CN116019013B - 一种三角梅快速繁育的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于三角梅繁育的技术领域领域，公开了一种三角梅快速繁育的方法。在三角梅快速繁育的方法中，依次进行外植体的消毒处理、初代诱导培养、继代增殖培养、生根培养以及移栽，繁育得到‘中闽3号’三角梅组培苗；其中，初代诱导培养过程中采用包含有200～205mg/L的磷酸二氢钾、0.2～0.4mg/L的6‑苄氨基嘌呤以及0.08～0.12mg/L的萘乙酸的诱导培养基，于培养温度为21～25℃、光照强度为2400～2500lx以及光照时间为8～12h/d的条件下对无菌外植体进行培养。本发明提供的三角梅快速繁育的方法中外植体分化出不定芽的成功率高，实现了‘中闽3号’三角梅快速、高效的繁育。
Description
技术领域
本发明属于三角梅繁育的技术领域，尤其涉及一种三角梅快速繁育的方法。
背景技术
‘中闽3号’三角梅，是‘新加坡宫粉’三角梅与‘胭脂红’三角梅人工杂交后代的实生变异株。‘中闽3号’三角梅的叶片与花苞片表面布满细小凹凸，边缘呈波浪状并带有磨砂质感，花苞片为浅紫色，叶片为椭圆形，呈深绿色，观赏性高，可应用于家庭盆栽、园林美化和造景。
但是，采用常规的方式进行‘中闽3号’三角梅的繁育所需要的时间长，繁育效率低。
发明内容
本发明提供了一种针对新品种‘中闽3号’三角梅的快速繁育方法，在该方法中，利用植物组织培养的方法对‘中闽3号’三角梅的茎段和/或茎尖进行培养，整个繁育的周期仅为148～180d，且最终得到了高度为5-8cm的健康“中闽3号”三角梅组培苗占比高，实现了‘中闽3号’三角梅快速、高效的繁育。
虽然本领域技术人员知晓，采用植物组织培养的方法相较于其他繁育方法所需要的时间较短，但是组培过程中，外植体分化得到不定芽的成功率低、繁育效率差，使得本领域技术人员无法将植物组织培养的方法很好地应用于‘中闽3号’三角梅的繁育中。
在面对影响庞杂的影响因素的情况下，本发明的发明人创造性地将诱导培养基中磷酸二氢钾的浓度从常规的170mg/L调整至200～205mg/L，并加入0.2～0.4mg/L的6-苄氨基嘌呤和0.08～0.12mg/L的萘乙酸，并且基于上述配方，创造性地调整初代诱导培养的条件，使得诱导培养基和诱导培养条件构成一个有机的整体，共同发挥做作用，使得初代诱导培养中不定芽分化成功率在93％，以使得后续的繁育过程能够顺利进行，最终得以实现缩短‘中闽3号’三角梅的培养周期以及提高繁育效率的效果。
值得注意的是，在初代诱导培养的过程中，若不采用本发明中提供的诱导培养基对外植体进行培养，将使得外植体分化出不定芽的成功率极低甚至是无法分化出不定芽。
具体地，本发明提供的一种三角梅快速繁育的方法采用以下的技术方案：
一种三角梅快速繁育的方法，包括以下步骤：
S1、外植体的消毒处理：选择‘中闽3号’三角梅茎段和/或茎尖作为所述外植体，并对所述外植体进行消毒处理得到无菌外植体；
S2、初代诱导培养：将经过所述S1处理的无菌外植体接种于诱导培养基中，于培养温度为21～25℃、光照强度为2400～2500lx以及光照时间为8～12h/d的条件下，培养35～45d外植体分化出不定芽；
S3、继代增殖培养：将分化出所述不定芽的外植体接种于增殖培养基中，培养30～35d得到增殖芽苗；
S4、生根培养：将所述增殖芽苗接种于生根培养基中，培养40～45d得到‘中闽3号’三角梅组培植株；
S5、移栽：对所述‘中闽3号’三角梅组培植株进行强光闭瓶炼苗5～10d，经消毒后栽植于栽培基质中，培育35～45d后，得到‘中闽3号’三角梅组培苗；
