CN112005885A

CN112005885A - 一种砂仁高效再生体系建立的方法

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Publication number: CN112005885A
Application number: CN202010991420.6A
Authority: CN
Inventors: 梁秋玲; 张能; 郭振粤; 谢黎黎; 李以卫; 班恒英
Original assignee: GUANGDONG LAND RECLAMATION TROPICAL CROP SCIENCE RESEARCH INSTITUTE
Current assignee: GUANGDONG LAND RECLAMATION TROPICAL CROP SCIENCE RESEARCH INSTITUTE
Priority date: 2020-09-21
Filing date: 2020-09-21
Publication date: 2020-12-01

Abstract

本发明公开了一种砂仁高效再生体系建立的方法，该方法包括采种母本选择与处理；无菌芽制备、单芽诱导、丛生芽诱导、丛生芽增殖、壮苗培养、生根培养、生根苗炼苗和生根苗移栽。本发明工艺流程设计合理，瓶苗生长整齐健壮，增殖倍率高且稳定，生根苗移栽成活率高，苗木定植后生长良好，实现了砂仁离体高效再生，适用于砂仁商业化育苗生产，具备良好的应用前景。

Description

一种砂仁高效再生体系建立的方法

技术领域

本发明涉及一种基于离体培养技术的砂仁高效再生体系建立方法，属于作物栽培与生理生化领域。

背景技术

砂仁(Amomum villosum Lour)，又名小豆蔻，为姜科豆蔻属多年生草本植物。砂仁为传统南药，以干燥果实供药用，主治脾胃气滞，宿食不消，腹痛痞胀，噎膈呕吐，寒泻冷痢；砂仁气香浓郁，味辛辣，亦是提味增鲜的调料。主要分布于福建、广东、广西和云南，其中以广东阳春的品质最佳。砂仁为半阴生植物，生长适宜郁闭度为30%～50%，可在橡胶林、油茶林及其他林木下种植，在保证林农经济利益前提下，有效缩短非投产期，具备良好的推广应用前景。

砂仁种苗繁殖通常采用种子繁殖和分株繁殖的方式。异花授粉植物实生苗性状分离严重，个体差异大；分株繁殖虽然能保持母本优良性状，但繁殖系数极低，不能在短时间内繁殖出大量种苗，满足不了种苗市场需求。砂仁高效离体再生体系，以砂仁优良母本匍匐茎顶芽为原始材料，通过诱导丛生芽增殖成苗，将优良单株无性系化，有效保证了苗木的遗传稳定性，每月增殖倍数可达3.0～3.5倍，有利于砂仁良种苗木稳定生产和集约化经营。

发明内容

本发明的目的是提供一种砂仁高效再生体系建立的方法，该方法可实现砂仁优势单株无性系化、良种苗木稳定快速繁殖。

本发明提供的一种砂仁高效再生体系建立的方法，该方法包括以下步骤：

1）采种母本选择与处理：采种母本来源于砂仁良种种质资源圃，于8～9月砂仁果实成熟期，选择生长健壮结果良好的单丛植株，标记为采种母本；标记植株采果后松土并施用有机肥0.8～1.2公斤/丛，施肥后培土，培土后使用0.2%尿素+0.1%多菌灵水溶液按5L/丛用量浇灌，每10天浇灌1次，共3次，促进匍匐茎大量发生。

2）无菌芽制备：连续晴天3天以上即可采芽，于晴天正午剪取采种母本匍匐茎顶芽，长度4～5cm，保留1个节位，在距离节位1cm处剪断，节位根系保留1～2mm多余剪断；将采集的芽置于饱和漂白粉溶液中浸泡25～35min，无菌水漂洗2次，转移至0.1%升汞溶液处理15～25min，使用无菌水漂洗4次以上，将漂洗干净的芽进行切割，切除原切口接触升汞溶液的部分，将根系切除，接种到空白MS培养基；该培养基附加蔗糖30g/L、卡拉胶6g/L，灭菌前pH调节为5.8，灭菌温度121℃、压力1.1 kg/cm²、灭菌时间20min，培养环境为温度27℃±1℃，光照1500～2000lx，光照时间为12h/d；后续培养基未加以说明的培养基中卡拉胶用量、pH调节、灭菌方法均与步骤2）相同，未加以说明的培养环境均与步骤2）相同。

