KR101161276B1 - 도관 특이적 발현 유도용 프로모터 및 이를 포함하는 발현 벡터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 도관 특이적 프로모터 및 이를 포함하는 발현 벡터에 관한 것으로 보다 상세하게는 식물체 내에서 도관조직에 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터, 이를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 세균 또는 식물, 및 상기 발현벡터가 식물체에 도입되어 목적 단백질의 도관 특이적 발현을 유도하는 방법 및 그러한 발현이 유도된 식물체의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 도관 특이 발현 유도 프로모터 및 이를 이용한 재조합 벡터는 식물체 도관 조직에 특이적으로 목적 단백질의 발현을 유도할 수 있다. 따라서 본 발명의 프로모터 및 이를 포함하는 발현벡터는 목적 단백질의 식물체 도관 조직 내에서의 발현 유도의 목적으로 유용하게 사용할 수 있다.

프로모터, 도관 특이, 형질전환, 애기장대

Description

도관 특이적 발현 유도용 프로모터 및 이를 포함하는 발현 벡터{Vascular tissue-specific promoter and expression vector comprising the same}

본 발명은 도관 특이적 프로모터 및 이를 포함하는 발현 벡터에 관한 것으로 보다 상세하게는 식물체 내에서 도관조직에 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터, 이를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 세균 또는 식물, 및 상기 발현벡터가 식물체에 도입되어 목적 단백질의 도관 특이적 발현을 유도하는 방법 및 그러한 발현이 유도된 식물체의 제조 방법에 관한 것이다.

육종이란 가축이나 작물의 유전학적 형질을 개선하여 이용가치가 높은 새로운 품종을 육성하는 것으로 기존 품종의 개량, 새 품종의 개발 및 새로운 종의 개발을 포함한다. 육종의 방법으로는 도입, 분리, 교잡, 잡종강세, 배수성, 돌연변이, 분자 육종법 등이 있으며, 최근 분자생물학 기술의 발전에 따라 분자 육종법이 주목을 받고 있다.

분자육종법은 분자생물학적 기법을 이용하여 새로운 형질을 생물에 도입하고 이를 선별하는 방법으로써 종래의 육종법에 비하여 시간 및 비용이 적게 들고, 종래 육종법으로는 얻을 수 없는 이종간의 형질 도입이 가능하다. 이러한 분자 육종 을 위하여서는 유용한 유전자를 발현 시킬 수 있는 수단 및 형질전환기법 등 여러 가지 수단이 필요하며, 특히 원하는 유전자를 원하는 부위에서 발현시키기 위한 다양한 프로모터 및 벡터의 개발이 필수적으로 요구된다.

유전자의 생물체내에서의 발현은 각 유전자의 상위 부위에 존재하는 프로모터의 활성에 의존한다. 본 발명은 유용유전자 다량발현 형질전환 작물을 개발 할 때 도입하고자 하는 외래유전자의 전신 발현 유도 프로모터에 관한 내용으로 식물 분자생물학 분야 중 유전자 발현 조절에 관한 매우 중요한 기술이다. 외래 유전자의 발현을 식물체의 전신 및 특별한 조직에만 국한시켜 형질전환 목적을 달성하는데 이용되는 공지된 프로모터들은 그 기능에 따라서 분류하면 다음과 같다. 1) 전신발현 유도 프로모터, 2) 종자 특이 프로모터, 3) 뿌리 특이 발현 프로모터, 4) 기타 조직 특이 발현 프로모터 등이 존재한다.

1) 전신발현 유도 프로모터

현재 식물 형질전환의 80%를 차지할 정도로 가장 많이 사용되고 있는 프로모터는 꽃양배추 모자이크 바이러스 (CaMV: cauliflower mosaic virus)의 35S RNA 유전자의 프로모터이며 대표적인 쌍떡잎식물용 프로모터로 이용되어 왔다. 최근에 국내 연구진에 의해 개발된 애기장대 유래의 포스파타제 2A를 암호화하는 PP2A유전자의 프로모터(참조: 등록번호 제 10-0803391) 등이 개발되어 이용 예정 중에 있다. 벼 등의 외떡잎식물용 전신발현 유도 프로모터로는 벼 액틴 (actin) 및 옥수수 유비퀴틴 (ubiquithin) 유전자 프로모터들이 주로 이용되어 왔으며, 최근 벼 시토크 롬 C 유전자 (OsOc1)의 프로모터가 국내 연구진에 의해 개발되어 사용 중에 있다 (참조: 등록번호 제 10-0429335). 전신발현 유도 프로모터들은 식물형질전환 기본 운반체 내에 선발마커로 이용되는 항생제나 제초제 저항성 유전자 및 리포터 유전자의 발현을 유도하기 위해 이미 내재되어 있으며, 연구적인 측면에서 목적하는 유전자의 식물체내 기능을 밝히고자 시도할 때 우선적으로 고려되는 중요한 프로모터들이다.

