CN105316359A

CN105316359A - 一种等离子体处理与转基因结合的玉米育种方法

Info

Publication number: CN105316359A
Application number: CN201510881192.6A
Authority: CN
Inventors: 智建奇; 武海丽
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-12-03
Filing date: 2015-12-03
Publication date: 2016-02-10

Abstract

本发明公开了一种等离子体处理与转基因结合的玉米育种方法，步骤如下：(1)将玉米种子进行冷等离子体处理；(2)培养玉米种子得无菌苗；(3)利用农杆菌将目的基因导入无菌苗；(4)培养无菌苗，收获目标玉米种。本发明的等离子体处理与转基因结合的玉米育种方法，将等离子体处理技术与转基因技术相结合，综合了两种技术的优势，可以培育出性能更加优异的玉米新品种。本发明具有以下优点：(1)利用冷等离子技术处理种子能够激发种子活力，实现促长、抗逆效果，育成的玉米种子发芽势、发芽率增加，抗逆性增强。(2)将外源目的基因转入玉米中，可成功表达，从而使得玉米具备耐旱、抗倒伏等优异特性，对玉米的产量性状也有相应的增加。

Description

一种等离子体处理与转基因结合的玉米育种方法

技术领域

本发明涉及一种等离子体处理与转基因结合的玉米育种方法，属于农业育种技术领域。

背景技术

玉米(ZeamaysL.)是世界上重要的粮食、饲料作物，也是现代工业的重要原料。随着工农业的发展及世界人口的增长，对玉米的需求量逐年攀升。据相关研究推测，到2020年世界玉米需求量将达到7.53亿吨,届时中国玉米需求量为2.14亿吨，将使玉米生产面临巨大挑战。

但传统的育种方法面临着推广品种单一化，育种材料遗传基础越来越狭窄，基因库日益贫乏等问题，加之常规育种周期长，预见性差，很难使作物在产量、质量和抗性方面有大的提高。

传统玉米育种在过去的几十年确实有很大的成就，但由于育种时间过长、效率较低、品种单一化、育种材料遗传基础越来越狭窄、预见性差等局限性，导致低水平重复、同质化严重，很难使作物在产量、质量和抗性方面有大的提高。目前传统玉米育种遇到很大瓶颈，甚至停滞。

利用太空特殊的环境条件对植物种子产生的诱变来进行良种选育成为一种新兴的育种方法，然而太空育种是人工诱变育种的一种新方法，所有人工诱变的发生均是随机的，目前还做不到定向诱变，太空育种的成功率随着物种的不同也会有很大差别，并且太空育种的成本相当高，不是一般单位和个人能够承担的。

近年来，随着生物技术的迅速发展和不断完善，采用基因工程手段进行作物遗传育种和新种质的创造已成为可能，运用转基因技术提高作物产量的报道屡见不鲜。Dinkins等(2003)利用基因枪技术将15kDaδ-玉米醇溶蛋白基因转入大豆中，对转基因后代进行氨基酸组分分析，发现甲硫氨酸提高了12％～20％，半胱氨酸提高了15％～35％，而其他的氨基酸组分没有发生明显的变化。丁明忠等(2000)利用花粉管通道法和减压渗透法将大豆总DNA导入玉米，筛选到8个高蛋白材料，玉米种子中蛋白质含量比对照提高20％。Zheng等(1995)将菜豆种子蛋白质基因导入水稻中表达，使得转基因水稻种子总蛋白含量增加4％，赖氨酸含量也有所提高。Regierer等(2002)把修饰过的质体腺苷酸激酶基因导入马铃薯中，转基因马铃薯块茎中腺苷酸水平得到明显提高，淀粉含量增加了60％，块茎产量增加了39％。这些研究成果，为高产育种技术奠定了基础，也表明了随着转基因技术的兴起，优质、高产的良种选育技术将步入一条快速、崭新的道路。