3）单芽诱导：步骤2）获得的离体顶芽经过10～15d培养，剔除污染，接种到单芽诱导培养基培养，培养30d后，单芽拔节长高成苗，叶片展开，基部节位侧芽萌动，在无菌条件下，切除叶片，将苗分为带2～3个节的茎段，重新接入单芽诱导培养基，培养时间30d；

4）丛生芽的诱导：将步骤3）获得的侧芽形成单芽的茎段取出，分割为带一个侧芽的茎段，接种至丛生芽诱导培养基；接种30d后，原接种单芽膨大且基部着生少量不定芽，将其纵切为带一半原单芽及部分不定芽的组织块，转移至相同培养基，继续培养30d形成密集矮缩的丛生芽；

5）丛生芽增殖：将步骤4）获得的密集丛生芽，切割为带3～4个不定芽的组织块，接种至丛生芽增殖培养基；培养30d后，原接种组织块体积迅速增加，不定芽形成1.5～2cm且生长健壮单芽的丛生芽，丛生芽高生长同时，基部形成较多的不定芽，实现迅速增殖；丛生芽增殖30d继代转接1次，整个繁育周期共重复继代8～10次；

6）壮苗培养：将步骤5）获得的健壮丛生芽，切割为带3～5个健壮单芽的组织块，接种至壮苗培养基，培养30d；

7）生根培养：将步骤6）获得的单芽切割分级，植株高度在3.0～4.0cm的单芽接种至生根培养基，植株高度小于3.0cm的芽重新接种至步骤6）壮苗培养基；生根苗接种后1～15d，光照12h/d；接种后16～30d，光照14h/d；

8）生根苗炼苗：将步骤7）获得的生根苗，带瓶置于温室内进行炼苗，炼苗棚温度20～35℃，晴天9:00～16:30炼苗棚棚顶遮阳，其余时间遮阳网全开透光，阴雨天全天透光；炼苗第1～15d不开瓶盖，第16d打开瓶盖，继续炼苗2～3d即可移栽；

9）生根苗移栽：将炼苗完成的生根苗洗净根部培养基，使用30%精甲霜灵·噁霉灵1500倍液浸泡苗木10～15min，沥干至不滴水即可移栽；移栽使用72孔穴盘，基质使用体积比泥炭土：珍珠岩=9:1混合均匀装盘，定植前使用清水润湿基质，定植完成后使用50%敌黄钠500倍液均匀喷雾至穴盘底部滴水，不另行浇定根水，定植后7～10d使用多菌灵600～800倍液+复硝酚钠1500～2000倍液喷撒植株及基质表面；育苗床需覆盖透光率75%遮阳网。

本发明的意义：

本发明所提供的砂仁离体高效再生体系，可将砂仁优选单株无性系化，保持母本优良性状，苗木均一稳定，为栽培整齐度及预期产量奠定了良好基础；使用匍匐茎顶芽萌发丛生芽为继代材料，只需少量母本笋芽进入再生环节，即可呈几何倍数增殖，克服了种源数量对出苗数量的限制，有效降低了生产成本；在离体培养过程中，对真菌和细菌病害起到了较好的脱毒效果，有利于砂仁健康种苗生产。

本发明工艺流程合理，可操作性强，效果稳定且生产成本低，具备推广优势。

具体实施方式

下面以实施例对本发明作进一步说明。

实施例：

1）采种母本选择与处理：采种母本来源于阳春市林业局阳春砂仁良种种质资源圃。于2018年8月5日对种质资源圃内阳春砂仁种质资源“黄苗仔”群体进行生长势及结果性状调查，选择生长健壮结果良好的单丛植株，标记为采种母本。2018年9月5日标记的采种母本植株果实采收，于当日松土并施用有机肥1.0公斤/丛，施肥后培土，于2018年9月5日、15日及25日分别使用0.2%尿素+0.1%多菌灵水溶液按5L/丛用量浇灌，共3次，2018年9月30日观察，标记采种母本植株匍匐茎大量发生并生长健壮。

