KR101015972B1

KR101015972B1 - 화분 특이 발현 프로모터 ＢｒＲＦ1

Info

Publication number: KR101015972B1
Application number: KR1020080117379A
Authority: KR
Inventors: 김영미; 임명호; 김정선; 한범수; 한유경; 하선화; 강상호
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2008-11-25
Filing date: 2008-11-25
Publication date: 2011-02-23
Also published as: KR20100058827A

Abstract

본 발명은 서열번호:1로 구성되는 화분 특이 발현 프로모터, 서열번호:2로 구성되는 올리고누클레오티드 및 서열번호:3으로 구성되는 올리고누클레오티드로 이루어지는 상기 화분 특이 발현 프로모터를 증폭하기 위한 프라이머, 상기 서열번호:1의 프로모터 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현벡터 pBGWFS7-PBrRF1 및 상기 발현벡터 pBGWFS7-PBrRF1으로 형질전환된 식물체에 관한 것으로, 배추의 시스테인 프로테이나아제 유사단백질 유전자의 개시코돈 상위에 TATA box 등을 포함하는 약 2kb 영역(서열번호 1)을 분리하고, 애기장대로부터 분리한 게노믹 DNA로부터 박테리아가 박테리오파지에 감염될 때 박테리아측 특이적으로 가지고 있는 재조합 핵산서열 부위를 일부 포함하면서 PBrRF1를 특이적으로 증폭할 수 있도록 설계된 서열번호 2와 3의 프라이머 세트를 제작하여 유전자 증폭 반응(PCR : polymerase chain reaction)을 통해 약 2kb의 프로모터 부위를 다시 분리한 다음, 증폭된 PCR 산물들은 박테리아가 박테리오파지에 감염될 때 박테리아측 특이 재조합 핵산서열 부위 전체를 포함하는 어댑터 프라이머 B1인 "5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3'"와 B2인 "5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3'를 사용하여 각각 재 PCR하고, 2차로 PCR된 산물들을 박테리아가 박테리오파지에 감염될 때 박테리오파지 측 특이 재조합 핵산서열 부위를 포함하는 pDONR221 벡터와 BP 재조합반응시켜 pDONR-PBrRF1과 pDONR-P35S의 클로닝 벡터를 제작하고, Egfp 와 Gus 유전자가 연결된 형태의 리포터 시스템이 내재되어 있는 pBGWFS7 벡터와 다시 LR 재조합 반응시켜 pBGWFS7-PBrRF1 운반체를 제작한 후, 액체질소를 이용한 직접적인 아그로박테리아 형질전환 방법에 따라 아그로박테리아 튜메파시엔스 균주 GV3101 및 EHA105에 각각 형질전환 시킨 후, 이를 식물에 감염시켜 형질전환된 식물체를 얻음으로써 다른 조직에는 영향을 미치지 않으면서 화분에서만 발현하여 웅성불임을 유도하는데 소요되는 시간과 노동력을 절감하고 일대잡종인 우량종자 생산을 가능하게 하는 효과를 얻을 수 있었다.

화분 특이 발현, 프로모터, 배추, 애기장대, 조직특이, 형질전환체, 청색발색 단백질

Description

화분 특이 발현 프로모터 ＢｒＲＦ1{POLLEN-SPECIFIC PROMOTER BrRF1}

본 발명은 서열번호:1로 구성되는 화분 특이 발현 프로모터, 서열번호:2로 구성되는 올리고누클레오티드 및 서열번호:3으로 구성되는 올리고누클레오티드로 이루어지는 상기 화분 특이 발현 프로모터를 증폭하기 위한 프라이머, 상기 서열번호:1의 프로모터 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현벡터 pBGWFS7-PBrRF1 및 상기 발현벡터 pBGWFS7-PBrRF1으로 형질전환된 식물체에 관한 것이다.

프로모터에는 외래 유전자의 발현을 항시 발현하는 항구성 프로모터, 식물체의 전신 및 특별한 조직에만 국한시켜 형질전환 목적을 달성하는데 이용되는 특이성 프로모터들로 구분되는 데 이들은 그 기능에 따라서 다음과 같이 분류할 수 있다.

