CN110122332B - 一种糜子幼叶离体培养及植株再生的方法 - Google Patents

一种糜子幼叶离体培养及植株再生的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种糜子幼叶离体培养及植株再生的方法，包括以下步骤：（1）外植体的获取：将种子消毒后，接种至1/2 MS培养基表面，在25±1℃下暗培养2 d，待种子发芽后，在30℃±1℃下光培养5 d，得到无菌幼苗；在超净工作台上，取无菌幼苗的基部2 cm的部分，除去外层的茎壳，然后切成0.8‑1.0 cm的小段，得到外植体；（2）愈伤组织的诱导；（3）愈伤组织的分化；（4）诱导生根及植株移栽。本发明可以通过外植体幼叶离体培养出得到完整的糜子植株，避免了传统种植方式的单一化，对糜子品种改良、良种繁育、快速繁殖、脱毒苗生产、种质创新、糜子转基因技术等方面的研究具有重要意义。

Description

一种糜子幼叶离体培养及植株再生的方法
技术领域
本发明属于农业种苗繁殖技术领域，具体涉及一种糜子幼叶离体培养及植株再生的方法。
背景技术
植物组织离体培养及植株再生技术已在小麦、水稻、玉米、大豆、马铃薯、烟草、油菜、甘薯、高粱、向日葵、花生和荞麦等作物中得到了广泛应用，在作物的品种改良、良种繁育、快速繁殖、脱毒苗生产、种质创新及离体保存中起着重要作用。
糜子为一年生禾谷类粮食作物，含有较高的蛋白质、胡萝卜素、维生素和丰富的矿物质元素，营养价值和药用价值丰富。糜子主要种植在我国干旱和半干旱地区，传统的种植方式单一，管理粗放。目前，尚未有糜子关于幼叶离体培养及植株再生的研究，这严重制约了糜子在品种改良、良种繁育、快速繁殖、脱毒苗生产、种质创新方面的发展。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明提供一种糜子幼叶离体培养及植株再生的方法，能通过糜子幼叶离体培养最终能得到完整的糜子植株。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种糜子幼叶离体培养及植株再生的方法，包括以下步骤：
（1）外植体的获取：将种子消毒后，接种至1/2 MS培养基表面，在25±1℃下暗培养2 d，待种子发芽后，在30℃±1℃下光培养5 d，得到无菌幼苗；在超净工作台上，取无菌幼苗的基部2 cm的部分，除去外层的茎壳，然后切成0.8-1.0 cm的小段，得到外植体；
（2）愈伤组织的诱导：将外植体水平平铺接种在诱导培养基上，在25℃±1℃下暗培养3 w，得到愈伤组织；
（3）愈伤组织的分化：将得到的愈伤组织接种在第一分化培养基上，在光照下培养10 d；然后转移至第二分化培养基上在光照下培养，至分化出的幼芽长至3 cm得到幼苗；其中，第一分化培养基为：MS+ TDZ 0.5mg/L +蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH为5.8-6.0；第二分化培养基为：MS+ 6-BA 1.0 mg/L +IAA 0.5 mg/L + GA3 0.1 mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH为5.8-6.0；
（4）诱导生根及植株移栽：将幼苗转移至生根培养基中密封培养，待幼苗生根30 d后，敞开瓶口炼苗3 d，然后用蒸馏水清洗根部，移入盛有基质的花盆中，在湿度60.0%的条件下散光培养，待幼苗长出1-2片新叶，进行移栽。
优选地，步骤（4）中所述散光培养具体为：进行30℃±1℃、24000 lx 、14 h的光照培养和18℃±1℃、10 h的暗室培养。
优选地，所述诱导培养基为：MS+ 2,4-D 3.0 mg/L +蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH为5.8-6.0；或者N6+ 2,4-D 3.0 mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH为5.8-6.0。
优选地，所述生根培养基为：1/2MS+NAA 0.1 mg/L +蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH为5.8-6.0。
优选地，步骤（1）中所述种子消毒的具体操作为：选取饱满、无病虫害的成熟种子，用洗洁精清洗，流水冲洗10 min，转至超净工作台，然后将种子放入75wt%的乙醇中浸泡2min，无菌水冲洗1次后转入20wt%的次氯酸钠溶液中消毒15 min，最后用无菌水冲洗3次。
优选地，步骤（1）和步骤（3）中所述光培养的光照强度为12000 lx。
优选地，步骤（4）中所述基质为品氏泥炭土基质。
本发明所述2，4-D为2,4-二氯苯氧乙酸，NAA为萘乙酸， TDZ为噻苯隆、6-BA 为6-苄基腺嘌呤、IAA为吲哚乙酸、GA3为赤霉素，均为现有技术中常用的培养基组分。
本发明的优点：
本发明可以通过外植体幼叶离体培养出得到完整的糜子植株，避免了传统种植方式的单一化，对糜子品种改良、良种繁育、快速繁殖、脱毒苗生产、种质创新、糜子转基因技术等方面的研究具有重要意义。
附图说明
图1 实施例1中得到的愈伤组织；
图2 实施例1中愈伤组织经过第一分化培养基得到的组织；
图3 实施例1中愈伤组织经过第二分化培养基得到的组织；
图4 实施例1中幼苗的生根情况；
图5 实施例1中为移入花盆后的糜子幼苗(移栽后30 d)；
图6 实施例1中为移栽后抽穗的糜子幼苗(移栽后60 d)；
图7实施例1中成熟的糜子植株；
图8 实施例2中得到的愈伤组织；
