CN113317205A - 一种阳春砂利用基茎丛生芽和“节繁殖”培养的高效人工育苗方法 - Google Patents
一种阳春砂利用基茎丛生芽和“节繁殖”培养的高效人工育苗方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种阳春砂利用基茎丛生芽和“节繁殖”培养的高效人工育苗方法，包括的步骤有：将消毒灭菌处理后的带芽根茎外植体接种于培养基中，进行基茎丛生芽发生和增殖、“节繁殖”增殖、生根诱导、炼苗移栽。本发明对阳春砂种苗的生产工艺进行了优化调整，同步进行基茎丛芽诱导发生、增殖及“节繁殖”增殖，简化了组培过程，3个培养过程同时在一个培养基中进行，极大地提高了人工体外繁殖效率。此外，本发明解决了姜科豆蔻属植物组织培养过程中增殖系数低、遗传稳定性不强等现象，且成本低、周期短、质量和成活率高。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种阳春砂利用基茎丛生芽和“节繁殖”培养的高效人工育苗方法。
背景技术
砂仁为姜科(Zingiberaceae)豆蔻属(Amomum)草本植物阳春砂(A.villosumLour.)、绿壳砂(A.villosum Lour.var xanthioides T.L.Wu et Senjen)或海南砂(A.longiligulare T.L.Wu)的干燥成熟果实，其性辛、温，有化湿开胃，温脾止泻，理气安胎之效，是中药方剂中常用的药材，也是香砂六君子丸、香砂养胃丸等中成药的主药。现代药理研究表明，砂仁含乙酸龙脑酯、樟脑、龙脑等挥发性成分，有胃肠保护、镇痛、抗炎、止泻、抑菌、调节菌群、降血糖、抗氧化等药理作用。砂仁不仅可以药用，也可用其做成菜肴，药食同源，享誉四方，在国内中草药市场始终占据着重要地位。在中国，砂仁主产于福建、广东、广西和云南，栽培或野生于山地荫湿之处，其中以广东阳春县所产质最佳，称阳春砂仁。现今仍以广东阳春县所产最为道地，而以云南产区产量最大。
由于阳春砂花器结构特殊，授粉昆虫活动空间狭窄，使授粉困难，自然结实率低，人工授粉效率低下，导致砂仁坐果率不断下降，但市场需求量越来越大，供不应求，价格日益增高，商家以次充好，出现质量混淆不清的现象。在自然界中，阳春砂多行有性繁殖(种子繁殖)、偶见无性繁殖(根状茎繁殖)。人工繁殖仍以上述2种方式为主，更多见于根状茎繁殖。尽管阳春砂种子数量较多，人工播种易于操作，但由于种胚具生理后熟、种子结构缺陷和内源抑制物等现象，使其具有综合休眠现象，造成自然萌发率极低；只有在种子基数足够大的情况下才能获得量化种苗。同时，由实生苗发育至应用于商业的开花结实植株通常需要 3-4年或更长，因而种子繁殖也没有实用价值。根状茎繁殖虽然出苗较快，但一个根状茎每年只产生2-3个芽且存在株群衰老，种质下降的情况，较低的繁殖率限制了阳春砂大规模种植和在药学上的应用。组织培养技术不仅有生长快、周期短、可重复性强等优点，且材料来源单一，可保留植株原有的优良性状，短期能获大量遗传性质高度一致的种苗。植物离体培养技术的发展，为药用植物资源稀缺提供了有效的保障。在阳春砂中仅有极少数对组织培养的报道，均采用外植体 -愈伤组织-不定芽的方法，但也只停留在成功诱导愈伤组织，未进一步形成完整植株，使组培苗的整体应用仍处于较低水平。因此，需要寻求一种新的成本低、时间短、质量和成活率高，且能将优良性状固定下来的无性繁殖方法来扩大阳春砂尤其是优质种种苗的繁殖量，进行高品质种苗的工厂化生产，以满足种植需求。
发明内容
本发明的目的在于解决上述现有繁殖技术存在的缺陷，提供一种能够提高阳春砂快速繁殖效率的方法，该方法为固定优质品种性状、发展人工种植奠定了技术基础。通过本发明，可提供基因型背景一致的优质种苗以满足人工种植的需求。
