CN104152424B - ZmHINT基因在促进植物免疫反应中的应用 - Google Patents

ZmHINT基因在促进植物免疫反应中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种ZmHINT基因在促进植物免疫反应中的应用。如下任一物质在提高植物免疫能力和/或增强植物抗病性中的应用：(1)SEQ ID No.4所示的蛋白；(2)SEQ ID No.4所示蛋白的编码基因；(3)含有(2)所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。本发明证明ZmHINT基因在拟南芥中过表达能够增强拟南芥的抗病能力，说明ZmHINT基因在植物免疫反应过程中发挥了重要作用。

Description

ZmHINT基因在促进植物免疫反应中的应用
技术领域
本发明涉及一种ZmHINT基因在促进植物免疫反应中的应用，属于生物技术领域。
背景技术
组氨酸三聚体蛋白超家族是一个具有核苷酸转移酶和水解酶活性的家族，其中，组氨酸三聚体核苷结合蛋白(Histidine triad nucleotide binding protein，HINT)是组氨酸三聚体蛋白超家族成员中分布最为广泛的一种蛋白，该蛋白在低等植物和高等动物中均具有很高的结构和功能相似性。晶体结构研究结果表明，HINT是其他四种组氨酸三聚体蛋白超家族成员的祖先，结构和功能的保守性，预示了HINT发挥着重要的生物学功能。目前，有研究报道了关于哺乳动物HINT在细胞凋亡、肿瘤发生、发展中发挥了重要作用。相对动物HINT的研究，植物HINT的功能研究较少，尤其是对玉米HINT在植物免疫反应中的功能研究尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种ZmHINT基因在促进植物免疫反应中的应用。
本发明提供如下任一物质在提高植物免疫能力和/或增强植物抗病性中的应用：
(1)SEQ ID No.4所示的蛋白；
(2)SEQ ID No.4所示蛋白的编码基因；
(3)含有(2)所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
上述应用中，所述编码基因如SEQ ID No.3中自5’末端起第9位至第398位核苷酸所示。
上述任一所述的应用中，所述免疫为针对禾谷镰刀菌引起的疾病的免疫；
所述抗病为抗禾谷镰刀菌引起的疾病。
上述任一所述的应用中，所述植物为拟南芥；
所述禾谷镰刀菌为禾谷镰刀菌PH-1。
一种制备免疫能力提高和/或抗病性增强的植物的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤：将SEQ ID No.4所示蛋白的编码基因导入出发植物中，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物的免疫能力提高和/或抗病性增强。
上述方法中，所述编码基因是通过重组表达载体导入的，所述重组表达载体是将所述编码基因插入出发载体pCAMBIA-1304的多克隆位点得到的。
上述任一所述的方法中，所述编码基因如SEQ ID No.3中自5’末端起第9位至第398位核苷酸所示；
所述重组表达载体是将SEQ ID No.3所示的DNA分子插入出发载体pCAMBIA-1304的NcoI和SpeI酶切位点间得到的。
上述任一所述的方法中，所述免疫为针对禾谷镰刀菌引起的疾病的免疫；
所述抗病为抗禾谷镰刀菌引起的疾病。
上述任一所述的方法中，所述植物为拟南芥；
所述禾谷镰刀菌为禾谷镰刀菌PH-1。
本发明证明ZmHINT基因在拟南芥中过表达能够增强拟南芥的免疫能力，说明ZmHINT基因在增强植物抗病能力方面具有重要作用。
附图说明
图1为重组农杆菌和对照农杆菌的PCR鉴定。
图2为不同浓度的潮霉素对转ZmHINT基因T1代拟南芥的筛选。
图3为转ZmHINT基因的T2代拟南芥以及转空载体pCAMBIA-1304的T2代拟南芥的潮霉素抗性筛选。
图4为转ZmHINT基因的T2代拟南芥、转空载体pCAMBIA-1304的T2代拟南芥以及野生型拟南芥的PCR鉴定。
图5为人工接种禾谷镰刀菌菌株PH-1后拟南芥花序部位的表型分析。