2）无菌芽制备：2018年10月10日正午剪取采种母本匍匐茎顶芽，长度4～5cm，保留1个节位，在距离节位1cm处剪断，节位根系保留1～2mm多余剪断；将采集的芽置于饱和漂白粉溶液中浸泡30min，无菌水漂洗2次，转移至0.1%升汞溶液处理20min，使用无菌水漂洗5次以上，将漂洗干净的芽进行切割，切除原切口接触升汞溶液的部分，将根系切除，接种到空白MS培养基；该培养基附加蔗糖30g/L、卡拉胶6g/L，灭菌前pH调节为5.8，灭菌温度121℃、压力1.1 kg/cm²、灭菌时间20min，培养环境为温度27℃±1℃，光照1500～2000lx，光照时间为12h/d；后续培养基未加以说明的培养基中卡拉胶用量、pH调节、灭菌方法均与步骤2）相同，未加以说明的培养环境均与步骤2）相同。

3）单芽诱导：2018年10月25日，将步骤2）获得的离体顶芽，剔除污染，接种到单芽诱导培养基培养，单芽培养基配方为1.2MS+ 6-BA3.0 mg /L+NAA0.6 mg/L+核黄素0.2mg/L，1.2MS为MS基上大量元素用量提高20%，微量元素、铁盐及有机物与MS相同，该培养基蔗糖用量45g/L。培养30d后观察，单芽拔节长高成苗，叶片展开，基部节位侧芽萌动，于2018年11月25日转接，无菌条件下，切除叶片，将苗分为带2～3个节的茎段，重新接入单芽诱导培养基，培养时间30d；

4）丛生芽的诱导：2018年12月25日，将步骤3）获得的侧芽形成单芽的茎段取出，分割为带一个侧芽的茎段，接种至丛生芽诱导培养基，丛生芽诱导培养基配方为1.2MS+ 6-BA6.0mg /L+氯吡脲0.6 mg/L，该培养基蔗糖用量45g/L。2019年1月25日观察，原接种单芽膨大且基部着生少量不定芽，于2019年1月25日将其纵切为带一半原单芽及部分不定芽的组织块，转移至相同培养基继续培养，2019年2月25日观察，已形成密集矮缩的丛生芽；

5）丛生芽增殖：2019年2月25日，将步骤4）获得的密集丛生芽，切割为带3～4个不定芽的组织块，接种至丛生芽增殖培养基，丛生芽增殖培养基配方为1.2MS+ 6-BA3.0mg /L+氯吡脲0.3 mg/L，该培养基蔗糖用量45g/L。2019年3月25日观察，原接种组织块体积迅速增加，不定芽形成1.5～2cm且生长健壮单芽的丛生芽，丛生芽高生长同时，基部形成较多的不定芽，实现迅速增殖；其后丛生芽增殖30d继代转接1次；

6）壮苗培养：2019年4月25日，将步骤5）获得的健壮丛生芽，切割为带3～5个健壮单芽的组织块，接种至壮苗培养基，壮苗培养基配方为1.2MS +氯吡脲0.1 mg/L+NAA0.1 mg/L，该培养基蔗糖用量60g/L。培养30d后观察，原接种芽高生长明显，且基部也产生不定芽并发育成可见单芽；

7）生根培养：2019年5月25日，将步骤6）获得的单芽切割分级，植株高度在3.0～4.0cm的单芽接种至生根培养基，生根培养基配方为MS+ NAA0.5mg/ L+IBA0.1+甲哌嗡0.1mg / L+活性炭50mg / L，附加60g/L蔗糖。植株高度小于3.0cm的芽重新接种至步骤6）壮苗培养基；生根苗接种后1～15d，光照12h/d；接种后16～30d，光照14h/d；