为了解决以上技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种阳春砂利用基茎丛生芽和“节繁殖”培养的高效人工育苗方法，包括的步骤有：将消毒灭菌处理后的带芽根茎外植体接种于培养基中，进行基丛生芽诱导发生、增殖及“节繁殖”增殖、生根诱导、炼苗移栽。
进一步地，所述的阳春砂利用基茎丛生芽和“节繁殖”培养的高效人工育苗方法，包括以下步骤：
(1)外植体的获取：选择生长势好、无病虫害的健壮植株，取其地下根茎芽；
(2)将步骤(1)的根茎芽进行消毒处理；
(3)启动培养：将经过步骤(2)消毒灭菌好的根茎芽为材料，接入下列培养基A中，所述培养基A，包括以下原料：
MS基本培养液
6-苄胺基嘌呤
蔗糖
琼脂粉
控制光照度、温度、光照时间的条件下进行根茎芽的启动培养；
(4)基茎丛生芽发生增殖和“节繁殖”培养：在步骤(3)培养基中继代增殖3-5代后，将步骤(3)中培养的增殖苗转入下列培养基B中，所述培养基B，包括以下原料：
MS基本培养液
6-苄胺基嘌呤
激动素
2,4-二氯苯氧乙酸
α-萘乙酸
蔗糖
琼脂粉
控制光照度、温度、光照时间的条件下进行培养；
(5)重复步骤(4)，基茎处有大量粗壮丛苗，加上“节繁殖”现象的出现，使阳春砂增殖系数大大增加；
(6)取步骤(5)丛芽中的健壮主苗或“节繁殖”中已生根的枝条接种于下列培养基C中，所述培养基C，包括以下原料：
1/2MS基本培养液
α-萘乙酸
蔗糖
琼脂粉
控制光照度、温度、光照时间的条件下进行培养，即可获得苗壮根粗的生根苗；
(7)炼苗和移栽：取步骤(6)中的生根植株置于室温下炼苗，从培养基中取出幼苗，将残留培养基清洗干净，放入多菌灵溶液中消毒，后移栽至经消毒的腐殖质土中保温保湿培养，即得移栽苗。
进一步地，步骤(2)中所述根茎芽进行消毒处理的方法为：用自来水清洗洗去表面泥土后用质量百分比10％洗衣粉溶液浸泡10min并轻微震荡搅动后流水冲洗30min，置于超净工作台上用体积百分比75％乙醇溶液处理15s，再用质量百分比0.1％升汞水溶液灭菌10min，最后无菌水冲洗3次，每次不低于3min，在整个消毒过程中充分摇动器皿。
进一步地，步骤(3)中所述培养基A，包括以下原料：
MS基本培养液：
6-苄胺基嘌呤 2.0-3.0mg/L
蔗糖 30000mg/L
琼脂粉 4700mg/L。
进一步地，所述培养基A的pH值为5.4-5.8。
进一步地，步骤(4)中所述培养基B，包括以下原料：
MS基本培养液：
进一步地，所述培养基B的pH值为5.4-5.8。
进一步地，步骤(6)中所述培养基C，包括以下原料：
1/2MS基本培养液
α-萘乙酸 2.0-3.0mg/L
蔗糖 15000mg/L
琼脂粉 4700mg/L
进一步地，所述培养基C的pH值为5.4-5.8。
进一步地，所述多菌灵溶液的质量浓度为0.1-0.2％。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明用组织培养技术在培养室内可实现周年生产，既节约了土地资源，又提高了经济效益，克服了传统繁殖方式无法周年进行生产的难点；
(2)本发明实现了高效快繁的目的，60d为一个增殖培养周期，繁殖系数可达9.5以上；
(3)本发明基茎丛生芽基部在培养早期会出现白色膨大，随着培养时间的延长，白色膨大缩小甚至消失，基茎丛生芽节间伸长，节上长出不定根而无侧芽发生，按1-2节剪切下就可成为一个完整的新材料，这种现象本发明称之为“节繁殖”。“节繁殖”现象的出现，加上基茎丛生芽，使阳春砂瓶苗增殖系数大大增加，远远超过姜科植物已有的报道，既可在满足大规模生产需要的同时，又保持了母本的优良性状，为其人工快繁最有效的增殖方式，且提高了种苗质量；
