目前较前4种方法应用较少。
发明内容
本发明针对传统的高粱遗传转化体系中，以幼胚及幼穗作外植体取材受季节限制的缺点，也针对其他作物以成熟胚作外植体要剥胚的繁琐操作，提供了一种农杆菌介导的以高粱成熟胚为外植体诱导愈伤组织的遗传转化方法；利用萌动后露白高粱种子作为农杆菌侵染对象，并以其做外植体诱导愈伤组织发生，大大提高高粱遗传转化的效率。
本发明是通过如下技术方案实现的：一种农杆菌介导的以高粱成熟胚为外植体的遗传转化方法，利用萌动后露白高粱种子作为农杆菌侵染对象，并以其做外植体诱导愈伤组织发生，经过筛选培养，得到抗性愈伤组织，再经过继代、分化、生根、移栽得到再生转化植株。
具体步骤如下：
1）外植体的准备：挑选成熟饱满高粱种子，用自来水冲洗除去表面杂质，无菌条件下75%的酒精消1min，30%的双氧水消毒1.5-3.0 h；无菌水冲洗6 遍，将消毒后的种子置于装有无菌水的组培瓶中，25℃培养24 h，待其萌动露白后备用；
2）农杆菌的活化：将含有目标基因质粒的农杆菌菌株在冰中融化，接种于含有筛选压的YEP 液体培养基中，于28℃、220 r·min-1摇床培养过夜；菌液OD600=0.6-0.8时，将菌液8000 rpm离心，收集沉淀，用侵染培养基悬浮制作OD600=0.8的侵染液，加入乙酰丁香酮于28℃混匀后待用；其中：侵染培养基为：MS+水解酪蛋白氨基酸1 g/L+麦草畏5 mg/L +蔗糖65 g/L+葡萄糖30 g/L；
3）侵染：将萌动露白的高粱种子放到含侵染液的试管中，最大速度涡旋10s，然后室温静止5 min；弃去菌液，用无菌滤纸吸干残留的侵染液后接于共培养基中，25℃下暗培养3 d；其中共培养基为：MS +蔗糖20 g/L+葡萄糖10 g/L+2-（N-吗非啉）乙磺酸500 mg/L+琼脂8 g/L+ 麦草畏5 mg/L，高压灭菌后加乙酰丁香酮100 µMmol/L；
4）诱导愈伤组织：将萌动种胚转到愈伤组织诱导培养基上，28℃暗培养10-12 d；其中愈伤组织诱导培养基为：MS+ 麦草畏5 m/L +KT 3mg/L +蔗糖20 g/L+磷酸二氢钾1.53g/L+ Gelrite 2.4 g/L +硝酸银5 mg/L+酸水解酪蛋白氨基酸100 mg/L；头孢噻肟钠250mg/L；
5）筛选存活的胚性愈伤组织：将愈伤转到根据所转的外源基因不同的筛选压的筛选培养基上，28℃暗培养14 d；其中筛选培养基为：MS+麦草畏5 m/L +KT0.3 mg/L+蔗糖20g/L；KH2PO4 1.53 g/L+Gelrite2.4 g/L+硝酸银5 mg/L+酸水解酪蛋白氨基酸100 mg/L+头孢噻肟钠250 mg/L+对应筛选压；
6）再生培养：将筛选后存活的胚性愈伤组织转移到再生培养基上，26℃光照，16小时光照8小时黑暗循环下培养至少10-12d；其中再生培养基为MS+KT 0.5mg/L+蔗糖20g/L+KH2PO4 1.53 g/L+Gelrite 2.4 g/L+头孢噻肟钠250 mg/L+对应筛选压；
7）生根培养：转移全部的已分化的植株到生根培养基上，26℃-28℃光照条件下培养直到生根；其中生根培养基为：1/2MS +蔗糖20 g/L +Gelrite 2.4 g/L +头孢噻肟钠250mg/L；
8）所获得的再生苗移栽于温室或大田。
步骤2）中所述农杆菌菌株为LBA4404，内含pM3301UbiSpCP4质粒，携带的目标基因为CP4-EPSPS，全长10 293 bp，质粒目标基因CP4-EPSPS受组成型强启动子-玉米泛素启动子pZmUbi-1启动表达和NOS终止子调控，该基因既作为目的基因，又作为筛选标记。