8）生根苗炼苗：2019年6月25日将步骤7）获得的生根苗，带瓶置于控温温室内进行炼苗，炼苗棚温度20～35℃，晴天9:00～16:30炼苗棚棚顶遮阳，其余时间遮阳网全开透光，阴雨天全天透光；2019年7月11日打开瓶盖，继续炼苗3d；

9）生根苗移栽：2019年7月14日将炼苗完成的生根苗洗净根部培养基，使用30%精甲霜灵·噁霉灵1500倍液浸泡苗木15min，沥干至不滴水即可移栽；移栽使用72孔穴盘，基质使用体积比泥炭土：珍珠岩=9:1混合均匀装盘，定植前使用清水润湿基质，定植完成后使用50%敌黄钠500倍液均匀喷雾至穴盘底部滴水，不另行浇定根水，定植后7d使用多菌灵800倍液+复硝酚钠2000倍液喷撒植株及基质表面；育苗床需覆盖透光率75%遮阳网。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种砂仁高效再生体系建立的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1）采种母本选择与处理：采种母本来源于砂仁良种种质资源圃，于8～9月砂仁果实成熟期，选择生长健壮结果良好的单丛植株，标记为采种母本；标记植株采果后松土并施用有机肥0.8～1.2公斤/丛，施肥后培土，培土后使用0.2%尿素+0.1%多菌灵水溶液按5L/丛用量浇灌，每10天浇灌1次，共3次，促进匍匐茎大量发生；

2）无菌芽制备：连续晴天3天以上即可采芽，于晴天正午剪取采种母本匍匐茎顶芽，长度4～5cm，保留1个节位，在距离节位1cm处剪断，节位根系保留1～2mm多余剪断；将采集的芽置于饱和漂白粉溶液中浸泡25～35min，无菌水漂洗2次，转移至0.1%升汞溶液处理15～25min，使用无菌水漂洗4次以上，将漂洗干净的芽进行切割，切除原切口接触升汞溶液的部分，将根系切除，接种到空白MS培养基；该培养基附加蔗糖30g/L、卡拉胶6g/L，灭菌前pH调节为5.8，灭菌温度121℃、压力1.1 kg/cm²、灭菌时间20min，培养环境为温度27℃±1℃，光照1500～2000lx，光照时间为12h/d；后续培养基未加以说明的培养基中卡拉胶用量、pH调节、灭菌方法均与步骤2）相同，未加以说明的培养环境均与步骤2）相同；

2.根据权利要求1所述的一种砂仁高效再生体系建立的方法，其特征在于，在步骤3）中，单芽培养基配方为1.2MS+ 6-BA3.0 mg /L+NAA0.6 mg/L+核黄素0.2mg/L，1.2MS为MS基上大量元素用量提高20%，微量元素、铁盐及有机物与MS相同，该培养基蔗糖用量45g/L。

3.根据权利要求1所述的一种砂仁高效再生体系建立的方法，其特征在于：在步骤4）中，丛生芽诱导培养基配方为1.2MS+ 6-BA6.0mg /L+氯吡脲0.6 mg/L，该培养基蔗糖用量45g/L。

4.根据权利要求1所述的一种砂仁高效再生体系建立的方法，其特征在于：在步骤5）中，丛生芽增殖培养基配方为1.2MS+ 6-BA3.0mg /L+氯吡脲0.3 mg/L，该培养基蔗糖用量45g/L。

5.根据权利要求1所述的一种砂仁高效再生体系建立的方法，其特征在于，在步骤6）中，壮苗培养基配方为1.2MS +氯吡脲0.1 mg/L+NAA0.1 mg/L，该培养基蔗糖用量60g/L。

6.根据权利要求1所述的一种砂仁高效再生体系建立的方法，其特征在于：在步骤7）中，生根培养基配方为MS+ NAA0.5mg/ L+IBA0.1+甲哌嗡0.1mg / L+活性炭50mg / L，附加60g/L蔗糖。