其中，所述诱导培养基包括改良MS培养基和0～0.5mg/L的6-苄氨基嘌呤以及0.08～0.12mg/L的萘乙酸，所述改良MS培养基中磷酸二氢钾的浓度为200～205mg/L。
初代诱导培养中外植体分化出不定芽的成功率受消毒处理影响较大，其中，所使用到的氯化汞溶液的浓度过低会使得消毒不彻底，受污染的外植体数量多，进而影响最终的不定芽萌动率，若浓度过高或浸泡时间过长的话，外植体会出现褐化死亡的情况。
在一些具体的实施例中，所述消毒处理为：依次使用洗衣粉溶液、消毒粉溶液、75％酒精以及氯化汞溶液对所述外植体进行浸泡，且每次浸泡后均使用无菌水对所述外植体进行清洗。
进一步地，所述消毒处理中，使用质量浓度为0.1～0.15wt％的氯化汞溶液浸泡外植体6～10min。
另外，消毒处理具体为：外植体使用浓度为10～15g/L的洗衣粉溶液浸泡5min后用无菌水冲洗干净；再使用8～10g/L的消毒粉溶液浸泡1min，用无菌水冲洗干净；接着在超净工作台上用75％的酒精浸泡外植体30s后用无菌水冲洗3遍；用0.1wt％的氯化汞溶液对外植体进行消毒浸泡10min，最后用无菌水冲洗5遍，得到无菌外植体。
进一步地，所述诱导培养基包括：
通过调控初代诱导培养中无菌外植体的接种密度，使得无菌外植体对于诱导培养基具有良好的吸收效果，进而可进一步提高外植体分化出不定芽的成功率。
在初代诱导培养中，首先于遮光的条件下对外置体进行培养一段时间10～15d后，再于温度为23±2℃、光照强度为2500lx以及光照时间为12h/d的条件下，可进一步提高外植体不定芽的萌动率。
在一些具体的实施例中，所述初代诱导培养中，所述无菌外植体的接种密度为1～2个/1个诱导培养基。
发明人在大量的实践过程中，进一步优化继代组织培养的条件以及所使用的增殖培养基，可提高继代增殖培养中的增殖倍数，进而进一步提高‘中闽3号’三角梅繁育的成功率。
在一些具体的实施方式中，所述增殖培养基包括200～204mg/L的磷酸二氢钾、0.5～0.6mg/L的6-苄氨基嘌呤、0.25～0.3mg/L的激动素、0.18～0.2mg/L的萘乙酸、2～3wt％的蔗糖以及4～5g/L的琼脂。
具体地，继代增殖培养的条件为：培养温度为21～25℃、光照强度为2400～2500lx以及光照时间为8～12h/d。
再进一步地，再进行生根培养前，多次进行继代增殖培养，使用第2代、第3代或是第4代的增殖芽苗进行生根培养，指的注意的是，当生根培养中用到的增殖芽苗是经过两次继代增殖培养得到的第3代增殖芽苗时，生根培养过程中生根高。
若生根培养过程中生根率低或生根条数低，会使得‘中闽3号’三角梅组培植株的根系不够健壮，进而导致移栽中‘中闽3号’三角梅组培植株的成活率低或成活植株长势弱，因此发明人对于生根培养条件和生根培养基进行了进一步地优化。
在一些具体的实施例中，所述生根培养基包括200～204mg/L的磷酸二氢钾、1.4～1.5mg/L的3-吲哚丁酸、0.08～0.10mg/L的萘乙酸、0.3～0.4g/L的活性炭以及2～2.5wt％的蔗糖。
具体地，所述生根培养的条件：培养温度为23～27℃、光照强度为2500～2600lx以及光照时间为8～10h/d。
在一些具体的实施例中，所述强光闭瓶炼苗中，所述‘中闽3号’三角梅组培植株在遮阴度为50～70％的条件下进行强光闭瓶炼苗。
在一些具体的实施例中，所述栽培基质包括泥炭土和椰糠，所述泥炭土和椰糠的质量比为(3～4):1。
有益效果：
本发明中提供的三角梅快速繁育的方法中整个繁育的周期所需的十时间为148～180d，且最终得到了高度为5-8cm的健康“中闽3号”三角梅组培苗占比高，实现了‘中闽3号’三角梅快速、高效的繁育。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1.