步骤3）中侵染的萌动露白的高粱种子，胚根或胚芽伸出1-3mm时农杆菌侵染；每皿10-20粒侵染后的萌动种子；
所述侵染培养基、愈伤组织诱导培养基、筛选培养基和共培养基中的麦草畏5 mg/L用2，4-D 3 mg/L替换。
步骤5）中将愈伤转到筛选培养基上，每皿18-22个，28℃暗培养14 d，可继代培养。
所述筛选剂为25 mg/L草甘膦。所述高粱材料为“Is-623”。
所挑选成熟高粱种子进行所述方法转化时会因品种的不同其愈伤诱导率、转化率有所不同。
本发明与现有技术相比：避免了传统的高粱遗传转化体系中，以幼胚及幼穗作外植体取材受季节限制的缺点，也避免了其他作物如小麦、水稻等以成熟胚作外植体时要剥胚的繁琐操作。
本发明利用萌动后露白高粱种子作为农杆菌侵染对象，并以其做外植体诱导愈伤组织发生，大大提高高粱遗传转化的效率。本发明所述方法操作简单，成本费用低，不受季节限制。此外，本发明中首次使用了麦草畏（Ddicamba）作为诱导愈伤组织的激素，与传统诱导激素2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）、6-苄氨基嘌呤（6-BA ）相比，同样获得了较高的愈伤诱导率，其中愈伤诱导率在85%以上，达到甚至超过了高粱幼胚的愈伤诱导率。本发明建立的以高粱萌动种胚作为外植体的遗传转化体系，为高粱遗传转化体系的研究和应用奠定了基础。
附图说明
图1为pM3301UbiSpCP4质粒载体；
图2为转CP4-EPSPS基因高粱植株的获得；图中：A：农杆菌侵染萌动无菌露白的高粱种子；B：共培养；C：愈伤组织诱导培养；D：筛选培养；E：再生培养；F：生根；G：移栽于温室；H：草甘膦田间鉴定；I：获得抗性苗；
图3为麦草畏（Ddicamba）对高粱成熟萌动胚愈伤组织诱导率的影响；
图4为侵染时间对高粱遗传转化效率的影响；
图5为转基因高粱CP4-EPSPS基因PCR检测；图中：M：Trans2K PLUS marker；CK：非转基因对照；P：质粒阳性对照；1~26：转基因高粱株系；
图6为部分转基因高粱植株Southern blotting分析结果；图中：CK+：质粒pM3301UbiSpCP4；N：非转基因高粱；编号3、8、10和18：转基因高粱株系；
图7为部分转基因高粱植株抗草甘膦蛋白免疫试纸条检测结果；图中：CK1-：非转基因高粱；编号3、6、7、8、9、10、11、13、16、18、19、20、25：部分转基因高粱株系。
具体实施方式
以下结合具体实例对本发明进一步阐释。实施例是为了进一步说明本发明，而非对其限制，目的是让技术科研人员更直观的理解本发明。不以任何方式限制本发明，可做适当的修改而不违背本发明的实质和偏离本发明的范围。
一种农杆菌介导的以高粱成熟胚为外植体的遗传转化方法，利用萌动后露白高粱种子作为农杆菌侵染对象，并以其做外植体诱导愈伤组织发生，经过筛选培养，得到抗性愈伤组织，再经过继代、分化、生根、移栽得到再生转化植株。
一、实验方法、实验过程具体步骤如下：
1. 外植体的转化、筛选、再生：
1）试验所选取的受体材料：选用高粱材料“Is-623”成熟种子为待处理转化材料；
2）试验待转化的目的基因：如图1所示，农杆菌菌株为LBA4404，内含pM3301UbiSpCP4质粒，携带目的基因CP4-EPSPS，全长10 293 bp，产物对除草剂草甘膦具有很强抗性。质粒目的基因CP4-EPSPS受组成型强启动子-玉米泛素启动子pZmUbi-1启动表达和NOS终止子调控，该基因既可作为目的基因，又可作为筛选标记；
