CN111213588B - 一种五指毛桃的简易高效组培繁殖方法 - Google Patents

一种五指毛桃的简易高效组培繁殖方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种五指毛桃的简易高效组培繁殖方法，将初始培养得到的无菌苗剪成1～2cm带腋芽节段，接种到芽增殖和生根二合一培养基上培养25～40d，得到生根苗；所述二合一培养基包括以下组分：MS改良培养基、6‑BA 0.3～0.6mg/L、NAA 0.1～0.3mg/L、活性炭0.1～0.5g/L、蔗糖25～30g/L、琼脂粉3.8～4.8g/L，PH＝5.8。本发明采用二合一培养实现了芽增殖和生根同步进行，大大缩短了培养周期，节约了培育成本。

Description

一种五指毛桃的简易高效组培繁殖方法
技术领域
本发明属于苗木无性繁殖技术领域,具体涉及一种五指毛桃的简易高效组培繁殖方法。
背景技术
五指毛桃(Ficus hirta Vahl)为桑科榕属的木本植物，又名粗叶榕、五指牛奶、土北芪，因其叶片形状像五指，而且叶片长有细毛，果实成熟时象毛桃而得名。五指毛桃通过组织培养的方式进行繁殖，具有保留五指毛桃的优良性状，且不受苗木繁殖季节性限制的优点。如公开号为CN104106468A的发明专利公开了一种五指毛桃的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：1)外植体的选择与消毒：取五指毛桃叶片作为外植体进行消毒；2)叶片分化获得丛生芽诱导培养：消毒后的外植体至于MS基本培养基中诱导得到丛生芽；3)丛生芽繁殖培养：将所述丛生芽置于MS繁殖培养基中进行繁殖；4)无菌苗生根培养：将丛生芽切成单芽置于1/2MS生根培养基中培养得到完整的带根苗；5)炼苗与移栽：取完整的带根苗进行炼苗后移植到按质量比为泥炭土：珍珠岩＝1：1的基质中，在该基质中生长一个月后移栽大田。但是上述方法中丛生芽繁殖和生根培养需要置于不同培养基中分步骤完成，丛生芽单芽置于丛生芽MS繁殖培养基中(含0.1-0.5mg/L的IAA、0.1-0.5mg/L的KT、25-30g/L蔗糖和3.8-4.8g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8)培养40天方可长出丛生芽，然后再将单芽置于生根培养基1/2MS生根培养基中(含0.5～1.5mg/L的IBA、0.1～0.5mg/L的NAA、25～30g/L蔗糖和3.8～4.8g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8)中继续培养40天方可出根。该发明中，由无菌苗到获得生根苗所需的时间为80天，存在培养周期长、成本高的不足。现有技术中已有通过将芽增殖和生根培养同步进行以缩短由无菌苗到获得生根苗所需时间的相关技术，如公开号为CN103858764A的发明专利，公开了鹅不食草一次成苗组培快繁方法,采用特殊的培养基使芽增殖和生根培养的同步进行，实现了由无菌苗到获得生根苗所需时间仅为30天。本申请人采用该发明中所述培养基及相关培养条件对五指毛桃进行芽增殖和生根培养，实验结果极不理想。本申请人推测，鹅不食草(Centipeda minina L)A.Br.etAschers.为菊科石胡荽属一年生草本植物，而五指毛桃为桑科榕属的木本植物，两者种属均不同，因此难以直接将鹅不食草的培养基用于五指毛桃的培养。
发明内容
本发明的目的是提供一种五指毛桃的简易高效组培繁殖方法，该方法能同步进行芽增殖和生根，大大缩短了培养周期，节约了培育成本。
本发明提供的技术方案是一种五指毛桃的简易高效组培繁殖方法，包括获得无菌苗的步骤以及将无菌苗进行芽增殖和生根培养步骤，其特征在于：所述将无菌苗进行芽增殖和生根培养是无菌苗剪成1～2cm带腋芽节段，接种到芽增殖和生根二合一培养基上培养25～40d，得到生根苗；所述二合一培养基包括以下组分：MS改良培养基、6-BA 0.3～0.6mg/L、NAA 0.1～0.3mg/L、活性炭0.1～0.5g/L、蔗糖25～30g/L、琼脂粉3.8～4.8g/L，PH＝5.8；
MS改良培养基的组成为：硝酸铵900～1000mg/L；硝酸钾1150～1300mg/L；磷酸二氢钾110～140mg/L；七水硫酸镁280～300mg/L；二水氯化钙250～