图6为人工接种禾谷镰刀菌菌株PH-1后拟南芥叶片的表型分析。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
GC Buffer购自宝生物工程(大连)有限公司，产品目录号为9154。
B73玉米自交系(Zea mays ssp.mays L.)在文献“Patrick S.Schnable,etal.The B73 Maize Genome:Complexity,Diversity,and Dynamics.Science 326,1112-1115(2009)”中公开过，公众可从河南农业大学获得。
拟南芥(Arabidopsis thaliana)哥伦比亚型(Columbia-0)在文献“Xiao Luo,XiBai,Xiaoli Sun,Dan Zhu,Baohui Liu,Wei Ji,Hua Cai,Lei Cao,Jing Wu,Mengran Hu,Xin Liu,Lili Tang and Yanming Zhu.Expression of wild soybean WRKY20 inArabidopsis enhances drought tolerance and regulates ABA signaling.Journal ofExperimental Botany.2013.”中公开过，公众可从河南农业大学获得。
MS盐购自美国Sigma公司，货号为M5524-50L。
MS盐溶液：该溶液由溶剂和溶质组成；溶质为MS盐，蔗糖和Silwet L-77，溶剂为蒸馏水。MS盐在MS盐溶液中的浓度为2.15g/L，Silwet L-77在MS盐溶液中的浓度为200μl/L，蔗糖在MS盐溶液中的浓度为5％，“％”代表质量体积百分含量“g/100ml”，调pH＝5.8。
YEP液体培养基按照如下方法制备：
牛肉膏5.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，酵母提取物1.0 g/L，蔗糖5.0 g/L，MgSO4·7H2O0.5 g/L，余量为去离子水，调pH＝7.0后灭菌保存。
CMC产孢液体培养基的配制：羧甲基纤维素7.5 g/L，NH4NO30.5g/L，KH2PO30.5g/L，MgSO4.7H2O 0.25 g/L，酵母提取物0.5 g/L，余量为去离子水，调pH＝7.0后灭菌保存。
根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101在文献“Wei Tang,RonSederoff,Ross Whetten.Regeneration of transgenic loblolly pine(Pinus taedaL.)from zygotic embryos transformed with Agrobacterium tumefaciens.Planta(2001)213:981-989.”中公开过，公众可从河南农业大学获得。
禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)PH-1在文献“RUBELLA S.GOSWAMI ANDH.CORBY KISTLER.Heading for disaster:Fusarium graminearum on cerealcrops.Molecular Plant Pathology(2004)5(6):515–525.”中公开过，公众可从河南农业大学获得。
pMD 18-T Simple载体购自宝生物工程(大连)有限公司，产品目录号为6011。
载体pCAMBIA-1304在文献“Ruchi Pandey,Avinash Mishra,G.K.Garg.Plantpromoter driven heterologous expression of HMW glutenin gene(s)subunit inE.coli.Mol Biol Rep(2008)35:153–162.”中公开过，公众可从河南农业大学获得。
实施例1、ZmHINT基因过表达载体及重组农杆菌的构建
一、引物设计与合成
根据ZmHINT基因编码区全长cDNA序列，设计并合成如下引物:
