CN104004784A

CN104004784A - 一种利用谷子成熟种子进行快速遗传转化的方法

Info

Publication number: CN104004784A
Application number: CN201410219660.9A
Authority: CN
Inventors: 刘颖慧; 董志平; 袁进成; 马海莲; 宋晋辉; 李志勇; 宋小青; 王凌云
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-05-23
Filing date: 2014-05-23
Publication date: 2014-08-27

Abstract

本发明涉及一种利用谷子成熟种子进行快速遗传转化的农杆菌转化体系，是一种快速、非依赖组织培养的谷子遗传转化体系，转化效率为1.77%，植株再生时间为3个月。该体系从成熟种子的侵染到最后获得植株仅需45天，到收获种子仅为3个月，大大缩短了植物转化的时间。该体系减少了在组培期间胞质体的无性系变异，同时可以使许多重要农艺性状基因引入谷子中，促进谷子分子育种进度。

Description

一种利用谷子成熟种子进行快速遗传转化的方法

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，涉及谷子遗传转化方法，特别是利用谷子成熟种子进行的非依赖组织培养的、快速的农杆菌转化体系建立的方法。

背景技术

谷子是重要的粮食和饲料作物，尤其是在欠发达国家以及干旱和半干旱地区，谷子占有很重要的地位。农杆菌介导的植物转化技术日臻成熟和完善，已经广泛应用在水稻、玉米、小麦等主要农作物上，但谷子的遗传转化研究的还比较少，目前还没有建立一套成熟的转化体系。特别是谷子的愈伤组织培养较困难和繁琐，取材还受季节的限制等因素。

研究表明启动子会影响基因的表达和启动活性，另一个重要影响因素是筛选标记基因，培养基中的添加物也可以影响转化效率，不同的农杆菌菌株对转化效率也有影响，影响谷子转基因的制约因素是目前还没有找到一个可重复非常好、转化效率高的用于主栽品种的方法。目前谷子的转化还处于摸索和优化阶段中，还没有一个成熟稳定的转化体系，而且转化的品种主要用珍珠粟（pearl millet）和手指谷（finger millet），在主栽品种方面的研究还十分欠缺，更重要的是对谷子的转化还没有集中解决重要的农业问题。

基于以上原因，加上原来利用的诱导愈伤组织的繁琐，受季节等的限制，急需一种随时可做的快速遗传转化技术。

发明内容

本发明采用根癌农杆菌，菌株为EHA105，侵染质粒为pCAMBIA1301，侵染谷子成熟种子，建立一种快速、非依赖组织培养的谷子遗传转化体系。其转化方法包括如下步骤：

（1）成熟谷子种子用70%的乙醇表面灭菌1min后，转入15%次氯酸钠灭菌20min，然后无菌蒸馏水冲洗5次，置于灭菌的滤纸上在光照培养箱中（25°C）萌发24小时，萌动；

（2）将萌动24小时的种子外植体加入直径425-600 μm的玻璃珠预处理90秒，对谷子进行微损伤处理。每皿放入谷粒300粒左右，加入玻璃珠1.5g，轻轻摇动培养皿；

（3）预处理后的种子外植体浸入浓度为OD=0.5的新鲜农杆菌菌液中侵染，侵染温度为22°C ，100rpm轻轻摇动，侵染30分钟。侵染液为：MS液体培养基+100μM 乙酰丁香酮+100μML-谷氨酸；

（4）将侵染后的外植体与农杆菌进行共培养，共培养时间为3天。培养基为MS固体培养基+100μM 乙酰丁香酮+100μM的L-谷氨酰胺；

（5）共培养后的种子外植体转移到灭菌的细沙中培养10d，注意浇水保持湿润，培养条件22 °C。在培养的第6天用15 mg/l的潮霉素进行初步喷洒筛选1次，第9天用25 mg/l 的潮霉素继续筛选；

（6）筛选后健壮的植株种植花盆中，并继续用25 mg/l 的潮霉素筛选，直到长成较大植株；

（7）取1g转化植株的叶片进行DNA提取，PCR检测GUS基因的表达情况。最终若能扩增出大约500 bp的GUS基因片段，则为遗传转化的植株。

本发明的优点在于：快速，简单，不受季节限制。

本发明的有益效果主要体现在：快速、非依赖组织培养的谷子遗传转化体系。该体系从成熟种子的侵染到最后获得植株仅需45天，到收获种子仅为3个月，大大缩短了植物转化的时间，促进谷子分子育种进度。

附图说明：

图1：不同萌发时期的种子形态；（A：光镜下观察萌发1天的谷子形态，放大10×4倍；B：光镜下观察萌发2天的谷子形态，可见有根和芽的萌发，放大10×4倍；C：从左到右分别为萌发1-5天的谷子幼苗。）