350mg/L；碘化钾0.83mg/L；硼酸6.2mg/L；四水硫酸锰22.3mg/L；七水硫酸锌8.6mg/L；二水钼酸钠0.25mg/L；五水硫酸铜0.025mg/L；六水氯化钴0.025mg/L；乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L；七水硫酸亚铁27.8mg/L；肌醇100mg/L；维生素B6 0.5mg/L；维生素B10.1mg/L；维生素B5 0.5mg/L；甘氨酸2.0mg/L；谷氨酰胺3.0mg/L。
作为优选，MS改良培养基的组成为：硝酸铵950mg/L；硝酸钾1200mg/L；磷酸二氢钾125mg/L；七水硫酸镁290mg/L；二水氯化钙320mg/L；碘化钾0.83mg/L；硼酸6.2mg/L；四水硫酸锰22.3mg/L；七水硫酸锌8.6mg/L；二水钼酸钠0.25mg/L；五水硫酸铜0.025mg/L；六水氯化钴0.025mg/L；乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L；七水硫酸亚铁27.8mg/L；肌醇100mg/L；维生素B6 0.5mg/L；维生素B1 0.1mg/L；维生素B5 0.5mg/L；甘氨酸2.0mg/L；谷氨酰胺3.0mg/L。
芽增殖和生根培养条件为：先置于培养温度25±2℃，光照强度1000～1500lx，光照时间为12～14h/d的条件下培养15～20d，然后提高光照强度至2000～3000lx，继续培养10～20d。
在二合一培养基中，在培养温度25±2℃，光照强度1000～1500lx，光照时间为12～14h/d的条件下培养15～20d，此时光强较弱，有利于分化出小芽，然后在温度、光照时间不变的条件下，提高光照强度培养至2000～3000lx继续培养10～20d时，可促进小芽继续长长。与芽分化繁殖同步进行的还有生根过程，在二合一培养基中培养15～20d时，带腋芽节段的基部切口处开始膨大长出愈伤组织，继续培养10～20d后从愈伤组织长出根。带腋芽节段在本发明所述的二合一培养基中经过25～40d的培养后，所得生根苗的苗高可达4～
7cm，每株苗平均出根3～8条，根较粗壮，生根率达100％。
在第一个周期结束后，可以采用经芽增殖和生根培养步骤所得的生根苗代替无菌苗，直接从所得生根苗上分化出的小芽上剪切1～2cm带腋芽节段接种至二合一培养基上，重新进行下一轮的芽增殖和生根培养。
获得无菌苗的步骤与现有技术相同，优选是将外植体置于初始培养基中，先暗培养10～12d，再置于温度为25±2℃的自然光照下培养15～20d而得。其中：
所述的外植体可选用五指毛桃的种子、叶片、叶柄、茎段等部位。外植体送入初始培养基培养之前需要进行常规的清洗、消毒处理。
当采用不同的部位作为外植体时，初始培养基的配方有所不同。在本申请中，优选采用种子作为外植体，此时，初始培养基的组成为：MS培养基、蔗糖25～30g/L、琼脂粉3.8～4.8g/L，PH＝5.8。当采用其他部位(如叶片、叶柄、茎段)作为外植体时，初始培养基中包含以下组分：MS培养基、蔗糖25～30g/L、琼脂粉3.8～4.8g/L、NAA 0.5～1.5mg/L、6-BA 0.5～1.5mg/L，PH＝5.8。申请人的试验结果表明，采用种子作为外植体，不仅消毒处理方便，而且在无需添加生长素和分裂素条件下即可获得长势良好的无菌苗(苗高可达3cm)。
在初始培养过程中，暗培养8～10d后，种子开始萌动，在自然光照条件下继续培养7d后，可长出小苗，培养15～25d后无菌苗可长至约3cm高。
炼苗与移栽：将生根苗炼苗5～7天后，移栽至装有基质的育苗袋内，基质由质量比为3：7的黄心土和泥炭土组成，浇水至基质湿透；然后放入育苗棚中进行培育，覆盖薄膜保湿，12d后逐步通风，每天掀开1/6～1/10的覆盖膜，直至全部掀开。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1)本发明采用改良的MS培养基与NAA、6-BA激素进行特定搭配而成的二合一培养基，能在较短的周期内(25-40d)有效促进五指毛桃无菌苗的带腋芽节段进行芽分化及生根，在有效缩短由无菌苗到获得生根苗所需时间的同时保证生根率达到100％，同时在相应周期内所得生根苗高可达4～7cm，每株苗平均出根3～8条且根系粗壮；无菌苗芽增殖系数为5～6。
2)采用本发明所述方法培育所得的生根苗进一步经移栽育苗后的成活率较高，达96％以上。