3）农杆菌的活化：将含有目标基因质粒的农杆菌菌株在冰中融化，接种于含有筛选压的YEP 液体培养基中，于28℃、220 r·min-1摇床培养过夜；菌液OD600=0.6-0.8时，将菌液8000 rpm离心，收集沉淀，用侵染培养基悬浮制作OD600=0.8的侵染液，加入乙酰丁香酮于28℃混匀后待用；其中：侵染培养基为：MS+水解酪蛋白氨基酸1 g/L+麦草畏5 mg/L +蔗糖65 g/L+葡萄糖30 g/L；
4）侵染：将萌动露白的高粱种子放到含侵染液的试管中，最大速度涡旋10s，然后室温静止5 min；弃去菌液，用无菌滤纸吸干残留的侵染液后接于共培养基中，25℃下暗培养3 d；其中共培养基为：MS +蔗糖20 g/L+葡萄糖10 g/L+2-（N-吗非啉）乙磺酸500 mg/L+琼脂8 g/L+ 麦草畏5 mg/L，高压灭菌后加乙酰丁香酮100 µMmol/L；
5）诱导愈伤组织：将萌动种胚转到愈伤组织诱导培养基上，28℃暗培养10-12 d；其中愈伤组织诱导培养基为：MS+ 麦草畏5 m/L +KT 3mg/L +蔗糖20 g/L+磷酸二氢钾1.53g/L+ Gelrite 2.4 g/L +硝酸银5 mg/L+酸水解酪蛋白氨基酸100 mg/L；头孢噻肟钠250mg/L；
6）筛选存活的胚性愈伤组织：将愈伤转入含25 mg/L草甘膦筛选培养基上，28℃暗培养14 d；其中筛选培养基为：MS+麦草畏5 m/L +KT0.3 mg/L+蔗糖20 g/L；KH2PO4 1.53 g/L+Gelrite2.4 g/L+硝酸银5 mg/L+酸水解酪蛋白氨基酸100 mg/L+头孢噻肟钠250 mg/L+草甘膦25 mg/L；进行3 轮继代筛选后，大部分愈伤组织生长缓慢，褐变腐死，只有少部分生长旺盛、颜色鲜嫩；
7）再生培养：将筛选后存活的胚性愈伤组织转移到再生培养基上，26℃光照，16小时光照8小时黑暗循环下培养至少10-12d；其中再生培养基为MS+KT 0.5mg/L+蔗糖20g/L+KH2PO4 1.53 g/L+Gelrite 2.4 g/L+头孢噻肟钠250 mg/L+草甘膦25 mg/L；
生根培养：转移全部的已分化的植株到生根培养基上，26℃-28℃光照条件下培养直到生根；其中生根培养基为：1/2MS +蔗糖20 g/L +Gelrite 2.4 g/L +头孢噻肟钠250mg/L；
所获得的再生苗缓苗、壮苗后，移栽到温室，如图2所示。
2. 麦草畏对高粱成熟萌动胚愈伤组织诱导的影响：本研究预备试验中将萌动露白的高粱种子分别放入加含有1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 mg/L Dicamba的愈伤组织诱导培养基上，28℃暗培养10-~12 d后统计愈伤组织诱导率。
愈伤组织诱导率=诱导出愈伤组织的外植体/接种外植体（萌动露白的高粱种子）总数×100%。
3. 侵染时间对高粱愈伤组织转化效率的影响：预备试验中将灭菌处理后萌动露白的高粱种子放在OD600 值为0.6-~0.8 的侵染液中分别侵染0.5、1.0、2 .0、3.0、4.0、5.0h后，共培养3 d，然后转到至愈伤组织诱导培养基上，28℃暗培养10-~12d。每个处理挑选健康生长的愈伤组织30块，重复3次，转到筛选培养基上，28℃暗培养14 d，统计抗性愈伤的比率。
4. 转化株的PCR检测：取愈伤组织再生的高粱抗性植株（T0代）与对照叶片0.2 g，CTAB法提取总DNA。用引物CP4-F：5'’-CGCGATCATACGGAAAAGAT -3'’，CP4-R：5'’-GTGACAGGGTTTTCCGACAC -3'’扩增导入的目的基因CP4-EPSPS，该引物扩增片段条带大小为668 bp。扩增程序为94℃预变性5 min；94℃变性30 s，60℃退火45 s，72℃延伸60 s，32个循环；72℃再延伸5 min 。PCR扩增产物用1.0%电泳分离，并观察拍照。