农杆菌介导法具有能够转移相对较大DNA片段、更有效地产生单位点整合、不易引起分子间或分子内重排、转化效率高等优点，一直备受科研工作者的青睐。但是由于单子叶植物不是农杆菌的天然宿主，因此人们一直认为农杆菌介导的转化方法只适合于双子叶植物和大多裸子植物的转基因操作，以至于此方法在玉米的遗传转化上没有得到过应用。直到上世纪八十年代，经过国内外研究者的不懈努力，农杆菌介导法在玉米遗传转化上的应用才取得了一些重要进展。

目前并未见到将等离子体处理技术与转基因相结合的玉米育种方法的报道。

发明内容

针对上述现有技术，一种等离子体处理与转基因结合的玉米育种方法

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种等离子体处理与转基因结合的玉米育种方法，步骤如下：

(1)将玉米品种的种子进行冷等离子体处理：将玉米品种的父母本种子置于冷等离子体处理机内，在140W的处理功率下对玉米种子进行18秒的非电离幅射处理，处理以氦气为工作介质，在真空封闭环境中进行；

所述玉米品种选自鲁种99118号、DH4866、齐319等；

(2)上述处理后的玉米种子，用70％乙醇(体积浓度)浸泡30～45s，用无菌水洗1～2次，而后用0.1％的HgCl₂溶液(质量浓度)浸泡8～10min，再用无菌水冲洗4～5次，用滤纸吸干表面残留液体后，接种于不含抗生素的MS发芽培养基上，26±1℃暗培养1～2天，待种子萌动(露白)后，将其放在改良MS培养基上于黑暗条件下萌发；待胚芽伸长止3～4厘米时，剥离胚芽鞘及2～3片幼叶，露出茎尖顶端生长锥；

(3)利用基因重组技术，将目的基因导入空白基础载体构建重组载体；所得重组载体经三亲杂交法将目的基因转移至农杆菌，挑取单菌落，进行PCR鉴定得到目标农杆菌；

所述目的基因可以是ZmPIN1a基因、ZmPIN1b基因或精氨酸酶基因ZmArg；

(4)目标农杆菌的活化与重悬：用无菌牙签从平板上挑取目标农杆菌单菌落接种至20ml附加抗生素(50mg/L的利福平)的pH为7.0的LB液体培养基上，28℃，180r/min培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8；取菌液加至相同培养基上，28℃，180r/min继续培养5～6小时，培养至菌液浓度OD₆₀₀＝0.5～0.6；5000r/min,4℃离心5min，收集菌体，去上清，用液体MS培养基重悬菌体，而后5000r/min,4℃离心5min，收集菌体，再次用液体MS培养基重悬菌体，而后5000r/min,4℃离心5min，收集菌体，用MS培养基重悬菌体后，即可以用于转化，备用；

(5)将活化了的农杆菌菌液倒在4.5厘米直径的培养皿中，倾斜培养皿，使露出茎尖生长锥的无菌苗浸泡在菌液中，在0.5×10⁵Pa大气压下处理10分钟；浸染后的芽尖用无菌滤纸吸干，萌发种子放在改良MS培养基上于黑暗中培养2～3天，培养温度为22～24℃；然后将无菌苗放在散射光下培养2天；将照光培养后的无菌苗移栽到装有灭菌蛭石的营养钵中，然后让植株在自然光照下生长，日温22～28℃，夜温15～21℃，隔天浇灌1/2改良MS培养基无机盐；

(6)在转化苗长到3～4叶期时，均匀喷洒合适浓度的草甘膦水溶液行筛选，存活植株长到5～6叶期时移栽到田间收获目标玉米种。

本发明的等离子体处理与转基因结合的玉米育种方法，将等离子体处理技术与转基因技术相结合，综合了两种技术的优势，可以培育出性能更加优异的玉米新品种。本发明具有以下优点：

(1)利用冷等离子技术处理种子能够激发种子活力，实现促长、抗逆效果，育成的玉米种子发芽势、发芽率增加，抗逆性增强，高产、稳产、广适、优质、适于密植和机械化作业。

(2)冷等离子体处理功率人为可控，通过反复试验可以找到某种玉米种子某一特定性状的处理功率，能更好地满足选育玉米优良品种的需求，克服了传统的育种手段时间长、目标盲目性、育种质量低、育种成本高的弊端，在玉米育种手段上具有创新性。