F7：5'-ACCCATGGATGTCGTCGGAGAAGGAGGC-3'；(SEQ ID No.1)
R7：5'-CGGCACTAGTTTAGCCTGGGGGCCAGTTCA-3'。(SEQ ID No.2)
其中5'-CCATGG-3'为NcoI酶切位点，5'-ACTAGT-3'为SpeI酶切位点。
二、提取B73玉米自交系的RNA，并反转录为cDNA。以B73玉米自交系的cDNA为模板，以F7和R7为引物进行PCR扩增，得PCR扩增产物，如SEQ ID No.3所示。
PCR反应体系：
PCR反应条件：
三、将PCR扩增产物连接到pMD 18-T Simple载体得到重组质粒，将其命名为pMD-ZmHINT-2，将pMD-ZmHINT-2送测序，结果正确。
四、NcoI和SpeI双酶切pMD-ZmHINT-2，得到基因片段；NcoI和SpeI双酶切pCAMBIA-1304，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为pCAMBIA1304-ZmHINT-2，将pCAMBIA1304-ZmHINT-2质粒送测序，结果正确。
ZmHINT基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3中自5’末端起第9位至第398位核苷酸所示。
ZmHINT蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4示。
五、重组农杆菌的构建
将pCAMBIA1304-ZmHINT-2质粒转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101，得到重组农杆菌。同时将空载体pCAMBIA-1304转化根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101，得到对照农杆菌。
具体步骤如下：
(一)重组质粒pCAMBIA1304-ZmHINT-2和空载体pCAMBIA-1304转化根癌农杆菌
各取1μg构建好的pCAMBIA1304-ZmHINT-2重组质粒和pCAMBIA-1304空载体的质粒，采用先液氮冷冻，再热击的方法转入到根癌农杆菌GV3101中。然后将转化后的根癌农杆菌GV3101涂布于含抗生素100μg/ml Kan的YEP平板培养基上生长48小时。然后各挑选5个单克隆，接种于含相应抗生素的YEP(100μg/ml Kan，125μg/ml利福平)液体培养基中，28℃，200rpm/min振荡培养过夜，得到单克隆菌液，用做PCR鉴定。
(二)PCR鉴定
1、pCAMBIA1304-ZmHINT-2重组质粒转化根癌农杆菌GV3101后单克隆菌液PCR鉴定体系：
PCR反应条件：
2、pCAMBIA-1304质粒转化根癌农杆菌GV3101后单克隆菌液PCR鉴定体系：
PCR反应条件：
F6：5'-ATGTCGTCGGAGAAGGAGGC-3'；(SEQ ID No.5)
R6：5'-TTAGCCTGGGGGCCAGTTCA-3'；(SEQ ID No.6)
F8:5'-AACAGAACTCGCCGTAA-3'；(SEQ ID No.7)
R8:5'-GTCAAGAGTCCCCCGTGTT-3'。(SEQ ID No.8)
同时设置未转任何质粒的根癌农杆菌GV3101进行上述实验作为阴性对照。
3、将步骤1和步骤2的PCR扩增产物进行1.0％的琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。
图1A为重组农杆菌(转pCAMBIA1304-ZmHINT-2质粒的根癌农杆菌GV3101)的PCR鉴定，图1B为对照农杆菌(转pCAMBIA-1304质粒的根癌农杆菌GV3101)的PCR鉴定。
图1A中，M为DNA marker,1-3为三个重组农杆菌克隆。
图1B中，M为DNA marker,1-4为四个对照农杆菌克隆，5为未转任何质粒的根癌农杆菌GV3101。
图1A表明，重组农杆菌中含有目的基因(ZmHINT基因)，其长度约400bp，表明重组农杆菌构建成功。