5. 转化植株的Southern blotting分析：取PCR阳性的转化株（T0代）叶片1 g，CTAB法提取高粱总基因组DNA，用H indⅢ与SalⅠ限制性内切酶双酶切后，将酶切产物于1%的琼脂糖凝胶上电泳分离。DNA 探针选用CP4-EPSPS基因大小为668 bp片段，Southernblot 试剂盒为瑞士Roche 公司的DIG DNALabling and Detection Kit。具体实试验方法见参照《分子克隆》，杂交后用X-光片显影曝光。
6. 转基因高粱CP4-EPSPS基因表达产物的测定：取Southern blotting分析阳性转化株（T0代）于对照叶片约0.2 g，采用北京奥创金标生物技术公司生产的CP4快速检测试纸条（北京奥创金标生物技术公司）方法，检测目标基因蛋白表达。
二、实验数据的处理及实验结果
1. 转CP4-EPSPS基因高粱植株的获得：生长良好的高粱成熟种子萌动胚经农杆菌侵染共培养后诱导愈伤组织，转移到愈伤组织诱导培养基上, 暗培养10-~12d后转入含25mg·L-1草甘膦筛选培养基上，28℃暗培养14 d，进行3 轮继代筛选，大部分愈伤组织生长缓慢，褐变腐死，少部分生长旺盛、颜色鲜嫩。经筛选共获得的301块抗性愈伤组织块，经过再生培养、生根培养、缓苗状苗后，移栽到温室（图2）。最终共获得了75个成活苗, ，19株PCR阳性植株，17株Southern blotting检测阳性植株。以获得的抗性愈伤组织为分母，计算得到的平均转化率为5.6%。
2.麦草畏对高粱成熟萌动胚愈伤组织诱导的影响：由图3试验结果可知，随着培养基中麦草畏浓度的提升高，外植体愈伤诱导率快速升高。当在麦草畏浓度为5 mg/L时，外植体愈伤诱导率达到最高；麦草畏浓度超过7.5 mg/L时则外植体愈伤诱导率明显下降；在当麦草畏浓度为15 mg/L时，不但外植体愈伤诱诱导率几乎为零，而且麦草畏对高粱萌动种子达到半致死剂量。综上所述，麦草畏对高粱成熟萌动胚愈伤组织适宜诱导浓度约为5 mg/L左右。
3.农杆菌侵染时间对高粱遗传转化效率的影响：由图4表明可知，随着农杆菌侵染时间的延长，在为0.5-~2 h范围内，随着侵染时间的逐渐延长，高粱遗传转化效率所获得的抗性愈伤比率呈先升高后稳定的趋势也逐渐增加。当农杆菌侵染时间为2 h时，高粱遗传转化效率达到了最高，但随着侵染时间延长到5h，遗传转化效率并没有继续增加，但也没有明显下降，而是转化效率保持在了一个稳定水平。考虑到试验效率问题，选择2 h作为农杆菌适宜的侵染时间。
4. 转化株的PCR分析：结果表明，有19株再生高粱和阳性对照(（质粒DNA）)均扩增出大小相同，长度为668 bp的目标条带，水空白对照和非转基因原受体高粱的负对照均未扩增出目标条带（如图5），初步证明外源基因CP4-EPSPS已导入受体高粱的基因组DNA 中。在75株成活苗中，仅有19株PCR检测成阳性，说明经筛选培养基筛选并再生的植株中有74%的比例为假阳性苗。