2) 종자 특이적 프로모터

종자는 식물체에서 대표적인 영양물질의 저장고로서 유용물질 축적의 극대화를 위하여 여러 가지 종자 특이 프로모터들이 개발되었다. 대표적인 외떡잎식물의 종자 특이 프로모터는 벼 주요 저장 단백질인 글루테린 (glutelin) 유전자의 프로모터로서 황금쌀 (golden rice) 개발을 포함하는 종자 특이적 발현을 유도하는 연구에 많이 사용되고 있고, 쌍떡잎식물의 종자 특이적 발현을 유도하는데 주로 사용되는 프로모터로는 콩 유래 렉틴 (lectin) 프로모터, 배추 유래 나핀 (napin) 프로모터 및 애기장대의 종자에서 감마 토코페롤 메틸기 전이효소 (γ-tocopherol methyl transferase:γ-TMT) 유전자 발현을 유도함으로써 비타민 E 생성을 증진시킨 연구에 사용된 당근 유래 DC-3 프로모터이며, 들깨 유래 올레오신 (oleosin) 프로모터의 종자 특이발현 유도 특허 등록 (참조: 등록번호 제 10-0685520) 사례가 있다. 이들은 주로 종자 자체가 식량이나 식품, 또는 식품의 원료로 사용되는 주요 작물에서 유용 단백질 축적 및 유용 물질 생성 등을 목적으로 주로 사용되고 있다.

3) 뿌리 특이 발현 프로모터

뿌리 특이 프로모터는 아직 상용화된 사례는 없으나, 최근 고구마 유래의 매즈 유전자(ibMADS)와 당 유도성 에이디피 글루코즈 파이로포스파타제 (ADP-glucose pyrophosphatase, AGPase) 유전자가 분리되어 해당 프로모터가 뿌리에서 특이 발현을 유도하며 당근, 무에서 뿌리 특이적 일시적 발현을 유도함을 확인하여 특허 등록(참조: 등록번호 제 10-0604186호, 제 10-0604191호)된 바 있으며, 최근 애기장대 유래 익스텐신 유전자 AtLRX와 뉴클레오사이드 포스파타제 유전자 AtNP의 프로모터가 뿌리 특이적으로 발현함을 확인하여 특허 등록(참조: 등록번호 제 10-0790809호, 제 10-0803390호) 되었다. 이들 프로모터는 식량이나 식품, 또는 식품의 원료로 사용되는 주요 뿌리작물에서 농업적 형질 개량이나 유용 단백질 축적 및 유용 물질 생성 등을 목적으로 주로 사용이 기대될 수 있다.

4) 기타 조직 특이 발현 프로모터

잎 등의 광합성 조직에서만 강력한 유전자의 발현을 유도하는 벼와 옥수수 유래의 알비씨에스(rbcS: ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit) 프로모터, 아그로박테리움 유래의 식물 뿌리 발현을 유도하는 RolD 프로모터, 감자 유래 괴경 특이 발현 유도 파타틴 (patatin) 프로모터, 토마토 유래의 과실 성숙 특이 발현 유도 피디에스 (PDS: phytoene synthase) 프로모터, 그리고, 그 기능이 배추꽃의 화분 특이적임이 확인된 배추 유래 oleosin 프로모터 등이 있으며 꽃의 웅성기관 약의 융단조직 특이 BcA9 프로모터(참조: 특허 등록번호 10-0435143)를 세포에 독성을 갖는 Bt 단백질 유전자의 발현을 유도케 함으로써 웅성불임 작물을 개발하여 특허 등록한 사례가 있다.

뿐만 아니라 최근에 도관을 따라 감염되는 병에 대한 저항성을 부여하거나 목질을 개선하고자 할 때 목적 유전자의 발현을 도관으로 제한할 필요성 때문에 도관특이 프로모터 개발이 진행되고 있다. 포플러 유래 Lmx 프로모터(참조: 미국특허 등록번호 20070180580), 호박유래 PP2-type 유전자의 프로모터(참조: 미국특허 등록번호 5495007)가 도관특이 프로모터로 개발되었고, 도관 특이 프로모터인 RolC와 Sh을 이용한 PLRV 저항성 식물체를 개발하여 논문을 발표한 사례(Michael W et al., Plant Molecular Biology, 33, p729-735, 1997)가 있다. 현재까지 개발된 도관특이 프로모터가 다른 종류의 프로모터보다 현저히 적으며, 발현 유도능이 충분하지 않거나, 범용성이 떨어지는 등의 단점이 있어 효율적이고, 우수한 도관특이 프로모터의 개발이 시급한 시점이다.

그 외에도 다양한 목적에 따른 다양한 식물 유래의 식물체 각 조직에 대하여 많은 수의 프로모터들이 보고되었고 현재에도 계속 개발이 진행 중이지만, 상용화 되었거나 식물 연구자들 사이에 범용되는 프로모터의 종류는 이상에서 언급된 경우에 대부분 속하며, 개발자의 의도에 따라서 보다 정밀하게 유전자 발현의 장소를 조절할 수 있는 새로운 프로모터들이 앞으로도 계속 개발될 필요성이 있다.

본 발명의 발명자들은 식물체에서 목적 유전자를 조직 특이적으로 발현시킬 수 있는 새로운 프로모터에 관하여 연구하던 중, 애기장대에서 분리한 PAtRS73 및 PAtRE8-32 프로모터가 식물체의 도관에서 특이적으로 목적유전자의 발현을 유도하는 활성이 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 식물체의 도관 특이적 프로모터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 식물체의 도관 특이적 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화 하는 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환 된 세균 및 식물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 목적 단백질의 도관 특이적 발현을 유도하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터를 식물체에 도입 하는 단계를 포함하는 목적 단백질이 도관에서 특이적으로 발현된 식물체의 제조 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 식물체의 도관 특이적 프로모터를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 식물체의 도관 특이적 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화 하는 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환 된 세균 및 식물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 재조합 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 목적 단백질의 도관 특이적 발현을 유도하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 재조합 벡터를 식물체에 도입 하는 단계를 포함하는 목적 단백질이 도관에서 특이적으로 발현된 식물 체의 제조 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 식물체의 도관 특이적 프로모터를 제공한다.