具体实施方式
以下实施例对本发明进行进一步阐述，但不作为对本发明的限定。
实施例1
1)外植体消毒：挑选完好健壮的五指毛桃的种子，剥去外皮，用水漂洗干净，置于室内阴干；在超净工作台上以0.1％HgCl2溶液消毒10min，再用无菌水清洗5次，沥干后待用。
2)初始培养：将消毒后的外植体接种至初始培养基上，先暗培养10d，再置于温度为23℃、自然光照下培养15d，得到无菌苗；初始培养基包括以下组分：MS培养基、蔗糖25g/L、琼脂粉3.8g/L，PH＝5.8。
3)芽增殖和生根培养：将无菌苗剪成1cm带腋芽节段，接种到芽增殖和生根二合一培养基上，先置于培养温度23℃，光照强度1000lx，光照时间为12h/d的条件下培养20d，然后在温度，光照时间不变的前提下，提高光照强度至2000lx，继续培养20d得到生根苗；所述二合一培养基包括以下组分：MS改良培养基、6-BA 0.3mg/L、NAA 0.1mg/L、活性炭0.1g/L、蔗糖25g/L、琼脂粉3.8g/L，PH＝5.8；
MS改良培养基的组成为：硝酸铵900mg/L；硝酸钾1150mg/L；磷酸二氢钾110mg/L；七水硫酸镁280mg/L；二水氯化钙250mg/L；碘化钾0.83mg/L；硼酸6.2mg/L；四水硫酸锰22.3mg/L；七水硫酸锌8.6mg/L；二水钼酸钠0.25mg/L；五水硫酸铜0.025mg/L；六水氯化钴0.025mg/L；乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L；七水硫酸亚铁27.8mg/L；肌醇100mg/L；维生素B60.5mg/L；维生素B1 0.1mg/L；维生素B5 0.5mg/L；甘氨酸2.0mg/L；谷氨酰胺3.0mg/L。
4)炼苗与移栽：将生根苗炼苗5天后，移栽至载有基质的育苗袋内，基质由质量比为3：7的黄心土和泥炭土组成，浇水至基质淋透；然后放入育苗棚中进行培育，覆盖薄膜保湿，12d后逐步通风，每天掀开1/6的覆盖膜，直至全部掀开。
对比例1
重复实施例1，不同的是，在步骤3)中，用现有常规的MS培养基代替MS改良培养基，其中常规的MS培养基的配方为：
硝酸铵1650mg/L；硝酸钾1900mg/L；磷酸二氢钾170mg/L；七水硫酸镁370mg/L；二水氯化钙440mg/L；碘化钾0.83mg/L；硼酸6.2mg/L；四水硫酸锰22.3mg/L；七水硫酸锌8.6mg/L；二水钼酸钠0.25mg/L；五水硫酸铜0.025mg/L；六水氯化钴0.025mg/L；乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L；七水硫酸亚铁27.8mg/L；肌醇100mg/L；维生素B6 0.5mg/L；维生素B10.1mg/L；维生素B5 0.5mg/L；甘氨酸2.0mg/L。
对比例2
重复实施例1，不同的是，在步骤3)中用CN103858764A公开的鹅不食草组培快繁培养基代替二合一培养基，鹅不食草组培快繁培养基的组成为：
Figure BDA0002406880150000051
Figure BDA0002406880150000061
对比例3
重复实施例1，不同的是，在步骤3)中的改良MS培养基的组成为：
硝酸铵1650mg/L；硝酸钾1900mg/L；磷酸二氢钾170mg/L；七水硫酸镁370mg/L；二水氯化钙440mg/L；碘化钾0.83mg/L；硼酸6.2mg/L；四水硫酸锰22.3mg/L；七水硫酸锌8.6mg/L；二水钼酸钠0.25mg/L；五水硫酸铜0.025mg/L；六水氯化钴0.025mg/L；乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L；七水硫酸亚铁27.8mg/L；肌醇100mg/L；维生素B6 0.5mg/L；维生素B10.1mg/L；维生素B5 0.5mg/L；甘氨酸2.0mg/L；谷氨酰胺3.0mg/L。
对比例4
重复实施例1，不同的是，在步骤3)中的改良MS培养基的组成为：