图9 实施例2中愈伤组织经过第一分化培养基得到的组织；
图10实施例2中愈伤组织经过第二分化培养基得到的组织；
图11 实施例2中幼苗的生根情况；
图12 实施例2中移入花盆后的糜子幼苗（移栽后30 d）；
图13 实施例2中移栽后抽穗的糜子幼苗(移栽后60 d)；
图14实施例2中成熟的糜子植株。
具体实施方式
实施例1
一种糜子幼叶离体培养及植株再生的方法，包括以下步骤：
（1）外植体的获取：
（1.1）对种子进行消毒：选取饱满、无病虫害的成熟种子，用洗洁精清洗，流水冲洗10 min，转至超净工作台，然后将种子放入75（v/v）%的乙醇中浸泡2 min，无菌水冲洗1次后转入20（v/v）%的次氯酸钠溶液中消毒15 min，最后用无菌水冲洗3次；
（1.2）将种子消毒后，接种至1/2 MS培养基表面，在25±1℃下暗培养2 d，待种子发芽后，在12000 lx的光照下30℃±1℃培养5 d，得到无菌幼苗；在超净工作台上，取无菌幼苗的基部2 cm的部分，除去外层的茎壳，然后切成0.8-1.0cm的小段，得到外植体；
（2）愈伤组织的诱导：将外植体水平平铺接种在诱导培养基上，在25℃±1℃下暗培养3 w，得到愈伤组织，其中，所述诱导培养基为：MS+ 2,4-D 3.0 mg/L +蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH为5.8，得到的愈伤组织见图1，图1中a和b均显示有愈伤组织形成，为淡黄色；
（3）愈伤组织的分化：
将得到的愈伤组织接种在第一分化培养基上，在12000 lx光照下培养10 d，分化率达到40%，见图2；然后转移至第二分化培养基上在12000 lx光照下培养，至分化出的幼芽长至3 cm得到幼苗，见图3；其中，第一分化培养基为：MS+ TDZ 0.5mg/L +蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH为5.8；第二分化培养基为：MS+ 6-BA 1.0 mg/L +IAA 0.5 mg/L + GA3 0.1 mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH为5.8；
（4）诱导生根及植株移栽：
将幼苗转移至生根培养基中密封培养，7 d后幼苗开始生根，见图4，待幼苗生根30d后，敞开瓶口炼苗3 d，然后用蒸馏水清洗根部，移入盛有品氏泥炭土基质的花盆中，在湿度60.0%的条件下散光培养，移栽30 d后的糜子幼苗见图5；移栽后60 d，幼苗开始抽穗，见图6；其中，所述生根培养基为：1/2MS+NAA 0.1 mg/L +蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH为5.8；所述散光培养具体为：进行30℃±1℃、24000 lx 、14 h的光照培养和18℃±1℃、10 h的暗室培养。移栽后的成熟糜子植株见图7。
实施例2
一种糜子幼叶离体培养及植株再生的方法，包括以下步骤：
（1）外植体的获取：
（1.1）对种子进行消毒：选取饱满、无病虫害的成熟种子，用洗洁精清洗，流水冲洗10 min，转至超净工作台，然后将种子放入75（v/v）%的乙醇中浸泡2 min，无菌水冲洗1次后转入20（v/v）%的次氯酸钠溶液中消毒15 min，最后用无菌水冲洗3次；
（1.2）将种子消毒后，接种至1/2 MS培养基表面，在25±1℃下暗培养2d，待种子发芽后，在12000 lx的光照下30℃±1℃培养5d，得到无菌幼苗；在超净工作台上，取无菌幼苗的基部2 cm的部分，除去外层的茎壳，然后切成0.8-1.0cm的小段，得到外植体；
（2）愈伤组织的诱导：将外植体水平平铺接种在诱导培养基上，在25℃±1℃下暗培养3 w，得到愈伤组织，其中，所述诱导培养基为：N6+ 2,4-D 3.0 mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH为6.0，得到的愈伤组织见图8，图8中A和B均显示有愈伤组织形成，为淡黄色；
（3）愈伤组织的分化：
将得到的愈伤组织接种在第一分化培养基上，在12000 lx光照下培养10 d，分化率达到40%，见图9；然后转移至第二分化培养基上在12000 lx光照下培养，至分化出的幼芽长至3 cm得到幼苗，见图10；其中，第一分化培养基为：MS+ TDZ 0.5mg/L +蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH为6.0；第二分化培养基为：MS+ 6-BA 1.0 mg/L +IAA 0.5 mg/L + GA3 0.1 mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH为6.0；
（4）诱导生根及植株移栽：
将幼苗转移至生根培养基中密封培养，7d后幼苗开始生根，见图11，待幼苗生根30d后，敞开瓶口炼苗3 d，然后用蒸馏水清洗根部，移入盛有品氏泥炭土基质的花盆中，在湿度60.0%的条件下散光培养，移栽30 d后的糜子幼苗见图12；移栽后60 d，幼苗开始抽穗，见图13；其中，所述生根培养基为：1/2MS+NAA 0.1 mg/L +蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH为5.8；所述散光培养具体为：进行30℃±1℃、24000 lx 、14 h的光照培养和18℃±1℃、10 h的暗室培养。
本发明中所用的培养基的pH均是用0.01 mol/L的NaOH溶液调节的，在使用前均经过121℃高温灭菌20min。移栽后的成熟糜子植株见图14。