图1B表明，对照农杆菌中含有空载体pCAMBIA-1304中长度为514bp的目的条带，该目的序列如SEQ ID No.9所示，表明对照农杆菌构建成功。
实施例2、转基因拟南芥的制备
一、待转化拟南芥的制备
(一)将拟南芥(Arabidopsis thaliana)哥伦比亚型(Columbia-O)(以下简称野生型拟南芥)的种子置于1.5ml离心管中，6.25％NaClO(6.25ml NaClO原液，0.01ml的TritonX-100，用ddH2O定容到100ml)消毒15分钟。
(二)ddH2O清洗种子6次，待种子沉下后，弃上层ddH2O。
(三)将种子播种于1/2MS培养基平板上，避光4℃春化72h。
(四)将平板置于光照培养箱中(21℃，每天光照16小时，黑暗8小时)，生长8-10天，得到萌发的拟南芥幼苗。
(五)将拟南芥幼苗移入营养土中(草炭土：蛭石＝1：1，体积比)，在温室(21℃，每天光照16小时，黑暗8小时)条件下生长，盛花期时进行遗传转化。
二、农杆菌转化拟南芥
(一)将步骤一得到的拟南芥在转化前一天浇足水。
(二)分别将实施例1制备的重组农杆菌和对照农杆菌接种于YEP液体培养液(Kan50μg/ml，利福平50μg/ml)中，28℃振荡培养过夜(同时接种几个不同的克隆)。
(三)将培养过夜的不同克隆的重组农杆菌菌液混合在一起，共500ml，记作重组菌混合液。同时将培养过夜的不同克隆的对照农杆菌菌液混合在一起，共500ml，记作对照菌混合液。分别取重组菌混合液或对照菌混合液5ml加入含有500ml YEP液体培养基(Kan 50μg/ml)的1L三角瓶中，28℃振荡培养6-12小时(OD600＝0.8-1.0)。
(四)4000rpm/min，室温离心10分钟，收集菌体。
(五)用200mlMS盐溶液悬浮菌体，分别得到重组农杆菌和对照农杆菌的悬液。
(六)将拟南芥花序分别浸泡在重组农杆菌和对照农杆菌的悬液里1分钟左右，用保鲜袋套上保湿一天。
(七)第二天将拟南芥从保鲜袋中取出来，黑暗放置一天后放回光照培养架上，培育植株(21℃，每天光照16小时，黑暗8小时)到结实，直到分别收获重组农杆菌转化拟南芥得到的转ZmHINT基因拟南芥和对照农杆菌转化拟南芥得到的转空载体pCAMBIA-1304拟南芥的T0代种子，收获时要分单株收获。
三、转基因拟南芥阳性植株的筛选
(一)将干燥2周后的转ZmHINT基因和转空载体pCAMBIA-1304拟南芥的T0代种子分别播种于含40mg/L、35mg/L、30mg/L、25mg/L、20mg/L、15mg/L潮霉素(Hygromycin)的MS培养基上。
(二)将种子4℃春化72h小时后置于21℃，每天光照16小时，黑暗8小时，光强150μM·m-2s-1，8-10天后观察转ZmHINT基因和转空载体pCAMBIA-1304的拟南芥T1代幼苗的子叶和根的发育状况。
(三)经初步筛选鉴定：阳性转ZmHINT基因或者转空载体pCAMBIA-1304的T1代拟南芥幼苗能够在含有30mg/L潮霉素的MS选择培养基上正常生长，而阴性未转ZmHINT基因或者未转化空载体pCAMBIA-1304的T1代拟南芥幼苗在含有30mg/L潮霉素的MS选择培养基上不能生长，变成为白化苗。
阳性转ZmHINT基因的T1代拟南芥幼苗的潮霉素抗性筛选结果如图2所示。
图2中，a：40mg/L Hygromycin MS培养基；b：35mg/L Hygromycin MS培养基；
c：30mg/L Hygromycin MS培养基；d：25mg/L Hygromycin MS培养基；
e：20mg/L Hygromycin MS培养基；f：15mg/L Hygromycin MS培养基。
图2表明，转ZmHINT基因的T1代拟南芥幼苗能够在含有30mg/L潮霉素的MS选择培养基上正常生长。
(四)8-10d后，分别将阳性转ZmHINT基因和转空载体pCAMBIA-1304的T1代拟南芥幼苗移栽到基质土中生长，当植株长至10叶时，取叶片提取基因组RNA并反转录成cDNA，得到转ZmHINT基因的T1代拟南芥的cDNA和转空载体pCAMBIA-1304的T1代拟南芥的cDNA。
以转ZmHINT基因的T1代拟南芥的cDNA为模板，以R6和F6为引物进行PCR鉴定，以转空载体pCAMBIA-1304的T1代拟南芥的cDNA为模板，以R8和F8为引物进行PCR鉴定，阳性判断标准如实施例1的步骤五。