硝酸铵1650mg/L；硝酸钾1900mg/L；磷酸二氢钾110mg/L；七水硫酸镁300mg/L；二水氯化钙350mg/L；碘化钾0.83mg/L；硼酸6.2mg/L；四水硫酸锰22.3mg/L；七水硫酸锌8.6mg/L；二水钼酸钠0.25mg/L；五水硫酸铜0.025mg/L；六水氯化钴0.025mg/L；乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L；七水硫酸亚铁27.8mg/L；肌醇100mg/L；维生素B6 0.5mg/L；维生素B10.1mg/L；维生素B5 0.5mg/L；甘氨酸2.0mg/L。
实施例2
1)外植体消毒：从生长健壮、无病虫害的五指毛桃当年生枝条上切取叶片、叶柄和茎段，先用流水冲洗，加入稀释的洗洁精清洗，最后用毛刷把体表的硬毛刷去，置于超净工作台上。用75％的酒精浸泡60s，无菌水冲洗3次，然后用0.1％HgCl2溶液灭菌10min，无菌水冲洗6次。把经消毒灭菌的叶片切成0.5cm×1.0cm的小块，茎段和叶柄均切成0.5cm的小段。
2)初始培养：将消毒后的外植体接种至初始培养基上，先暗培养12d，再置于温度为27℃、自然光照下培养20d，得到无菌苗；初始培养基中包含以下组分：MS培养基、蔗糖30g/L、琼脂粉4.8g/L、NAA 1.5mg/L、6-BA 1.5mg/L，PH＝5.8。
3)芽增殖和生根培养：将无菌苗剪成1.5cm带腋芽节段，接种到芽增殖和生根二合一培养基上，先置于培养温度27℃，光照强度1500lx，光照时间为14h/d的条件下培养18d，然后在温度，光照时间不变的前提下提高光照强度至3000lx，继续培养17d得到生根苗；所述二合一培养基包括以下组分：MS改良培养基、6-BA 0.6mg/L、NAA 0.3mg/L、活性炭0.5g/L、蔗糖30g/L、琼脂粉4.8g/L，PH＝5.8；
MS改良培养基的组分为：硝酸铵1000mg/L；硝酸钾1300mg/L；磷酸二氢钾140mg/L；七水硫酸镁300mg/L；二水氯化钙350mg/L；碘化钾0.83mg/L；硼酸6.2mg/L；四水硫酸锰22.3mg/L；七水硫酸锌8.6mg/L；二水钼酸钠0.25mg/L；五水硫酸铜0.025mg/L；六水氯化钴0.025mg/L；乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L；七水硫酸亚铁27.8mg/L；肌醇100mg/L；维生素B60.5mg/L；维生素B1 0.1mg/L；维生素B5 0.5mg/L；甘氨酸2.0mg/L；谷氨酰胺3.0mg/L。
4)炼苗与移栽：将生根苗炼苗7天后，移栽至载有基质的育苗袋内，基质由质量比为3：7的黄心土和泥炭土组成，浇水至基质淋透；然后放入育苗棚中进行培育，覆盖薄膜保湿，12d后逐步通风，每天掀开1/10的覆盖膜，直至全部掀开。
实施例3
1)外植体消毒：挑选完好健壮的五指毛桃的种子，剥去外皮，用水漂洗干净，置于室内阴干；在超净工作台上以0.1％HgCl2溶液消毒10min，再用无菌水清洗5次，沥干后待用。
2)初始培养：将消毒后的外植体接种至初始培养基上，先暗培养11d，再置于温度为25℃、自然光照下培养18d，得到无菌苗；初始培养基中包含以下组分：MS培养基、蔗糖28g/L、琼脂粉4.2g/L、NAA 1.0mg/L、6-BA 1.0mg/L，PH＝5.8。
3)芽增殖和生根培养：将无菌苗剪成2cm带腋芽节段，接种到芽增殖和生根二合一培养基上，先置于培养温度25℃，光照强度1200lx，光照时间为13h/d的条件下培养15d，然后在温度，光照时间不变的前提下提高光照强度至2500lx，继续培养10d得到生根苗；所述二合一培养基包括以下组分：MS改良培养基、6-BA 0.45mg/L、NAA 0.2mg/L、活性炭0.25g/L、蔗糖28g/L、琼脂粉4.2g/L，PH＝5.8；
MS改良培养基的组成为：硝酸铵950mg/L；硝酸钾1200mg/L；磷酸二氢钾125mg/L；七水硫酸镁290mg/L；二水氯化钙320mg/L；碘化钾0.83mg/L；硼酸6.2mg/L；四水硫酸锰22.3mg/L；七水硫酸锌8.6mg/L；二水钼酸钠0.25mg/L；五水硫酸铜0.025mg/L；六水氯化钴0.025mg/L；乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L；七水硫酸亚铁27.8mg/L；肌醇100mg/L；维生素B60.5mg/L；维生素B1 0.1mg/L；维生素B5 0.5mg/L；甘氨酸2.0mg/L；谷氨酰胺3.0mg/L。