도관이란 식물 조직 중에서 가장 분화된 부분이며, 물관이라고도 한다. 겉씨식물 및 양치류에는 없으나 대부분의 꽃피는 식물에서 나타나며, 원시적인 형태의 헛물관(또는 가도관)이 분화되면서 세포 위아래의 양쪽 세포벽이 소실되어 만들어진 것으로 추측된다. 도관은 세로로 길게 연결된 물관세포들로 이루어졌으며 기다란 원통 모양에서 작달막한 북 모양까지 다양하다.

본 발명의 도관은 식물체의 잎, 줄기, 뿌리의 주맥과 측맥을 포함한다.

프로모터는 일반적으로 전사를 개시하는 지점을 포함하는 암호화 부위의 상류 쪽에 위치하는 유전자 부위로, 본 발명의 프로모터는 유전자 발현을 조절하는 TATA 박스, CAAT 박스 부위, 외부 자극에 반응하여 유전자 발현에 영향을 주는 부위 및 위치와 방향에 상관없이 거의 모든 유전자의 발현을 촉진하는 인핸서 등을 포함한다. 본 발명의 프로모터는 식물체의 도관에서만 특이적으로 발현을 유도하는 특징이 있으며 그 발현은 상시적일 수 있으며, 성장 정도, 밤/낮, 온도, 계절 등의 환경에 따라 한시적일 수 있다.

본 발명의 도관 특이적 프로모터는 형질전환체의 도관 조직 또는 도관조직세포에서만 특이적으로 목적유전자의 발현을 유도하며, 바람직하게는 서열번호 1 또 는 서열번호 2의 염기서열을 가질 수 있다.

본 발명의 프로모터를 이용하여 목적 단백질을 식물체의 도관에서만 특이적으로 발현하는 재조합 발현 벡터를 제조할 수 있다.

따라서 본 발명은 식물제의 도관 특이적 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

상기 발현 벡터는 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA를 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다. 발현벡터는 발현조절 서열 및 막표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 발현 조절 서열(expression control sequence)이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 또한 발현벡터는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함 할 수 있으며, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함 할 수 있다.

본 발명의 재조합 발현벡터에는 당업계에 알려진 다양한 단백질을 암호화하 는 염기서열을 포함할 수 있으며, 이 목적 단백질을 암호화하는 염기서열은 프로모터와 작동 가능하게 연결된다. 작동 가능하게 연결(operably linked) 된다는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다.

본 발명에 따른 목적단백질은 본 발명의 프로모터에 의해 식물체의 도관 특이적으로 발현시키고자 하는 외부 유래의 어떤 표적 단백질, 즉, 외인성 단백질이거나 또는 내인성 단백질 및 리포터 단백질 일 수 있다. 상기 외인성 단백질은 식물체의 특정 조직 또는 세포에 천연적으로 존재하지 않는 단백질을 말하며, 상기 내인성 단백질은 특정 조직 또는 세포에 천연적으로 존재하는 유전자에 의해 발현된 단백질을 말한다. 또한 상기 리포터 단백질은 리포터 유전자에 의해 발현된 단백질로서 그 존재에 의하여 세포 내에서의 그의 활성을 알려주는 표지 단백질을 말한다. 목적단백질은 항생제 저항성 단백질, 제초제 저항성 단백질, 바이러스 저항성 단백질, 해충 저항성 단백질, 대사 관련 단백질, 발광 단백질, GFP(green fluorescence 단백질), GUS(β-glucuronidase), GAL(β-galactosidase) 등을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 발현 벡터는 단백질 발현에 사용되는 기존의 벡터를 기본 골격으로 하여 본 발명의 프로모터를 삽입하고 상기 프로모터의 하류(downstream)쪽으로 목적단백질을 암호화하는 염기서열을 삽입함으로써 제조할 수 있다. 상기 단 백질 발현에 사용되는 기존의 벡터는 공지의 재조합 발현 벡터로 특히 형질전환 식물의 제조에 이용될 수 있는 식물 형질전환용 재조합 발현벡터일 수 있다. 그 예로는 대장균 유래 플라스미드, 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드, 효모 유래 플라스미드 및 Ti 플라스미드 등의 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파지 벡터 및 바이러스 벡터 등일 수 있으나, pCHF3, pPZP, pGA 및 pCAMBIA 계열 같은 일반적인 이원 벡터(binary vector) 또는 코인테그레이션 벡터(cointegration vector)가 사용될 수 있다. 식물형질전환시 널리 사용되는 바이너리 벡터의 종류는 매우 다양하며, 거의 모든 바이너리 벡터가 CAMBIA(center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture, GPO Box 3200, Canberra ACT2601, Australia)와 같은 국제 센터 및 대학 연구소에서 입수 가능하다.

바람직하게는 본 발명의 AtRS73 또는 AtRE8-32 프로모터를 포함한 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 일실시예에서는 녹색형광단백질 유전자인 Egfp 및 청색발색 유전자인 Gus가 연결된 형태의 리포터시스템이 내재되어 있는 공지된 pBGWFS7 벡터에 서열번호 1 또는 2의 염기서열을 가지는 본 발명의 AtRS73 또는 AtRE8-32 프로모터를 Egfp 및 Gus 유전자의 상류 부분에 작동 가능하게 연결한 재조합 발현 벡터인 pBGWFS7-PAtRS73 또는 pBGWFS7-PAtRE8-32를 제조하였다(실시예 1 참조).