Claims (6)

1.一种糜子幼叶离体培养及植株再生的方法，包括以下步骤：
（1）外植体的获取：将种子消毒后，接种至1/2 MS培养基表面，在25±1℃下暗培养2 d，待种子发芽后，在30℃±1℃下光培养5 d，得到无菌幼苗；在超净工作台上，取无菌幼苗的基部2 cm的部分，除去外层的茎壳，然后切成0.8-1.0 cm的小段，得到外植体；
（2）愈伤组织的诱导：将外植体水平平铺接种在诱导培养基上，在25℃±1℃下暗培养3w，得到愈伤组织；
（3）愈伤组织的分化：将得到的愈伤组织接种在第一分化培养基上，光培养10 d；然后转移至第二分化培养基上进行光培养，至分化出的幼芽长至3 cm得到幼苗；其中，第一分化培养基为：MS+ TDZ 0.5mg/L +蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH为5.8-6.0；第二分化培养基为：MS+6-BA 1.0 mg/L +IAA 0.5 mg/L + GA3 0.1 mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH为5.8-6.0；
（4）诱导生根及植株移栽：将幼苗转移至生根培养基中密封培养，待幼苗生根30 d后，敞开瓶口炼苗3 d，然后用蒸馏水清洗根部，移入盛有基质的花盆中，在湿度60.0%的条件下散光培养，待幼苗长出1-2片新叶，进行移栽；
所述诱导培养基为N6+ 2,4-D 3.0 mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH为5.8-6.0。
2.根据权利要求1所述糜子幼叶离体培养及植株再生的方法，其特征在于：步骤（4）中所述散光培养具体为：进行30℃±1℃、24000 lx、14 h的光照培养和18℃±1℃、10 h的暗室培养。
3.根据权利要求1所述糜子幼叶离体培养及植株再生的方法，其特征在于：所述生根培养基为：1/2MS+NAA 0.1 mg/L +蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH为5.8-6.0。
4.根据权利要求1所述糜子幼叶离体培养及植株再生的方法，其特征在于：步骤（1）中所述种子消毒的具体操作为：选取饱满、无病虫害的成熟种子，用洗洁精清洗，流水冲洗10min，转至超净工作台，然后将种子放入75（v/v）%的乙醇中浸泡2 min，无菌水冲洗1次后转入20（v/v）%的次氯酸钠溶液中消毒15 min，最后用无菌水冲洗3次。
5.根据权利要求1所述糜子幼叶离体培养及植株再生的方法，其特征在于：步骤（1）和步骤（3）中所述光培养的光照强度为12000 lx。
6.根据权利要求1所述糜子幼叶离体培养及植株再生的方法，其特征在于：步骤（4）中所述基质为品氏泥炭土基质。
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