첫째로 항구성 전신발현 프로모터를 들 수 있다. 식물 항구성 프로모터로는 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV: cauliflower mosaic virus)의 35S RNA 유전자의 프로모터가 대표적인 쌍떡잎식물용 프로모터로 사용되고 있고, 벼 등의 외떡잎식물용 항구성 프로모터로는 벼 액틴(actin) 및 옥수수 유비퀴틴(ubiquithin) 유전자 프로모터들이 주로 이용되어 왔으며, 최근 벼 시토크롬 C유전자(OsOc1)의 프로모터 가 국내 연구진에 의해 개발되어 사용 중에 있다(국내 특허등록 제429335호에 기재). 이들은 식물형질전환 기본 운반체 내에 선발마커로 이용되는 항생제나 제초제 저항성 유전자 및 리포터 유전자의 발현을 유도하기 위해 이미 내재되어 있으며, 연구적인 측면에서 목적하는 유전자의 식물체내 기능을 밝히고자 시도할 때 우선적으로 고려되는 프로모터들이다.

둘째로, 종자 특이 프로모터를 들 수 있다. 대표적인 예로서 벼 주요 저장 단백질 유전자의 프로모터들로서 황금쌀(golden rice) 개발에 사용된 벼 글루테린(glutelin) 프로모터가 현재까지 외떡잎 식물의 종자 특이적 발현을 유도하는 경우에 많이 사용되고 있고, 쌍떡잎 식물의 종자 특이적 발현을 유도하는데 주로 사용되는 프로모터로는 콩 유래 렉틴(lectin) 프로모터, 배추 유래 나핀(napin) 프로모터 및 애기장대의 종자에서 감마 토코페롤 메틸기 전이효소(γ-tocopherol methyl transferase:γ-TMT) 유전자 발현을 유도함으로써 비타민 E 생성을 증진시킨 연구에 사용된 당근 유래 DC-3 프로모터, 들깨 유래 올레오신(oleosin) 프로모터의 종자 특이발현 유도(국내특허출원 제10-2006-0000783호) 사례가 있다. 상기 종자 특이적 프로모터들은 주로 종자 자체가 식량이나 식품 또는 식품의 원료로 사용되는 주요 작물에서 유용 단백질 축적 및 유용 물질 생성 등을 목적으로 주로 사용되고 있다.

셋째로 뿌리 특이 발현 프로모터이다. 아직 상용화된 사례는 없으나 애기장대 퍼옥시다제(peroxidase, prxEa)가 분리되어 뿌리 특이적 발현을 확인하였고, 최근 고구마 유래의 매즈 유전자(ibMADS)와 당 유도성 에이디피 글루코즈 파이로포스 파타제(ADP-glucose pyrophosphatase, AGPase) 유전자가 분리되어 해당 프로모터 가 뿌리에서 특이 발현을 유도하며 당근, 무에서 뿌리 특이적 일시적 발현을 유도함을 확인하여 특허 등록(대한민국 등록번호 제10-0604186호, 제10-0604191호)된 바 있다. 이들 프로모터는 식량이나 식품, 또는 식품의 원료로 사용되는 주요 뿌리작물에서 농업적 형질 개량이나 유용 단백질 축적 및 유용 물질 생성 등을 목적으로 주로 사용이 기대될 수 있다.

넷째로, 잎 등의 기타 조직 특이 프로모터를 들 수 있다. 잎 등의 광합성 조직에서만 강력한 유전자의 발현을 유도하는 벼와 옥수수 유래의 알비씨에스(rbcS: ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit) 프로모터, 아그로박테리움 유래의 식물 뿌리 발현을 유도하는 RolD 프로모터, 감자 유래 괴경 특이 발현 유도 파타틴(patatin) 프로모터, 토마토 유래의 과실 성숙 특이 발현 유도 피디에스(PDS: phytoene synthase) 프로모터가 있다.

마지막으로 화분과 약에 특이적으로 발현하는 프로모터로 단백질 합성을 억제하는 유전자를 연결하여 inbred 라인을 만들거나 특정 목적을 위하여 웅성불임 등을 유도하기 위한 목적으로 화분 특이 프로모터가 개발되었고(미국 특허 제 8808034호 및 제6784289호), 꽃의 웅성기관 약의 융단조직 특이 BcA9 프로모터(특허 등록 제435143호)를 세포에 독성을 갖는 Bt 단백질 유전자의 발현을 유도케 함으로써 웅성불임 작물을 개발한 바 있다.