본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터는 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 숙주내로 도입할 수 있다. 그 예로는 이에 한정되지는 아니하나, 염화칼슘 및 열 쇼크법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공법(electroporaion), PEG-매게 융합법, 미세사출법, 미세주입법, 리포좀 매개법 및 진공침윤법등을 사용할 수 있다.

따라서 본 발명은 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포를 제공한다.

상기 숙주 세포로는 세균(bacteria)이 바람직하며, 좀 더 바람직하게는 대장균, 바실러스 서브틸리스, 스트렙토마이세스, 슈도모나스, 프로테우스 미라빌리스, 스타필로코쿠스, 아그로박테리움 튜메파시엔스 및 아그로박테리움 라이조게네스일 수 있다. 가장 바람직하게는 아그로박테리움 튜메파시엔스일 수 있으며 본 발명의 일실시예에서는 아그로박테리움 튜메파시엔스 GV3101을 사용하였다.

또한, 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터는 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 식물체 내로 도입할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 아그로박테리움(Agrobacterium sp.)매개에 의한 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처 리(sonication), 전기천공법(electroporaion), PEG-매게 융합법, 미세사출법, 미세주입법, 리포좀 매개법, 진공침윤법 및 화아침지법을 사용할 수 있다. 바람직하게는 아그로박테리움(Agrobacterium sp.)매개에 의한 방법을 사용할 수 있으며 문헌에 예시된 방법을 사용할 수 있다(Horsch et al., Science 227:1229-1231, 1985; An et al., EMBO J. 4:227-288, 1985).

따라서 본 발명은 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환 된 식물을 제공한다.

상기 식물이란 전체 식물, 식물의 일부분, 캘러스, 식물조직, 식물세포 및 식물 종자를 모두 포함한다. 상기 본 발명의 식물은 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물을 모두 포함하며, 상기 쌍자엽 식물은 이에 제한되지는 않으나, 애기장대, 대두, 담배, 가지, 도라지, 고추, 감자, 콩, 토마토, 배추, 무, 양배추, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 당근, 오이, 당근, 샐러리, 인삼, 사과, 포도, 복숭아, 대추, 감, 자두, 살구, 감귤, 장미 및 유채일 수 있으며, 상기 단자엽 식물로는 이에 제한되지는 않으나 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 파, 마늘, 백합, 글라디올러스, 아스파라거스 및 양파일 수 있다.

상기 식물세포로는 모상근 세포일 수 있으며, 추가적으로 상기 식물세포는 통상적인 방법에 따라 배양되어 약체 배양물, 캘러스, 원형질배양물이 될 수 있으 며, 분화되어 식물의 조직 또는 식물이 될 수 있다. 즉, 본 발명의 재조합 벡터가 도입된 형질전환 모상근들은 당업계에 공지된 표준기술을 사용하여 캘러스 유도, 발근 및 토양 순화와 같은 과정을 거쳐 식물체로 재분화시킬 수 있으며, 꺾꽂이, 접붙이기 등과 같은 무성번식방법 및 종자를 이용하여 유정번식방법에 의해 생산할 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 목적 단백질의 도관 특이적 발현을 유도하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 목적 단백질이 도관에서 특이적으로 발현된 식물체의 제조 방법을 제공한다.

한편, 본 발명에서 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 다음 문헌에 기재되어 있다(Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989); by Silhavy, T. J., Bennan, M. L. and Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1984); and by Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-lnterscience (1987)).

본 발명의 일실시예에서는 애기장대의 공개된 전체 게놈상의 유전자를 분석하여 도관 특이 발현 가능성이 보이는 유전자들을 발굴하여 이 유전자들의 개시코돈 상위의 TATA 박스 등을 포함하는 프로모터 영역을 특정하고, 이를 PCR 방법을 통하여 애기장대에서 증폭하여 분리 하였다. 여기에 박테리오파지 측 특이 재조합 핵산 서열을 붙이고 이를 pBGWFS7에 클로닝 하여 최종운반체인 pBGWFS7-PAtRS73과 pBGWFS7-PAtRE8-32를 완성하였다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 상기 제조한 재조합 벡터를 아그로박테리움 GV3101 균주를 통하여 애기장대 식물체에 도입하여 PAtRS73 및 PAtRE8-32 프로모터의 발현 특성을 관찰하였다. 그 결과 본 발명의 PAtRS73 및 PAtRE8-32 프로모터는 식물체 전체에 걸쳐 도관 조직에 특이적으로 발현을 유도함을 확인하였다(실시예 2 참조).

따라서, 본 발명의 도관 특이 발현 유도 프로모터 및 이를 이용한 재조합 벡터는 식물체 도관 조직에 특이적으로 목적 단백질의 발현을 유도할 수 있다. 따라 서 본 발명의 프로모터 및 이를 포함하는 발현벡터는 유용 유전자의 식물체 도관 조직 내에서의 발현 유도의 목적으로 유용하게 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

프로모터 분리 및 식물 형질전환용 플라스미드 제작

<1-1> 프로모터 분리

공개된 애기장대 전체 게놈 상에 존재하는 유전자의 AtGen Express(http://www.weigelworld.org/) 데이터 검색을 통해 이들 유전자의 컴퓨터상에서의(in silico) 조직특이 발현도를 조사하여 전신 발현을 보이는 유전자를 공개된 애기장대 전체 염기서열로부터 유전자를 검색하여 단백질 미지의(unknown) 유전자의 개시코돈 상위에 TATA box 등을 포함하는 약 1.86kb 영역(서열번호 1)과 펩타이드/아미노산 이동 유전자로 추정되는 유전자(putative peptide/amino acid transporter 유전자)의 개시코돈 상위에 TATA box 등을 포함하는 약 1.91kb 영역(서열번호 2)을 각각 분리하였다.