将鉴定为阳性的转ZmHINT基因和转空载体pCAMBIA-1304的拟南芥T1代幼苗成熟后分单株收取T1代种子。由T1代的种子播种后，获得T2代幼苗，将其进行30mg/L的潮霉素抗性筛选，结果如图3所示。
图3A中，黑色箭头标注的为转ZmHINT基因的T2代拟南芥幼苗。
图3B中，黑色箭头标注的为转空载体pCAMBIA-1304的T2代拟南芥幼苗。
图3表明，转ZmHINT基因的T2代拟南芥幼苗和转空载体pCAMBIA-1304的T2代拟南芥幼苗能够在含有30mg/L潮霉素的MS选择培养基上正常生长。
把潮霉素抗性筛选的转ZmHINT基因的T2代拟南芥幼苗、转空载体pCAMBIA-1304的T2代拟南芥幼苗和野生型拟南芥幼苗移植至基质土中，当生长至10片叶时，单株提取叶片的基因组RNA并反转录成cDNA，得到转ZmHINT基因的T2代拟南芥的cDNA和转空载体pCAMBIA-1304的T2代拟南芥的cDNA和野生型拟南芥的cDNA。
分别以转ZmHINT基因的T2代拟南芥的cDNA和野生型拟南芥的cDNA为模板，以R6和F6为引物进行PCR鉴定，分别以转空载体pCAMBIA-1304的T2代拟南芥的cDNA和野生型拟南芥的cDNA为模板，以R8和F8为引物进行PCR鉴定，阳性判断标准如实施例1的步骤五，结果如图4所示。
图4A为转ZmHINT基因的T2代拟南芥和野生型拟南芥的PCR鉴定。
图4B为转空载体pCAMBIA-1304的T2代拟南芥和野生型拟南芥的PCR鉴定。
图4A中，M为DNA marker，1-4为转ZmHINT基因的T2代拟南芥，5为野生型拟南芥。
图4B中，M为DNA marker，1-4为转空载体pCAMBIA-1304的T2代拟南芥，5为野生型拟南芥。
图4A表明，转ZmHINT基因的T2代拟南芥检测到约400bp的目标条带，而野生型拟南芥没有扩增出目的条带。
图4B表明，转空载体pCAMBIA-1304的T2代拟南芥检测到514bp的目的条带，而野生型拟南芥没有扩增出目的条带。
图4表明，转ZmHINT基因的T2代拟南芥和转空载体pCAMBIA-1304的T2代拟南芥构建成功。
按照上述方法直到获得转ZmHINT基因的T3代拟南芥植株以及转空载体pCAMBIA-1304的T3代拟南芥植株。此外，每代PCR鉴定为阳性的植株成熟后分单株收获种子。
实施例3、转ZmHINT基因拟南芥、转空载体pCAMBIA-1304拟南芥及野生型拟南芥花序部位发病程度分析
将转ZmHINT基因的T3代拟南芥、转空载体pCAMBIA-1304的T3代拟南芥和野生型拟南芥的种子用体积百分含量6％的次氯酸钠溶液(6ml NaClO原液，0.01ml的Triton X-100，用ddH2O定容到100ml)消毒10min，再用无菌水清洗6次后均匀的播撒与1/2MS培养基中。4℃避光处理2天后，将播有拟南芥的培养基移至温室中(16h光照、8小时黑暗，21℃)。待拟南芥幼苗长到3至4片叶时将拟南芥移至培养土中继续生长。待到各拟南芥开花且有2到3个角果出现时即可进行禾谷镰刀菌接种。
将保存的禾谷镰刀菌PH-1的菌丝块接种到配置好的CMC产孢液体培养基中，25℃、180rpm震荡培养5天(Hou Z M et al.2002)。将培养产生的孢子用纱布过滤后，3000rpm离心5min收集分生孢子，用体积百分含量0.05％的Tween 20的无菌水溶液在血球计数板下将分生孢子的浓度调整为1×105个/ml，得到禾谷镰刀菌孢子悬浮液，用于接种实验。
选取开花初期且生长健壮、均匀的拟南芥植株，采用喷雾法喷洒禾谷镰刀菌孢子悬浮液进行接种。接种后用塑料薄膜覆盖保湿，25℃黑暗培养两天，然后移至21℃，相对湿度80％，16h光照，8h黑暗的温室中继续培养。
对喷洒禾谷镰刀菌孢子悬浮液7天后的各拟南芥进行表型鉴定，结果如图5所示。
图5A代表转ZmHINT基因的T3代拟南芥花序组织发病程度。
图5B代表转空载体pCAMBIA-1304的T3代拟南芥花序组织发病程度。
图5C代表野生型拟南芥的花序组织发病程度。
图5A表明，转ZmHINT基因的拟南芥在整个禾谷镰刀菌侵染过程中表型变化不明显，花序部位生长正常，能正常的开花结果。