5. 转化株Southern blotting 分析：为了进一步研究CP4-EPSPS基因是否整合到高粱基因组DNA 中，我们对19株PCR检测呈阳性的植株进行Southern blotting杂交分子检测。取PCR阳性的转化株（T0代）叶片1 g，CTAB法提取高粱总基因组DNA，用HindⅢ与SalⅠ限制性内切酶双酶切后，将酶切产物于1%的琼脂糖凝胶上电泳分离。DNA 探针选用CP4-EPSPS基因大小为668 bp片段，Southern blot 试剂盒为瑞士Roche 公司的DIG DNA Lablingand Detection Kit。杂交后用X-光片显影曝光。转化株基因组DNA 经Hind Ⅲ与Sal酶双切后，质粒CK+和目的基因探针杂交后有17株显示了特异的阳性条带（如图6），而未转化的阴性对照植株（图6中N）无杂交信号，结果初步证实了CP4-EPSPS基因已整合到高粱基因组DNA中。其中转化材料10都出现了双条或多条杂交带，证明了部分材料外源基因以多拷贝的形式整合到了受体高粱材料的基因组中。
6. 所获得的转基因高粱CP4-EPSPS基因表达产物的测定：将Southern blotting杂交分子检测筛选鉴定后的转基因阳性植株17 株及阴性对照植株，分别利用北京奥创金标生物技术公司生产的CP4-EPSPS 蛋白检测试纸条检测，其中试纸条检测为阳性（两条带）的有12株，有5株转化株和阴性对照植株同表现为阴性。部分抗草甘膦蛋白免疫试纸条检测结果如见图7，图中材料3、6、7、8、9、10、11、13、16、18、20、25转化株CP4-EPSPS基因表达蛋白检测为阳性，图中材料19 虽然Southern blotting检测结果为阳性，但表达蛋白检测结果与非转基因对照检测结果同均为阴性。
本试验共获得了75个成活苗，19株PCR 阳性植株，17株Southern blotting检测阳性植株。以获得的抗性愈伤组织为分母，计算得到的平均转化率为5.6%。最终获得的田间正常表达目的基因性状的转化株有12株。

Claims (3)

1.一种农杆菌介导的以高粱成熟胚为外植体的遗传转化方法，其特征在于：利用萌动后露白高粱种子作为农杆菌侵染对象，并以其做外植体诱导愈伤组织发生，经过筛选培养，得到抗性愈伤组织，再经过继代、分化、生根、移栽得到再生转化植株；
具体步骤如下：
1）外植体的准备：挑选成熟饱满高粱种子，用自来水冲洗除去表面杂质，无菌条件下75%的酒精消1min，30%的双氧水消毒1.5-3.0 h；无菌水冲洗6 遍，将消毒后的种子置于装有无菌水的组培瓶中，25℃培养24 h，待其萌动露白后备用；
2）农杆菌的活化：将含有目标基因质粒的农杆菌菌株在冰中融化，接种于含有25mg/L草甘膦的YEP 液体培养基中，于28℃、220 r·min-1摇床培养过夜；菌液OD600=0.6-0.8时，将菌液8000 rpm离心，收集沉淀，用侵染培养基悬浮制作OD600=0.8的侵染液，加入乙酰丁香酮于28℃混匀后待用；其中：侵染培养基为：MS+水解酪蛋白氨基酸1 g/L+麦草畏5 mg/L+蔗糖65 g/L+葡萄糖30 g/L；
3）侵染：将萌动露白的高粱种子放到含侵染液的试管中，最大速度涡旋10s，然后室温静止5 min；弃去菌液，用无菌滤纸吸干残留的侵染液后接于共培养基中，25℃下暗培养3d；其中共培养基为：MS +蔗糖20 g/L+葡萄糖10 g/L+2-（N-吗非啉）乙磺酸500 mg/L+琼脂8g/L+ 麦草畏5 mg/L，高压灭菌后加乙酰丁香酮100 µMmol/L；
4）诱导愈伤组织：将萌动种胚转到愈伤组织诱导培养基上，28℃暗培养10-12 d；其中愈伤组织诱导培养基为：MS+ 麦草畏5 m/L +KT3mg/L +蔗糖20 g/L+磷酸二氢钾1.53 g/L+Gelrite 2.4 g/L +硝酸银5 mg/L+酸水解酪蛋白氨基酸100 mg/L；头孢噻肟钠250 mg/L；