<1-2> 형질전환용 플라스미드 제작

애기장대 식물체의 잎 조직 소량을 에펜도르프 튜브에 넣고 유전체DNA 정제 킷(I.J.BIO DNA System)을 이용하여 분리 정제하였다. DNA 용출액은 자외선 흡광도 분석기(UV spectrophotometer)를 이용하여 A₂₆₀/A₂₈₀를 측정하여 정량하였다. 애기장대로부터 분리한 유전체 DNA로부터 박테리아가 박테리오파지에 감염될 때 박테리아측 특이적으로 가지고 있는 재조합 핵산서열 부위를 일부 포함하면서 AtRS73을 특이적으로 증폭할 수 있도록 설계된 표1의 서열번호 3과 4의 프라이머 세트와 AtRS8-32를 특이적으로 증폭할 수 있도록 설계된 표1의 서열번호 5와 6의 프라이머 세트를 제작하여 유전자 증폭 반응(PCR : polymerase chain reaction)을 통해 각각 약 1.87kb와 1.91kb의 프로모터 부위를 다시 분리하였다.

플라스미드 제작에 사용된 프라이머 쌍

서열번호	프라이머명	염기서열
3	RS73-B1	5'-AAAAAGCAGGCTGTGATTTATCTGTCCATCGG-3'
4	RS73-B2	5'-AGAAAGCTGGGTGTTGTGGTTTAGGAGCAAAG-3'
5	RE8-32-B1	5'-AAAAAGCAGGCTGATTTATCAAACCTCCCACA-3'
6	RE8-32-B2	5'-AGAAAGCTGGGTCAATTTTCACGTAAAGCTGA-3'
7	35S-F	5'-AAAAAGCAGGCTGGTCCCCAGATTAGCCT-3'
8	35S-R	5'-AGAAAGCTGGGTCCCGGGGATCCTCTAGA-3'
9	B1	5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3'
10	B2	5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3'

이 때, PAtRS73과 PAtRE8-32의 기능을 쌍자엽 식물의 형질전환에 주로 사용되는 P35의 활성과 비교하기 위하여 박테리아측 특이적 재조합 핵산서열 부위를 일부 포함하면서 P35S를 증폭할 수 있도록 설계된 표1의 서열번호 7과 8의 35S-F 프라이머와 35S-R 프라이머를 제작하여 P35S 부위를 분리하였다. 증폭된 PCR 산물들은 박테리아가 박테리오파지에 감염될 때 박테리아측 특이 재조합 핵산서열 부위 전체를 포함하는 어댑터 프라이머인 표1의 서열번호 9와 10의 B1과 B2를 사용하여 각각 재 PCR되었다.

2차로 PCR된 산물들은 박테리아가 박테리오파지에 감염될 때 박테리오파지 측 특이 재조합 핵산서열 부위를 포함하는 pDONR221 벡터(인비트로젠 생명 기술사, 미국)와 BP 재조합반응, 즉, BP 반응 버퍼, pDONR221 벡터 150ng 및 게이트웨이 BP 클로나제(clonase)효소 혼합액과 상기 PCR 산물 200ng을 섞어 25℃에서 하룻밤 동안 반응시키는 과정을 거쳐 pDONR-PAtUK2와 pDONR-P35S의 클로닝 벡터가 제작되었다. 서브 클로닝 된 두 종류의 이 운반체들은 최종 식물형질전환 운반체를 제작하기 위해 녹색형광단백질 유전자인 Egfp 와 청색발색 유전자인 Gus 유전자가 연결된 형태의 리포터 시스템과 스펙티노마이신(spectinomycin) 저항성 유전자 및 식물체 선발인자인 제초제에 저항성을 가지는 Bar 유전자가 내재되어 있는 pBGWFS7 벡터와 다시 LR 재조합 반응, 즉, LR 반응 버퍼와 게이트웨이 LR 클로나제(clonase)효소 혼합액과 상기 클로닝 벡터(300ng)를 섞어 25℃에서 하룻밤 동안 반응시키는 과정을 수행하여 최종적인 pBGWFS7-PAtRS73, pBGWFS7-PAtRE8-32와 pBGWFS7-P35S 운반체가 완성되었다(도 1 참조). 이 때, 기본 운반체로 사용된 pBGWFS7은 미생물 선발을 위한 스펙티노마이신(spectinomycin) 저항성 유전자를 가지며, 식물체 선발인자로 제초제 저항성 Bar유전자를 포함하고 있다. 제작된 형질전환용 운반체들은 액체질소를 이용한 직접적인 아그로박테리아 형질전환 방법 (참조: Holster 등의 freeze-thaw method, 1978)에 따라 아그로박테리아 튜메파시엔스 균주 GV3101에 형질전환 시킨 후, An 등의 알칼리 방법에 근거한 아그로박테리아 급속 선발(quick-screen)을 이용하여 아그로박테리아 내 도입을 확인하였다.