本实施例中提供了一种三角梅的快速繁育的方法，是采用植物组织培养的方法对‘中闽3号’三角梅进行快速繁育，具体包括以下步骤：
S1、外植体的消毒处理：(1)选择“中闽3号”三角梅幼嫩茎段和茎尖作为外植体；将外植体用10g/L洗衣粉溶液浸泡5min后用无菌水冲洗干净，将外植体嫩梢部分的叶片留下三分之一，用软毛笔轻刷干净；
(2)使用10g/L的消毒粉溶液浸泡1min，用无菌水冲洗干净；
(3)在超净工作台上用75％的酒精浸泡外植体30s后用无菌水冲洗3遍；
(4)用0.1wt％的氯化汞溶液对外植体进行消毒浸泡10min，最后用无菌水冲洗5遍，得到无菌外植体。
S2、初代诱导培养：将无菌外植体切至长度为1～2cm，接种于诱导培养基中，每个诱导培养基接种1个；于温度为23±2℃下遮光培养14d后，于温度为23±2℃、光照强度为2500lx以及光照时间为12h/d的条件下，培养40d，无菌外植体分化出不定芽。
S3、继代增殖培养：将S2中获得的不定芽接种于增殖培养基中继续培养，每瓶接种5个；于温度为23±2℃、光照强度为2500lx以及光照时间为12h/d的条件下，培养30d，获得增殖芽苗。
S4、生根培养：将S3中增殖芽苗接种于生根培养基中，每瓶接种5个，于温度为25±2℃、光照强度为2500lx以及光照时间为10h/d的条件下，培养40d，获得‘中闽3号’三角梅组培植株。
S5、移栽：将‘中闽3号’三角梅组培植株移到在遮阴度为50％的条件下进行强光闭瓶炼苗10d。出瓶后清洗干净培养基，用800倍液的多菌灵对‘中闽3号’三角梅组培植株进行消毒，再蘸上1000倍液的ABT生根粉后栽植于泥炭土:椰糠＝4:1的栽培基质中，且在温度约为25±2℃、湿度约60％的大棚中培育45d后，获得可得到高度为5-8cm的健康‘中闽3号’三角梅组培苗。
其中，诱导培养基为改良MS培养基，且其中额外添加有6-苄氨基嘌呤以及萘乙酸；而增殖培养基为改良MS培养基，且其中额外添加有6-苄氨基嘌呤、萘乙酸以及激动素；生根培养基为1/2改良MS培养基，其中添加有3-吲哚丁酸、萘乙酸以及活性炭。诱导培养基、增殖培养基以及生根培养基具体成分如表1所示：
表1.三角梅快速繁育使用到的培养基组成
实施例2～7和对比例1～4.