(4)本发明解决了传统种子繁殖后代分离大、性状不稳定而导致的种苗品质不一的难题，通过本发明，可使所有种苗保持同一基因型背景，易于标准化、工厂化操作，有效地提高了种苗质量，可为大面积推广种植提供统一标准的优良种苗；
(5)本发明除启动初代增殖培养后，在同一培养基中可同时进行基丛生芽诱导发生和增殖、“节繁殖”增殖，简化了培养程序；在无菌体系，即启动初代培养后，整个快速繁殖过程只需2种培养基就解决了从基茎丛芽诱导发生和增殖、“节繁殖”现象以及生根问题，利于安排生产计划；
(6)本发明生根瓶苗移栽成活率高，且生长迅速，目前已在云南省云南西双版纳曼飞龙农场进行示范推广栽培，效果很好；
(7)本发明对阳春砂离体快速繁殖和遗传改良具有重要意义和价值，同时也可为其他姜科豆蔻属植物的体外快繁提供技术参考。
附图说明
图1为无菌体系的建立(启动培养)及初步增殖的图
其中图1-A为接入15d后根茎芽开始有萌发迹象图；图1-B为30d后，根茎芽开始迅速生长图；图1-C为45d后，叶柄逐渐伸长，叶片开始分化，在基部有新芽发生图；图-D为60d后，老芽叶柄继续伸长，叶片舒展，新芽亦开始迅速生长，无菌体系建成图；在此培养基中每一代增殖系数约为1.73左右，3-5 代后材料逐渐增多。
图2为基茎丛生芽诱导发生、增殖和“节繁殖”增殖的图
其中图2-A为材料接入15d后，基茎开始出现新芽，芽基部呈白色膨大状图；图2-B为30d后，基茎丛芽生长迅速，叶柄伸长，叶片舒展，白色膨大更加明显图；图2-C、D为45d后，随着根状茎的膨大，基茎丛生芽进一步增多，不定根出现于原白色膨大处，白色膨大逐渐消失，且不定根有向上发生的趋势图；图2-E、F为60d后，除了基茎丛生芽外，根状茎背地性生长，每个节处均有不定根出现，本发明称这种现象为“节繁殖”，此时增殖系数可达9.5左右图。
图3为生根培养图
其中图3-A为10d后不定根出现，叶芽开始萌动图；图3-B、C为30d后，新的不定根不断出现，植株叶柄伸长，叶片逐渐展开图；图3-D、E为45d后，不定根变粗并进一步伸长，植株生长迅速图；图3-F、G为60d后，苗壮根粗且多，植株呈深绿色图；图H为组培苗发达的不定根系图。
图4为驯化移栽图
其中图4-A为炼苗后，移栽60d试管苗成活率100％图；图4-B、C为120d 后，叶柄伸长，叶片展开，新叶亦快速生长图；图4-D为大田种植90d生长状况良好图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种阳春砂利用基茎丛生芽和“节繁殖”培养的高效人工育苗方法，包括以下步骤：
(1)外植体的获取：选择生长势好、无病虫害的健壮植株，取其地下根茎芽。
(2)将步骤(1)的根茎芽先用自来水清洗洗去表面泥土后用质量百分比10％洗衣粉溶液浸泡10min并轻微震荡搅动后流水冲洗30min，置于超净工作台上用体积百分比75％乙醇溶液处理15s，再用质量百分比0.1％升汞水溶液灭菌10min，最后无菌水冲洗3次，每次不低于3min，在整个消毒过程中充分摇动器皿。
(3)启动培养及初步增殖：将经过步骤(2)消毒灭菌好的根茎芽为材料，按1.0×1.0cm大小切取，接入下列培养基A中：
MS基本培养液：
培养条件：在光照度1500-2000lx，光照时间10h/d，温度控制在23±2℃的条件下进行启动培养及初步增殖，15d后根茎芽开始有萌发迹象；30d后，根茎芽开始迅速生长；45d后，叶柄逐渐伸长，叶片开始分化，在基部有新芽发生； 60d后，老芽叶柄继续伸长，叶片舒展，新芽亦开始迅速生长，无菌体系建成。在此培养基中每一代增殖系数约为1.75，3代后材料逐渐增多。