(3)将外源目的基因转入玉米中，可成功表达，从而使得玉米具备耐旱、抗倒伏等优异特性，对玉米的产量性状也有相应的增加。

(4)采用农杆菌介导，操作简单，整个工作周期短，可以在较短时间内获得转基因植株。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1等离子体处理与转基因结合进行玉米育种

步骤如下：

(1)将玉米品种(DH4866)的种子进行冷等离子体处理：将玉米品种的父母本种子置于冷等离子体处理机内，在140W的处理功率下对玉米种子进行18秒的非电离幅射处理，处理以氦气为工作介质，在真空封闭环境中进行；

(2)上述处理后的玉米种子，用70％乙醇(体积浓度)浸泡45s，用无菌水洗2次，而后用0.1％的HgCl₂溶液(质量浓度)浸泡10min，再用无菌水冲洗5次，用滤纸吸干表面残留液体后，接种于不含抗生素的MS发芽培养基上，26±1℃暗培养1～2天，待种子萌动(露白)后，将其放在改良MS培养基上于黑暗条件下萌发；待胚芽伸长止3～4厘米时，剥离胚芽鞘及2～3片幼叶，露出茎尖顶端生长锥；

所述目的基因可以是精氨酸酶基因ZmArg；

在玉米的生长时期，测定株高、穗位高、百粒重、亩产量等，并与未经等离子体技术处理和转基因处理的玉米种子进行比较，结果如下：

株高：未经等离子体技术处理和转基因处理的玉米，平均株高206.6厘米；经等离子体技术处理和转基因处理的玉米，平均株高132.5厘米，差异显著。

穗位高：未经等离子体技术处理和转基因处理的玉米，平均穗位高61.8厘米；经等离子体技术处理和转基因处理的玉米，平均穗位高43.2厘米，差异显著。

百粒重：未经等离子体技术处理和转基因处理的玉米，百粒重31.04g；经等离子体技术处理和转基因处理的玉米，百粒重35.85g，差异显著。

亩产量：未经等离子体技术处理和转基因处理的玉米，亩产量1386斤；经等离子体技术处理和转基因处理的玉米，亩产量1435斤，差异显著。

结论：经等离子体技术处理和转基因处理的玉米，在株高、穗位高、百粒重、亩产量等方面，均得到了明显的改善和提高。

Claims

1.一种等离子体处理与转基因结合的玉米育种方法，其特征在于：步骤如下：

(2)上述处理后的玉米种子，用70％乙醇浸泡30～45s，用无菌水洗1～2次，而后用0.1％的HgCl₂溶液浸泡8～10min，再用无菌水冲洗4～5次，用滤纸吸干表面残留液体后，接种于不含抗生素的MS发芽培养基上，26±1℃暗培养1～2天，待种子萌动后，将其放在改良MS培养基上于黑暗条件下萌发；待胚芽伸长止3～4厘米时，剥离胚芽鞘及2～3片幼叶，露出茎尖顶端生长锥；

(4)目标农杆菌的活化与重悬：用无菌牙签从平板上挑取目标农杆菌单菌落接种至20ml附加抗生素的pH为7.0的LB液体培养基上，28℃，180r/min培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8；取菌液加至相同培养基上，28℃，180r/min继续培养5～6小时，培养至菌液浓度OD₆₀₀＝0.5～0.6；5000r/min,4℃离心5min，收集菌体，去上清，用液体MS培养基重悬菌体，而后5000r/min,4℃离心5min，收集菌体，再次用液体MS培养基重悬菌体，而后5000r/min,4℃离心5min，收集菌体，用MS培养基重悬菌体后，即可以用于转化，备用；

2.根据权利要求1所述的等离子体处理与转基因结合的玉米育种方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述玉米品种选自鲁种99118号、DH4866、齐319。

3.根据权利要求1所述的等离子体处理与转基因结合的玉米育种方法，其特征在于：所述步骤(3)中，所述目的基因选自ZmPIN1a基因、ZmPIN1b基因或精氨酸酶基因ZmArg。