实施例2～7按照实施例1提供的方法对‘中闽3号’三角梅进行快速繁育，不同之处在于，对外植体的消毒处理条件不同，具体如表2所示：
表2.外植体消毒处理的条件
在三角梅栽培的过程中，统计实施例1～7以及对比例1～4中，外植体在初代诱导培养过程中的状态，结果如表3所示。
表3.氯化汞溶液浓度以及不同的消毒时间对不定芽分化的影响
由表3可知，当使用氯化汞溶液处理外植体的时间过短时，外植体被污染而无法分化出不定芽，而当处理浸泡的时间过长，将导致外植体死亡，或者在成功分化出不定芽后褐化死亡，因此，当使用的氯化汞溶液的浓度为0.1～0.15wt％、浸泡时间为4～10min时，外植体在后续的初代诱导培养过程生长状态良好，且萌动率高；特别注意地是，当氯化汞浓度为0.1wt％、浸泡时间为10min时，或氯化汞浓度为0.15wt％、浸泡时间为8min时，消毒处理的效果较佳。
实施例8～10
实施例8～10按照实施例1提供的方法对‘中闽3号’三角梅进行快速繁育，不同之处在于，初代诱导培养中使用到的诱导培养基不同，并且统计实施例1和8～10中不定芽诱导成功率，具体如表4所示。
表4.诱导培养基中6-BA浓度对诱导成功率的影响
由表4可知，仅往诱导培养基中加入NAA，诱导外植体分化不定芽的效果不理想，其诱导成功率仅在26.67％，而发明人经过创造性的劳动发现，往诱导培养基中加入6-BA可显著提高不定芽诱导的成功率，当诱导培养基中6-BA的浓度为0.1～0.5mg/L时，不定芽诱导成功率从原来的26.67％增长到了63.33～93.33％，值得注意的是，当6-BA的浓度为0.3mg/L时，诱导外植体分化不定芽的效果最佳。
实施例11和12.
实施例11和12按照实施例1提供的方法对‘中闽3号’三角梅进行快速繁育，不同之处在于，继代增殖培养中使用到的增殖培养基不同，并且统计实施例1、11和12中增殖芽苗的增殖系数，具体如表5所示。
表5.增殖培养基中6-BA浓度对增殖芽苗的增殖系数的影响
由表5可知，当增殖培养基中6-BA浓度的浓度在0.4～0.6mg/L时，继代增殖培养的增殖系数在1.2～3之间，所得的增殖芽苗状态良好，有利于后续的生根培养。
发明人创造性的发现，在‘中闽3号’三角梅繁育的过程中，继代培养可以是实施例1中所示的单代培养，得到第1代增殖芽苗便进行后续的生根培养，或者是重复多次操作，获得第2、3、4代甚至更多代增殖芽苗用于后续的生根培养。其中，当使用第3代的增殖芽苗进行生根培养的生根率为90％，高于第1代增殖芽苗26％的生根率、第2代增殖芽苗50％的生根率以及第4代芽苗75％的生根率。
实施例13～17.
实施例13～17按照实施例1提供的方法对‘中闽3号’三角梅进行快速繁育，不同之处在于，移栽过程中炼苗时间和栽培基质不同；并且统计实施例1和13～17移栽成活率和新叶率，具体如表6所示。
表6.炼苗时间、栽培基质对移栽成活率的影响
由表6可知，移栽过程中先对‘中闽3号’三角梅组培植株进行强光闭瓶炼苗10d，且使用泥炭土和椰糠作为栽培基质，能够显著提高移栽成活率，同时也能够提高‘中闽3号’三角梅组培苗的新叶率，实现理想的移栽效果。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (7)
1.一种三角梅快速繁育的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、外植体的消毒处理：选择‘中闽3号’三角梅茎段和/或茎尖作为所述外植体，并对所述外植体进行消毒处理得到无菌外植体；
S2、初代诱导培养：将经过所述S1处理的无菌外植体接种于诱导培养基中，于培养温度为21～25℃、光照强度为2400～2500lx以及光照时间为8～12h/d的条件下，培养35～45d外植体分化出不定芽；
S3、继代增殖培养：将分化出所述不定芽的外植体接种于增殖培养基中，培养30～35d得到增殖芽苗；