<실시예 2>

애기장대 형질전환 유도

파종한 후 22℃ 배양기(16시간 낮/8시간 밤)에서 약 4주간 생육된 애기장대 (Arabidopsis thaliana ecotype Columbia) 식물체의 일차 추대를 제거하여 최소한 3-4개의 이차 추대를 유도한 후, 상기 실시예 1에서 만들어진 각 식물형질전환 운반체가 보유된 아그로박테리아를 LB broth(Bacto tryptone 10g, Bacto yeast extract 5g, sodium chloride 5g, Glucose 1g/1L 증류수, pH 7.2~7.3) 배지에서 28℃, 이틀밤 동안 현탁배양한 배양액을 5,000rpm에서 5분간 원심분리로 집균한 후, 상등액은 버리고 5% sucrose와 2500ppm tween 20이 함유된 용액을 넣고 OD 0.8 정도로 희석한 현탁액을 꽃봉오리에 분사하여 아그로박테리아를 감염시킨다. 충분한 습도와 암 조건을 유지한 상태로 하룻밤동안 배양한 후 22℃ 배양기(16시간 낮/8시간 밤)에서 4~5일간 배양한 후 상기와 동일한 방법으로 배양하여 희석한 아그로박테리아를 재차 화기조직에 분사하고 충분한 습도와 암 조건을 유지한 상태로 하룻밤동안 배양한 후 22℃ 배양기(16시간 낮/8시간 밤)에서 꼬투리 조직(silique)이 갈색으로 완전히 성숙 할 때까지 약 3~5주간 생육 시킨 후 채종하였다. 채종된 종자는 다시 파종하여 생육 10일째 일차, 17일째 이차로 0.3% 바스타를 살포함으로써 T1세대의 형질전환체를 선발하였다. T1 형질전환 식물체는 22℃ 배양기(16시간 낮/8시간 밤)에서 꼬투리 조직(silique)이 갈색으로 완전히 성숙 할 때까지 약 2달간 생육 시킨 후 T2 종자를 채종하였다.

<실시예 3>

형질전환 된 애기장대의 GUS 청색발색 반응 분석

PAtRS73과 PAtRE8-32 및 P35S 형질전환 T2 종자를 파종하여 생육 10일째 1차, 17일째 2차로 0.3% 바스타를 살포하여 선발된 형질전환 애기장대 식물체의 잎, 줄기, 뿌리, 꽃 및 꼬투리 등 여러 조직으로부터 생육 단계별로 관찰하였다. 대조구로 비형질전환 애기장대 식물체는 바스타를 처리하지 않고 발아시켰다. 발아 후 7일, 21일, 42일의 형질전환 애기장대 식물체를 GUS-assay 버퍼[Sol. I: 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-glucuronide cyclohexylammonium salt (X-gluc CHA salt) 20mM, Sol. II : NaH₂PO₄ H₂O 100mM, NaEDTA 10mM, Triton-X-100 0.1%, pH7.5]에 침지하고 37℃에서 24시간 처리 후, 70% 에탄올을 처리하여 클로로필(chlorophyll)을 제거하였다. 식물체는 광학 현미경을 이용하거나 육안으로 관찰하였다.

그 결과 도 2에서 보는 바와 같이 발아 7일째의 유묘단계부터 P35S 및 PAtRS73, PAtRE8-32 형질전환체는 전신에 GUS 청색발색이 관찰된 반면, 비형질전환 애기장대에서는 GUS 청색발색이 전혀 보이지 않았다. 21일의 식물체에서도 비형질전환 애기장대에서는 GUS 청색발색이 전혀 보이지 않은 반면 P35S 및 PAtRS73, PAtRE8-32 형질전환체는 GUS 청색발색이 식물체 전신에서 관찰되었다.

또한 PAtRS73과 PAtRE8-32 형질전환체는 모두 전신발현의 도관 특이적 발색 특성을 보였는데 발색형태가 서로 다르게 나타났다(도 3 참조). PAtRS73 형질전환체는 식물의 뿌리와 잎, 줄기 등의 식물체의 주맥(main vein)에서 발색을 보였고(도 4 참조), PAtRE8-32는 식물체 전체의 뿌리 및 잎맥의 전체 도관조직으로 강하게 발현됨을 관찰하였다(도 5 참조).

이로써 PAtRS73과 PAtRE8-32는 식물체 전 기관에서 도관 조직 특이적 (vascular tissue-specific) 발현을 유도하는 프로모터임을 확인하였다.

이상 살펴본 바와 같이, 따라서, 본 발명의 도관 특이 발현 유도 프로모터 및 이를 이용한 재조합 벡터는 식물체 도관 조직에 특이적으로 목적 단백질의 발현을 유도할 수 있다. 따라서 본 발명의 프로모터 및 이를 포함하는 발현벡터는 유용 유전자의 식물체 도관 조직 내에서의 발현 유도의 목적으로 유용하게 사용할 수 있어 산업상 이용 가능성이 높다.

도 1의 A는 PAtRS73 프로모터가 도입된 식물형질전환용 운반체 pBGWFS-PAtRS73의 모식도, B는 PAtRE8-32 프로모터가 도입된 식물형질전환용 운반체 pBGWFS-PAtRE8-32의 모식도, C는 P35S 프로모터가 도입된 식물형질전환용 운반체 pBGWFS7-P35S의 모식도이다(PAtRS73: 애기장대 단백질 unknown 유전자의 프로모터; PAtRE8-32: 애기장대 putative peptide/aminoacid transporter 유전자의 프로모터; P35S: cauliflower mosaic virus 35S 프로모터; LB: 좌측면; Tnos: nos 터미네이터; Bar: 제초제저항성 유전자; Pnos: nos 프로모터; attB1, attB2: 게이트웨이 클로닝에 사용되는 어댑터; Egfp: 녹색형광단백질(green fluorescent protein) 리포터 유전자; Gus: 청색발색(β-glucuronidase) 리포터 유전자; T35S: 꽃양배추바이러스 35S 터미네이터; RB: 우측면; Sp^R: 스펙티노마이신 저항성 유전자).