图5B表明，转空载体pCAMBIA-1304的拟南芥的花瓣、萼片和花梗等整个花组织开始出现坏死斑块，随着时间推移，坏死斑块逐渐扩展，最后引起整个花组织的坏死甚至是新生角果的坏死。
图5C表明，野生型拟南芥的花瓣、萼片和花梗等整个花组织开始出现坏死斑块，随着时间推移，坏死斑块逐渐扩展，最后引起整个花组织的坏死甚至是新生角果的坏死。
图5表明，转ZmHINT基因的T3代拟南芥花序部位遭受禾谷镰刀菌浸染后发病的程度低于转空载体pCAMBIA-1304的T3代拟南芥及野生型拟南芥；转空载体pCAMBIA-1304的T3代拟南芥与野生型拟南芥发病相同，说明空载体pCAMBIA-1304在拟南芥抵抗禾谷镰刀菌的过程中起到的抗性作用不显著。
实施例4、转ZmHINT基因拟南芥、转空载体pCAMBIA-1304拟南芥及野生型拟南芥叶片发病程度分析
选取实施例3中的喷洒禾谷镰刀菌孢子悬浮液10天后的T3代转ZmHINT基因拟南芥和转空载体pCAMBIA-1304拟南芥及野生型的拟南芥叶片，观察坏斑的发病程度，如图6所示。
图6A代表转ZmHINT基因的T3代拟南芥的叶片发病程度。
图6B代表转空载体pCAMBIA-1304的T3代拟南芥的叶片发病程度。
图6C代表野生型拟南芥的叶片发病程度。
图6A表明，转ZmHINT基因的拟南芥在整个过程中没有发现叶片出现坏死斑块症状。
图6B表明，转pCAMBIA-1304空载体的拟南芥叶片出现坏死斑块，坏死斑块呈现灰白色或者黄褐色，随着侵染时间的推移，病斑不断扩展，最后导致这个叶片的坏死。
图6C表明，野生型拟南芥叶片出现坏死斑块，坏死斑块呈现灰白色或者黄褐色，随着侵染时间的推移，病斑不断扩展，最后导致这个叶片的坏死。
图6表明，转ZmHINT基因的T3代拟南芥叶片抗禾谷镰刀菌PH-1浸染的能力远高于转空载体pCAMBIA-1304的T3代拟南芥及野生型拟南芥。
综上，图5和图6表明，转ZmHINT基因的拟南芥的花序部位、叶片的综合发病程度显著低于转空载体pCAMBIA-1304的拟南芥和野生型拟南芥的花序部位、叶片的综合发病程度，说明了ZmHINT基因在促进植物抵抗生物胁迫病原菌禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)PH-1过程中发挥了积极的作用，从而增强了植物的抗病能力，有利于提高植物的免疫能力。

Claims (5)

1.如下任一物质在提高植物免疫能力和/或增强植物抗病性中的应用：
(1)SEQ ID No.4所示的蛋白；
(2)SEQ ID No.4所示蛋白的编码基因；
(3)含有(2)所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；所述免疫为针对禾谷镰刀菌引起的疾病的免疫；
所述抗病为抗禾谷镰刀菌引起的疾病；
所述植物为拟南芥。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述编码基因如SEQ ID No.3中自5’末端起第9位至第398位核苷酸所示。
3.一种制备免疫能力提高和/或抗病性增强的植物的方法，包括如下步骤：将SEQ IDNo.4所示蛋白的编码基因导入出发植物中，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物的免疫能力提高和/或抗病性增强；所述免疫为针对禾谷镰刀菌引起的疾病的免疫；所述抗病为抗禾谷镰刀菌引起的疾病；所述植物为拟南芥。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述编码基因是通过重组表达载体导入的，所述重组表达载体是将所述编码基因插入出发载体pCAMBIA-1304的多克隆位点得到的。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述编码基因如SEQ ID No.3中自5’末端起第9位至第398位核苷酸所示；
所述重组表达载体是将SEQ ID No.3所示的DNA分子插入出发载体pCAMBIA-1304的NcoI和SpeI酶切位点间得到的。
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