S4、生根培养：将所述增殖芽苗接种于生根培养基中，培养40～45d得到‘中闽3号’三角梅组培植株；
S5、移栽：对所述‘中闽3号’三角梅组培植株进行强光闭瓶炼苗5～10d，经消毒后栽植于栽培基质中，培育35～45d后，得到‘中闽3号’三角梅组培苗；
其中，所述诱导培养基由以下浓度的原料组成：1900mg/L的硝酸钾，1650mg/L的硝酸铵、204mg/L的磷酸二氢钾、370mg/L的硫酸镁、440mg/L的氯化钙、0.83mg/L的碘化钾、6.2mg/L的硼酸、22.3mg/L的硫酸锰、8.6mg/L的硫酸锌、0.1-0.5mg/L的6-BA、0.20mg/L的NAA、0.25mg/L的钼酸钠、0.025mg/L的硫酸铜、0.025mg/L的氯化钴、37.25mg/L的乙二胺四乙酸二钠、27.85mg/L的硫酸亚铁、100mg/L的肌醇、2mg/L的甘氨酸、0.10mg/L的盐酸硫胺素、0.5mg/L的盐酸吡哆醇、0.5mg/L的烟酸、30000mg/L的蔗糖和6000mg/L的琼脂；
所述增殖培养基由以下浓度的原料组成：1900mg/L的硝酸钾、1650mg/L的硝酸铵、204mg/L的磷酸二氢钾、370mg/L的硫酸镁、440mg/L的氯化钙、0.83mg/L的碘化钾、6.2mg/L的硼酸、22.3mg/L的硫酸锰、8.6mg/L的硫酸锌、0.4-0.6mg/L的6-BA、0.2mg/L的NAA、0.3mg/L的KT、0.25mg/L的钼酸钠、0.025mg/L的硫酸铜、0.025mg/L的氯化钴、37.25mg/L的乙二胺四乙酸二钠、27.85mg/L的硫酸亚铁、100mg/L的肌醇、2mg/L的甘氨酸、0.10mg/L的盐酸硫胺素、0.5mg/L的盐酸吡哆醇、0.5mg/L的烟酸、3wt％的蔗糖和5000mg/L的琼脂；
所述生根培养基由以下浓度的原料组成：1900mg/L的硝酸钾、1650mg/L的硝酸铵、204mg/L的磷酸二氢钾、370mg/L的硫酸镁、440mg/L的氯化钙、0.415mg/L的碘化钾、3.1mg/L的硼酸、11.15mg/L的硫酸锰、4.3mg/L的硫酸锌、1.5mg/L的IBA、0.1mg/L的NAA、400mg/L的活性炭、0.125mg/L的钼酸钠、0.0125mg/L的硫酸铜、0.0125mg/L的氯化钴、18.625mg/L的乙二胺四乙酸二钠、13.925mg/L的硫酸亚铁、50mg/L的肌醇、1mg/L的甘氨酸、0.0.5mg/L的盐酸硫胺素、0.25mg/L的盐酸吡哆醇、0.5mg/L的烟酸、2.5wt％的蔗糖和6000mg/L的琼脂。
2.根据权利要求1所述的三角梅快速繁育的方法，其特征在于：所述消毒处理为：依次使用洗衣粉溶液、消毒粉溶液、75％酒精以及氯化汞溶液对所述外植体进行浸泡，且每次浸泡后均使用无菌水对所述外植体进行清洗。
3.根据权利要求2所述的三角梅快速繁育的方法，其特征在于：所述消毒处理中，使用质量浓度为0.1～0.15wt％的氯化汞溶液浸泡外植体6～10min。
4.根据权利要求1所述的三角梅快速繁育的方法，其特征在于：所述初代诱导培养中，所述无菌外植体的接种密度为1～2个/1个诱导培养基。
5.根据权利要求1所述的三角梅快速繁育的方法，其特征在于：所述初代诱导培养中，将经过所述S1处理的无菌外植体接种于诱导培养基中后，于21～25℃下暗培养10～15d后，再于培养温度为21～25℃、光照强度为2400～2500lx以及光照时间为8～12h/d的条件下，培养35～45d分化得到不定芽。
6.根据权利要求1所述的三角梅快速繁育的方法，其特征在于：所述强光闭瓶炼苗中，所述‘中闽3号’三角梅组培植株在遮阴度为50～70％的条件下进行强光闭瓶炼苗。
7.根据权利要求1所述的三角梅快速繁育的方法，其特征在于：所述栽培基质包括泥炭土和椰糠，所述泥炭土和椰糠的质量比为(3～4):1。
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