도 2는 pBGWFS-PAtRS73, pBGWFS-PAtRE8-32, pBGWFS7-P35S로 형질전환된 애기장대의 유묘 및 잎 발달 과정 중의 청색발색 반응을 관찰한 것이다(Col0: 비형질전환 애기장대; P35S: pBGWFS7-P35S 형질전환 애기장대 식물체; PAtRS73: pBGWFS7-PAtRS73의 형질전환 애기장대 식물체; PAtRE8-32: pBGWFS7-PAtRE8-32의 형질전환 애기장대 식물체; 7D: 발아 후 7일째의 애기장대 유묘; 21D: 발아 후 21일째의 애기장대 식물체).

도 3은 PAtRS73의 형질전환체(1, 2, 3)와 PAtRE8-32의 형질전환체(4, 5, 6)의 식물체 전체의 청색발색 반응을 관찰 것이다.

도 4는 PAtRS73 형질전환체의 발아 후 6주째 잎, 뿌리, 줄기, 꽃, 꼬투리 등 각 기관별 청색발색 반응을 관찰 것이다.

도 5는 PAtRE8-32 형질전환체의 발아 후 3주째 잎, 뿌리, 줄기 등 각 기관별 청색발색 반응을 관찰 것이다.

<110> Republic of Korea (Management: Rural Development Administration) <120> Vascular tissue-specific promoter and expression vector comprising the same <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1866 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 gtgatttatc tgtccatcgg tatcacttgt agtataagac tgatgaactg actaacatct 60 gatggaattt ttttagtggt tcttaattat gtagcaagat atgatgcatg catcgtggtt 120 tcaaagtgtt aactttatat aatggattta tgaaatgaaa tagacataat tgttgattga 180 ggccaattat taaaatatga acatgcatgc atctatatct atcgtttgtc cgcaaatgca 240 tgttacgcaa atttagataa atcttcacag catatccatg agaaatataa aaaaatgtta 300 cttttttttt aacgtctagt aaaaaaaagt aatcatcttt aacatatttc aatttatatg 360 acgaagctga aatcagcatt agaaagaaga aaaacgtgaa gttgaacaac aacaaaaaag 420 aacacatgtt gatttgtcac ttagaaaaca aatcgaagtt agagattaat ctagaaagta 480 atcagaagaa atttcaaaaa cttgacattc tttaggagaa ggaatggatc tagctgaatc 540 tttactacaa gagtcaaaaa tttattgata tataatacag ttatacactt gactaagctt 600 ataaggttta gaattttatt attttcttat tttggtaatc tatgtaacgt ttgtgatttt 660 tgaacaaaac aggtcatgaa aagcacatat aagtttttac gaggcaatat tacaccaaag 720 tttatcacaa ataattagtt tgttaaatgg tactaataag atttaattct ttgttgttta 780 atgaactgaa gtgttctaac ttaagatccc tatattttcc atttgaaatt tcgctccacc 840 aataatcgaa ttaaggaaaa cgtaaaaagc gattagttta ttcgtcgatt atgattaaac 900 gaacaagttc caaaaatgca tatttagaat ttctagtcta ttatggcttt gggctataac 960 cttacggaaa ttatcaatgt aagtttcgtc gaaataaaaa tttcacttct ctatatatcg 1020 taaatacata aatctccaaa cacatgtctt ggattttttt aataatgtat atatatatat 1080 atagagaaaa aaacacttag aagatttttt tgaattttat aaagagaaat atatattaag 1140 aataagagag aggaaggcat gtaggcatgg gattgtgcct cttcattgaa cgacaatact 1200 tctcatcctc acaaatggtt gccttaccat tggttggcat tcgcatgcat cctccaactt 1260 attttaatta ttattgtcgt taatatatta aactacatag aatcttcatt atgtttatcg 1320 taatgccttc gttacgcctt tatttgctcc ccatgtgttt actcttacct cattttcgaa 1380 ctccaaactt agttccatag ttttggaaga ttggtgtaaa tggtcaaacg tttttagaat 1440 atatatgatc atagttacgt caagatcttc aagaaacaaa tctggtatac aaaaaaaatt 1500 ggtcacaaaa tcacaatcaa gaaaatgtat gtgttacatt ttatggatag tgaagaataa 1560 taaaatagta ataagaattg ctgaagagga ctctctagtt gacatacaca tcttacattc 1620 attccaacca tttaaataat gtaaacgaat aacaaaacgc attatttcaa taaataatat 1680 tattctgata ctaaaattta aaaatctaaa gtgtaatgat gaataaaaca ccccacgagc 1740 cattcacaca tctcaacttt ttattctcct agaagaaact atagattata tctctcatta 1800 tctcactatc ttctccatat acttgttcaa ttcaatcatt cctttgcttt gctcctaaac 1860 cacaac 1866 <210> 2 <211> 1911 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 atttatcaaa cctcccacat gtttagacta gctttagaat agccctagct tgggttaatt 60 ttgttgaaaa ctagaatcca ctagccctag cttgggttaa ttacgttgaa tactacagct 120 tgatcagcat tgtttctaga ttaccttttt tttttttttt tcaattgtac ataggattta 180 cttatatttt cgaatggata catgaaacaa gaatacttca tcatatatgt ttatattttt 240 taaaaaatca gattttatag acaattctat tttgactatt caggatatta ttaaatacag 300 ttttcatttt ctttatctat cttgttttta ttttttgact gaaggacttg tcagtaacaa 360 aagtaaaaca acaggtttgt tatatcttgt ttttttttgt ctcccccaaa tgattttcag 420 aaataaaaat atttgtgagt ggcactcata cgtaattaag aggcagggaa tggggcataa 480 ctggcagtaa gaaacaaaag aagaaaaata gtaaaagtca aaagtcgacc catcagtcac 540 tctctaacgc gttagtcaat gggaaccggc aaatggagac cgagacgcca ctcgccgaac 600 cggcaattat gggtaaccgc caccggttta cttctctaaa gttctgactt tccttaatta 660 ttgcaacacg aattttgaaa tggccaatta atacatgctc tgttcggttt tgtttgtact 720 agtcaactat tagcgaccga attattgact attcaatagt tcaacgttaa attattaagg 780 acaattcaaa actattcctt tcatattcaa catttttatt tagagacaaa atcaccaatc 840 cataatttaa tttatttatt tattaatcat ttaagcggtt cgaaaactat atcactaaaa 900 tcaattggta aaccaataaa ttacaaaacg atcatgattt actagagctt ctcgtttttg 960 aggttgaaga ctgttggtct cccaaaaaaa aaaaatcaat ttaccccaaa actattttta 1020 ttttgcatta attaattatt atcataaaac tttattaaca ccataaattg catttggtgc 1080 ttcaaaaaat aaaatagtat ttatttactt aattccttac caaatatttt atatccaagt 1140 tgtggaggtc ataaaattgg cccaacaagt acaaattagg aaacccacta atatttaaag 1200 cccaataggt ccactcaatt ttgcaatttc ttaaaacgtg ttgttaacaa gaacacattt 1260 tatggtccag tggtcaccgc caccaacttc tcgacttcga gagagacaag agtaatccaa 1320 cgatctggtt gatagtggta acactgttcc aatgagcatt ttttggcata tccctcaata 1380 tatctttatt gggaacatct agcgttttgt tctttcttag tcggcttgat tttttctatg 1440 aacaatctct agatgcaaaa tttgtgtagt gcttggactc ttcactcggc tcattgattc 1500 ttacacttgt tgcatatttc acgacaatga accttagtaa cggtcatctt gattactatt 1560 tttggctttt ggtctgtctt ggctttgtta atttaccggt ttggctagaa aggtttcgta 1620 agatttgttt gatgtcttct ttaaaacttg aagtctctaa cttgtttgat aacttttgtt 1680 gtgttagggg aaaagtgtgc tatggctcaa aatttgctta atgcttaagt ctaatcagat 1740 taataaagtt tgtgtggttt tatattccct cttttttttt ataacatttt ttaaagaatg 1800 tggttctgtg gtgagtgacc actcacacca ccaacaacaa cttggtcagt gggaggatca 1860 ttttatttga tccttcgttg agaagcttaa atcagcttta cgtgaaaatt g 1911 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RS73-B1 : primer for RS73 <400> 3 aaaaagcagg ctgtgattta tctgtccatc gg 32 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RS73-B2 : primer for RS73 <400> 4 agaaagctgg gtgttgtggt ttaggagcaa ag 32 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RE8-32-B1 : primer for RE8-32 <400> 5 aaaaagcagg ctgatttatc aaacctccca ca 32 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RE8-32-B2 : primer for RE8-32 <400> 6 agaaagctgg gtcaattttc acgtaaagct ga 32 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 35S-F : primer for 35S <400> 7 aaaaagcagg ctggtcccca gattagcct 29 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 35S-R : primer for 35S <400> 8 agaaagctgg gtcccgggga tcctctaga 29 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B1 : adapter primer <400> 9 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggct 29 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B2 : adapter primer <400> 10 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggt 29