5）筛选存活的胚性愈伤组织：将愈伤组织转入含有25mg/L草甘膦的筛选培养基上，28℃暗培养14 d；其中筛选培养基为：MS+麦草畏5 m/L +KT0.3 mg/L+蔗糖20 g/L；KH2PO41.53 g/L+Gelrite2.4 g/L+硝酸银5 mg/L+酸水解酪蛋白氨基酸100 mg/L+头孢噻肟钠250mg/L+25 mg/L草甘膦；
6）再生培养：将筛选后存活的胚性愈伤组织转移到再生培养基上，26℃光照，16小时光照8小时黑暗循环下培养至少10-12d；其中再生培养基为MS+KT 0.5mg/L+蔗糖20g/L+KH2PO41.53 g/L+Gelrite 2.4 g/L+头孢噻肟钠250 mg/L+25mg/L草甘膦；
7）生根培养：转移全部的已分化的植株到生根培养基上，26℃-28℃光照条件下培养直到生根；其中生根培养基为：1/2MS +蔗糖20 g/L +Gelrite 2.4 g/L +头孢噻肟钠250 mg/L；
8）所获得的再生苗移栽于温室或大田；
步骤2）中所述农杆菌菌株为LBA4404，内含pM3301UbiSpCP4质粒，携带的目标基因为CP4-EPSPS，质粒目标基因CP4-EPSPS受组成型强启动子-玉米泛素启动子pZmUbi-1启动表达和NOS终止子调控，该基因既作为目的基因，又作为筛选标记。
2.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的以高粱成熟胚为外植体的遗传转化方法，其特征在于：步骤3）中侵染的萌动露白的高粱种子，胚根或胚芽伸出1-3mm时农杆菌侵染；每皿10-20粒侵染后的萌动种子。
3.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的以高粱成熟胚为外植体的遗传转化方法，其特征在于：步骤5）中将愈伤转到筛选培养基上，每皿18-22个，28℃暗培养14 d。
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CN116262931A (zh) * 2021-12-14 2023-06-16 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 一种黍属植物的遗传转化方法
CN115369125B (zh) * 2022-09-28 2024-02-09 西藏自治区农牧科学院农业研究所 一种青稞遗传转化体系及转基因青稞培育方法
CN117004649B (zh) * 2023-09-26 2024-01-23 中国热带农业科学院三亚研究院 一种农杆菌介导的糜子高效遗传转化方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101218893A (zh) * 2007-12-29 2008-07-16 天津农学院 高粱成熟胚愈伤组织诱导及再生体系建立的方法
CN103849644A (zh) * 2012-12-07 2014-06-11 安徽科技学院 一种高粱胚芽接种转基因技术

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101218893A (zh) * 2007-12-29 2008-07-16 天津农学院 高粱成熟胚愈伤组织诱导及再生体系建立的方法
CN103849644A (zh) * 2012-12-07 2014-06-11 安徽科技学院 一种高粱胚芽接种转基因技术

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