(4)基茎丛生芽发生增殖和“节繁殖”培养：在步骤(3)培养基中继代增殖3代后，将步骤(3)中培养的增殖苗剪切成2.0cm长、带2个叶片的小苗，“节繁殖”材料则单苗转入下列培养基B中：
MS基本培养液：
培养条件：在光照度1500-2000lx，光照时间10h/d，温度控制在23±2℃的条件下进行基茎丛生芽发生增殖和“节繁殖”培养；60d后增殖系数为9.53，在本步骤中可大量繁殖至生产所需的种苗基数。
(5)取步骤(4)基茎丛生芽中粗壮的主芽，剪去上部叶片，修剪至2.0cm 单芽接种于下列培养基C中
1/2MS基本培养液
培养条件：在光照度1500-2000lx，光照时间10h/d，温度控制在23±2℃的条件下培养60d后即可获得苗壮根粗的生根苗。
(6)炼苗和移栽：步骤(5)中生根苗高至6cm时，将培养瓶于自然光条件下放置5d后，再将培养瓶封口膜取下放置2d，取出生根苗，小心洗净残余培养基，用0.1％多菌灵(质量比)泡洗5min，移栽至经高温灭菌后的腐殖质土中保温保湿培养60d(温度20-25℃湿度70％左右)，后，即得移栽苗，成活率可达100％。
实施例2
一种阳春砂利用基茎丛生芽和“节繁殖”培养的高效人工育苗方法，包括以下步骤：
(1)外植体的获取：选择生长势好、无病虫害的健壮植株，取其地下根茎芽。
(2)将步骤(1)的根茎芽先用自来水清洗洗去表面泥土后用质量百分比 10％洗衣粉溶液浸泡10min并轻微震荡搅动后流水冲洗30min，置于超净工作台上用体积百分比75％乙醇溶液处理15s，再用质量百分比0.1％升汞水溶液灭菌10min，最后无菌水冲洗3次，每次不低于3min，在整个消毒过程中充分摇动器皿。
(3)启动培养及初步增殖：将经过步骤(2)消毒灭菌好的根茎芽为材料，按1.2×1.2cm大小切取，接入下列培养基A中：
MS基本培养液：
培养条件：在光照度1500-2000lx，光照时间10h/d，温度控制在23±2℃的条件下进行启动培养及初步增殖，15d后根茎芽开始有萌发迹象；30d后，根茎芽开始迅速生长；45d后，叶柄逐渐伸长，叶片开始分化，在基部有新芽发生； 60d后，老芽叶柄继续伸长，叶片舒展，新芽亦开始迅速生长，无菌体系建成。在此培养基中每一代增殖系数约为1.70，4代后材料逐渐增多。
(4)基茎丛生芽发生增殖和“节繁殖”培养：在步骤(3)培养基中继代增殖4代后，将步骤(3)中培养的增殖苗剪切成3.0cm长、带芽根茎(含3个芽点)，“节繁殖”材料则单苗转入下列培养基B中：
MS基本培养液：
培养条件：在光照度1500-2000lx，光照时间10h/d，温度控制在23±2℃的条件下进行基茎丛生芽发生增殖和“节繁殖”培养；60d后增殖系数为9.58，在本步骤中可大量繁殖至生产所需的种苗基数。
(5)取步骤(4)基茎丛生芽中粗壮的主芽，剪去上部叶片，直接以“节繁殖”材料接种于下列培养基C中
1/2MS基本培养液
培养条件：在光照度1500-2000lx，光照时间10h/d，温度控制在23±2℃的条件下培养60d后即可获得苗壮根粗的生根苗。
(6)炼苗和移栽：步骤(5)中生根苗高至7cm时，将培养瓶于自然光条件下放置3d后，再将培养瓶封口膜取下放置3d，取出生根苗，小心洗净残余培养基，用0.2％多菌灵(质量比)泡洗3min，移栽至经高温灭菌后的腐殖质土中保温保湿培养60d(温度20-25℃湿度70％左右)，后，即得移栽苗，成活率可达100％。
本发明的技术原理：
1、本发明用组织培养技术在培养室内可实现周年生产，既节约了土地资源，又提高了经济效益，克服了传统繁殖方式无法周年进行生产的难点。