Claims (12)

1. 서열번호 1 또는 2의 염기서열을 포함하는 식물체의 도관 특이적 프로모터.
2. 제1항에 있어서, 상기 도관은 식물체의 주맥(mail vain) 또는 전체 도관 조직인 프로모터.
3. 제1항의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터.
4. 제3항에 있어서, 상기 재조합 발현 벡터가 도1에 기재된 pBGWFS7-PAtRS73 또는 pBGWFS7-PAtRE8-32인 재조합 발현 벡터.
5. 제3항 또는 제4항의 재조합 발현 벡터로 형질전환 된 아그로박테리움 속 세균.
6. 제5항에 있어서, 상기 아그로박테리움 속 세균은 아그로박테리움 튜메파시엔스 또는 아그로박테리움 라이조게네스인 것임을 특징으로 하는 형질전환 된 세균.
7. 제3항 또는 제4항의 재조합 발현 벡터로 형질전환 된 쌍자엽 식물.
8. 삭제
9. 제7항에 있어서, 상기 쌍자엽 식물은 애기장대, 대두, 담배, 가지, 도라지, 고추, 감자, 콩, 토마토, 배추, 무, 양배추, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 당근, 오이, 당근, 샐러리, 인삼, 사과, 포도, 복숭아, 대추, 감, 자두, 살구, 감귤, 장미 및 유채로 이루어진 군 중에서 선택되는 식물
10. 삭제
11. 제3항의 재조합 발현 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 목적 단백질의 도관 특이적 발현을 유도하는 방법.
12. 제3항의 재조합 발현 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 목적 단백질이 도관에서 특이적으로 발현된 식물체의 제조 방법.

Images