4)炼苗与移栽：将生根苗炼苗6天后，移栽至载有基质的育苗袋内，基质由质量比为3：7的黄心土和泥炭土组成，浇水至基质淋透；然后放入育苗棚中进行培育，覆盖薄膜保湿，12d后逐步通风，每天掀开1/8的覆盖膜，直至全部掀开。
下表为对上述实施例及对比例培育得到生根苗的性状对比：
Figure BDA0002406880150000081
Figure BDA0002406880150000091

Claims (7)

1.一种五指毛桃的简易高效组培繁殖方法，包括获得无菌苗的步骤以及将无菌苗进行芽增殖和生根培养步骤，其特征在于：所述将无菌苗进行芽增殖和生根培养是无菌苗剪成1～2cm带腋芽节段，接种到芽增殖和生根二合一培养基上培养25～40d，得到生根苗；所述二合一培养基包括以下组分：MS改良培养基、6-BA 0.3～0.6mg/L、NAA 0.1～0.3mg/L、活性炭0.1～0.5g/L、蔗糖25～30g/L、琼脂粉3.8～4.8g/L，pH=5.8；
MS改良培养基的组成为：硝酸铵900～1000mg/L；硝酸钾1150～1300mg/L；磷酸二氢钾110～140mg/L；七水硫酸镁280～300mg/L；二水氯化钙250～350mg/L；碘化钾0.83mg/L；硼酸6.2mg/L；四水硫酸锰22.3mg/L；七水硫酸锌8.6mg/L；二水钼酸钠0.25mg/L；五水硫酸铜0.025mg/L；六水氯化钴0.025mg/L；乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L；七水硫酸亚铁27.8mg/L；肌醇100mg/L；维生素B6 0.5mg/L；维生素B1 0.1 mg/L；维生素B5 0.5 mg/L；甘氨酸2.0mg/L；谷氨酰胺3.0 mg/L。
2.根据权利要求1所述的五指毛桃的简易高效组培繁殖方法，其特征在于：MS改良培养基的组成为：硝酸铵950mg/L；硝酸钾1200mg/L；磷酸二氢钾125mg/L；七水硫酸镁290mg/L；二水氯化钙320mg/L；碘化钾0.83mg/L；硼酸6.2mg/L；四水硫酸锰22.3mg/L；七水硫酸锌8.6mg/L；二水钼酸钠0.25mg/L；五水硫酸铜0.025mg/L；六水氯化钴0.025mg/L；乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L；七水硫酸亚铁27.8mg/L；肌醇100mg/L；维生素B6 0.5mg/L；维生素B1 0.1mg/L；维生素B5 0.5 mg/L；甘氨酸2.0mg/L；谷氨酰胺3.0 mg/L。
3.根据权利要求1所述的五指毛桃的简易高效组培繁殖方法，其特征在于：芽增殖和生根培养条件为：先置于培养温度25±2℃，光照强度1000～1500lx，光照时间为12～14h/d的条件下培养15～20d，然后提高光照强度至2000～3000lx，继续培养10～20d。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的五指毛桃的简易高效组培繁殖方法，其特征在于：在二合一培养基上培养25～40d后，从生根苗上剪切1～2cm带腋芽节段接种至二合一培养基上，进行下一轮的芽增殖和生根培养。
5.根据权利要求1～3中任一项所述的五指毛桃的简易高效组培繁殖方法，其特征在于：所述获得无菌苗的步骤是将外植体置于初始培养基中，先暗培养10～12d，再置于温度为25±2℃的自然光照下培养15～20d，得到无菌苗；当外植体为种子时，初始培养基包括以下组分：MS培养基、蔗糖25～30g/L、琼脂粉3.8～4.8g/L，pH=5.8；当外植体为叶片、叶柄或茎段时，初始培养基包含以下组分：MS培养基、蔗糖25～30g/L、琼脂粉3.8～4.8g/L、NAA0.5～1.5mg/L、6-BA 0.5～1.5mg/L，pH=5.8。
6.根据权利要求1～3中任一项所述的五指毛桃的简易高效组培繁殖方法，其特征在于：还包括炼苗与移栽步骤。
7.根据权利要求6所述的五指毛桃的简易高效组培繁殖方法，其特征在于：所述炼苗与移栽是将生根苗炼苗5～7天后，移栽至装有基质的育苗袋内，基质由质量比为3：7的黄心土和泥炭土组成，浇水至基质淋透；然后放入育苗棚中进行培育，覆盖薄膜保湿，12d后逐步通风，每天掀开1/6～1/10的覆盖膜，直至全部掀开。
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