2、本发明实现了高效快繁的目的，60d为一个增殖培养周期，繁殖系数可达9.5以上。
3、本发明基茎丛生芽基部在培养早期会出现白色膨大，随着培养时间的延长，白色膨大缩小甚至消失，基茎丛生芽节间伸长，节上长出不定根而无侧芽发生，按1-2节剪切下就可成为一个完整的新材料，这种现象本研究称之为“节繁殖”。“节繁殖”现象的出现，加上基茎丛生芽，使阳春砂瓶苗增殖系数大大增加，远远超过姜科植物已有的报道，既可在满足大规模生产需要的同时，又保持了母本的优良性状，为其人工快繁最有效的增殖方式，且提高了种苗质量；。
4、本发明解决了传统种子繁殖后代分离大、性状不稳定而导致的种苗品质不一的难题，通过本发明，可使所有种苗保持同一基因型背景，易于标准化、工厂化操作，有效地提高了种苗质量，可为大面积推广种植提供统一标准的优良种苗。
5、本发明除启动初代增殖培养后，在同一培养基中可同时进行基丛生芽诱导发生和增殖、“节繁殖”增殖，简化了培养程序；在无菌体系，即启动初代培养后，整个快速繁殖过程只需2种培养基就解决了从基茎丛芽诱导发生和增殖、“节繁殖”现象以及生根问题，利于安排生产计划。
6、本发明提供的阳春砂高效人工繁殖方法成本低、时间短、质量和成活率高，且能将优良性状固定下来；通过该方法可用来扩大阳春砂优质种种苗的繁殖量，从而进行高品质种苗的工厂化生产，以满足种植需求。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种阳春砂利用基茎丛生芽和“节繁殖”培养的高效人工育苗方法，其特征在于，包括的步骤有：将消毒灭菌处理后的带芽根茎外植体接种于培养基中，进行基丛生芽诱导发生、增殖及“节繁殖”增殖、生根诱导、炼苗移栽。
2.根据权利要求1所述的阳春砂利用基茎丛生芽和“节繁殖”培养的高效人工育苗方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)外植体的获取：选择生长势好、无病虫害的健壮植株，取其地下根茎芽；
(2)将步骤(1)的根茎芽进行消毒处理；
(3)启动培养：将经过步骤(2)消毒灭菌好的根茎芽为材料，接入下列培养基A中，所述培养基A，包括以下原料：
MS基本培养液
6-苄胺基嘌呤
蔗糖
琼脂粉
控制光照度、温度、光照时间的条件下进行根茎芽的启动培养；
(4)基茎丛生芽发生增殖和“节繁殖”培养：在步骤(3)培养基中继代增殖3-5代后，将步骤(3)中培养的增殖苗转入下列培养基B中，所述培养基B，包括以下原料：
MS基本培养液
6-苄胺基嘌呤
激动素
2，4-二氯苯氧乙酸
α-萘乙酸
蔗糖
琼脂粉
控制光照度、温度、光照时间的条件下进行培养；
(5)重复步骤(4)，基茎处有大量粗壮丛苗，加上“节繁殖”现象的出现，使阳春砂增殖系数大大增加；
(6)取步骤(5)丛芽中的健壮主苗或“节繁殖”中已生根的枝条接种于下列培养基C中，所述培养基C，包括以下原料：
1/2MS基本培养液
α-萘乙酸
蔗糖
琼脂粉
控制光照度、温度、光照时间的条件下进行培养，即可获得苗壮根粗的生根苗；
(7)炼苗和移栽：取步骤(6)中的生根植株置于室温下炼苗，从培养基中取出幼苗，将残留培养基清洗干净，放入多菌灵溶液中消毒，后移栽至经消毒的腐殖质土中保温保湿培养，即得移栽苗。
3.根据权利要求2所述的阳春砂利用基茎丛生芽和“节繁殖”培养的高效人工育苗方法，其特征在于，步骤(2)中所述根茎芽进行消毒处理的方法为：用自来水清洗洗去表面泥土后用质量百分比10％洗衣粉溶液浸泡10min并轻微震荡搅动后流水冲洗30min，置于超净工作台上用体积百分比75％乙醇溶液处理15s，再用质量百分比0.1％升汞水溶液灭菌10min，最后无菌水冲洗3次，每次不低于3min，在整个消毒过程中充分摇动器皿。