图2：在25 mg/l潮霉素筛选下大多数植株死亡；（A：筛选前的植株；B：筛选后的植株，多数已经死亡。）

图3：PCR检测GUS基因的表达情况；

图4：共培养8天GUS基因的表达情况。

具体实施方式

下面通过实施例并结合附图对本发明作进一步描述，但以下描述对本发明的保护范围不构成任何意义上的限定，仅仅做示例说明。

实施例1：外植体的选择

选用不同发芽时期的种子进行侵染，结果表明，侵染前的微损伤处理会对伸长的幼芽和幼根有一定的伤害，共培养的摇动处理也会使幼芽和幼根脱落，而且这种损伤随着发芽天数的增加会更严重，因此我们选择发芽1天的种子作为侵染的外植体。

实施例2：农杆菌菌株及培养

农杆菌菌株EHA105和质粒pCAMBIA1301用于转化实验。利用热击法将质粒转入农杆菌EHA105中，接种于YEP固体培养基中暗培养16-18小时，挑取单克隆接种于5mL加有卡那霉素的液体培养基中，28℃恒温振荡培养12-16 小时，使菌液达到饱和状态，之后将培养好的菌液以1∶100转移至新鲜的YEP液体培养基中活化使OD₆₀₀ 值达到0.4-0.8 之间，用于侵染。

实施例3：植株的转化、筛选和检测

选用不同浓度梯度的潮霉素进行筛选，结果表明大多数的谷子不能在25 mg/l 的潮霉素下存活，尤其是移栽到花盆后，许多幼苗死亡掉。选存活的幼苗移栽到田地中种植，最终获得存活植株，为研究基因的整合情况，提取基因组DNA，对转基因植株进行PCR检测。

实施例4：GUS活性检测

选取侵染5-10天的谷子幼苗检测GUS基因的表达，可以看到在侵染5天后的幼苗中就可以检测到GUS基因的表达，GUS的蓝色斑点主要显示在生长点和分生组织部位，尤其在胚轴、茎尖和根尖比较明显。

实施例5：谷子的转化效率

通过2种方式来评价谷子的转化效率，分别为潮霉素抗性植株数和PCR阳性植株数（表1）。将潮霉素抗性植株移栽到地中种植，通过PCR检测来确定转化效率，本实验获得PCR阳性植株53棵，PCR阳性率为1.77%。从整个实验来说潮霉素抗性植株数要多于PCR阳性植株数量，主要原因有两点，首先有的潮霉素抗性植株移栽到地中没有正常的存活，所以没有能够进行PCR检测；其次，PCR检测中有植株由于DNA提取质量和数量的影响，有的GUS条带很微弱，所以可能是由于DNA的质量影响GUS阳性的检出。

表1 谷子转化效率的统计

结论：本发明所涉及的一种利用谷子成熟种子进行快速遗传转化的方法，通过具体的实施步骤进行了描述。本领域技术人员可以借鉴本发明的内容适当改变内容、方法、环境等环节来实现相应的其它目的，其相关改变都没有脱离本发明的内容，所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，都被视为包括在本发明的范围之内。

Claims

1.利用谷子成熟种子进行快速遗传转化的方法，包括如下步骤：（1）成熟谷子种子用70%的乙醇表面灭菌1min后，转入15%次氯酸钠灭菌20min，然后无菌蒸馏水冲洗5次，置于灭菌的滤纸上在光照培养箱中（25°C）萌发24小时；（2）将萌动的种子外植体进行微损伤处理90秒；每皿放入谷粒300粒左右，加入玻璃珠1.5g，轻轻摇动培养皿；（3）预处理后的种子外植体浸入浓度为OD=0.5的新鲜农杆菌菌液中侵染，侵染温度为22°C ，100rpm轻轻摇动，侵染30分钟；侵染液为：MS液体培养基+100μM 乙酰丁香酮+100μML-谷氨酸；（4）将侵染后的外植体与农杆菌进行共培养，共培养时间为3天；培养基为MS固体培养基+100μM 乙酰丁香酮+100μM的L-谷氨酰胺；（5）共培养后的种子外植体转移到灭菌的细沙中培养10d，注意浇水保持湿润，培养条件22 °C；在培养的第6天用15 mg/l的潮霉素进行初步喷洒筛选1次，第9天用25 mg/l 的潮霉素继续筛选；（6）筛选后健壮的植株种植花盆中，并继续用25 mg/l 的潮霉素筛选，直到长成较大植株；（7）转化检测：取1g转化植株的叶片进行DNA提取，PCR检测GUS基因的表达情况，最终若能扩增出大约500 bp的GUS基因片段，则为遗传转化的植株。