4.根据权利要求2所述的阳春砂利用基茎丛生芽和“节繁殖”培养的高效人工育苗方法，其特征在于，步骤(3)中所述培养基A，包括以下原料：
MS基本培养液：
6-苄胺基嘌呤 2.0-3.0mg/L
蔗糖 30000mg/L
琼脂粉 4700mg/L。
5.根据权利要求4所述的阳春砂利用基茎丛生芽和“节繁殖”培养的高效人工育苗方法，其特征在于，所述培养基A的pH值为5.4-5.8。
6.根据权利要求2所述的阳春砂利用基茎丛生芽和“节繁殖”培养的高效人工育苗方法，其特征在于，步骤(4)中所述培养基B，包括以下原料：
MS基本培养液：
7.根据权利要求6所述的阳春砂利用基茎丛生芽和“节繁殖”培养的高效人工育苗方法，其特征在于，所述培养基B的pH值为5.4-5.8。
8.根据权利要求2所述的阳春砂利用基茎丛生芽和“节繁殖”培养的高效人工育苗方法，其特征在于，步骤(6)中所述培养基C，包括以下原料：
1/2MS基本培养液
α-萘乙酸 2.0-3.0mg/L
蔗糖 15000mg/L
琼脂粉 4700mg/L
9.根据权利要求8所述的阳春砂利用基茎丛生芽和“节繁殖”培养的高效人工育苗方法，其特征在于，所述培养基C的pH值为5.4-5.8。
10.根据权利要求2所述的阳春砂利用基茎丛生芽和“节繁殖”培养的高效人工育苗方法，其特征在于，所述多菌灵溶液的质量浓度为0.1-0.2％。
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| CN106900555A (zh) * | 2017-03-21 | 2017-06-30 | 钦州市林业科学研究所 | 阳春砂试管分株培养基及一次成苗组培分株快繁方法 |
| CN107711498A (zh) * | 2017-10-16 | 2018-02-23 | 广东食品药品职业学院 | 一种春砂仁种苗的快速繁殖方法 |
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| CN110178657A (zh) * | 2019-06-21 | 2019-08-30 | 云南中医药大学 | 一种阳春砂仁的生态种植方法 |
| US10406188B1 (en) * | 2015-01-05 | 2019-09-10 | Luterion Co., Ltd. | Method for inhibiting telomerase in cancer cell using luterion |
| CN112005885A (zh) * | 2020-09-21 | 2020-12-01 | 广东农垦热带作物科学研究所 | 一种砂仁高效再生体系建立的方法 |
-
2021
- 2021-07-15 CN CN202110802768.0A patent/CN113317205B/zh active Active
Patent Citations (6)
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115530075A (zh) * | 2022-10-24 | 2022-12-30 | 吉首大学 | 一种报春石斛人工高效繁殖方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113317205B (zh) | 2022-10-18 |
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