그 외에도 다양한 목적에 따른 다양한 식물 유래의 식물체 각 조직에 대하여 많은 수의 프로모터들이 보고되었고, 현재에도 계속 개발이 진행 중이지만, 상용화 되었거나 식물 연구자들 사이에 범용되는 프로모터의 종류는 이상에서 언급된 경우에 대부분 속하며, 개발자의 의도에 따라서 보다 정밀하게 유전자 발현의 장소를 조절할 수 있는 새로운 프로모터들이 앞으로도 계속 개발될 필요성이 있다.

한편, 자가 불화합성인 품종이나, 꽃이 작아 임성의 판별이 어려운 품종에 있어 교배에 의한 종자 생산이 어려운 품종 또는 일대잡종 종자에 의한 우량종자 생산을 위해 활용되고 있는 교배에 의한 웅성불임유도는 시간 및 노동력이 필요함으로 이의 개선을 위해 화분이 생성되는 시기부터 수분되기까지 화분에서 특이하게 발현하는 프로모터의 개발이 요구되고 있지만, 개발이 전무한 실정이다.

따라서, 본 발명의 목적은 다른 조직에는 영향을 미치지 않으면서 화분에서만 발현하여 웅성불임을 유도하는데 소요되는 시간과 노동력을 절감하고 일대잡종인 우량종자 생산을 가능하게 하는 화분 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 목적의 화분 특이 발현 프로모터를 증폭하기 위한 프라이머를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 목적의 화분 특이 발현 프로모터의 염기서열을 포함하는 발현벡터 pBGWFS7-PBrRF1 및 상기 발현벡터 pBGWFS7-PBrRF1으로 형질전환된 식물체를 제공하는 데 있다.

상기 목적들 뿐만 아니라 용이하게 표출될 수 있는 또 다른 목적들을 용이하게 달성하기 위하여 본 발명에서는 배추의 시스테인 프로테이나아제 유사단백질 유전자의 개시코돈 상위에 TATA box 등을 포함하는 약 2kb 영역(서열번호 1)을 분리하고, 애기장대로부터 분리한 게노믹 DNA로부터 박테리아가 박테리오파지에 감염될 때 박테리아측 특이적으로 가지고 있는 재조합 핵산서열 부위를 일부 포함하면서 PBrRF1를 특이적으로 증폭할 수 있도록 설계된 서열번호 2와 3의 프라이머 세트를 제작하여 유전자 증폭 반응(PCR : polymerase chain reaction)을 통해 약 2kb의 프로모터 부위를 다시 분리한 다음, 증폭된 PCR 산물들은 박테리아가 박테리오파지에 감염될 때 박테리아측 특이 재조합 핵산서열 부위 전체를 포함하는 어댑터 프라이머 B1인 "5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3'"와 B2인 "5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3'를 사용하여 각각 재 PCR하고, 2차로 PCR된 산물들을 박테리아가 박테리오파지에 감염될 때 박테리오파지 측 특이 재조합 핵산서열 부위를 포함하는 pDONR221 벡터와 BP 재조합반응시켜 pDONR-PBrRF1과 pDONR-P35S의 클로닝 벡터를 제작하고, Egfp 와 Gus 유전자가 연결된 형태의 리포터 시스템이 내재되어 있는 pBGWFS7 벡터와 다시 LR 재조합 반응시켜 pBGWFS7-PBrRF1 운반체를 제작한 후, 액체질소를 이용한 직접적인 아그로박테리아 형질전환 방법에 따라 아그로박테리아 튜메파시엔스 균주 GV3101 및 EHA105에 각각 형질전환 시킨 후, 이를 식물에 감염시켜 형질전환된 식물체를 얻음으로써 다른 조직에는 영향을 미치지 않으면서 화분에서만 발현하여 웅성불임을 유도하는데 소요되는 시간과 노동력을 절감하고 일대잡종인 우량종자 생산을 가능하게 하는 효과를 얻을 수 있었다.

본 발명은 다른 조직에는 영향을 미치지 않으면서 화분에서만 발현하여 웅성불임을 유도하는데 소요되는 시간과 노동력을 절감하고 일대잡종인 우량종자 생산을 가능하게 하는 효과를 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 신규 화분 특이 발현 프로모터 PBrRF1은 서열번호:1로 구성되는 것으로 특징지워진다.

본 발명의 화분 특이 발현 프로모터 PBrRF1은 상기 서열번호:1 뿐만 아니라 상기 서열번호:1의 일부 염기가 치환, 결실 또는 부가되더라도 화분 특이 발현 프로모터 활성을 나타내는 변형 염기서열도 포함된다.

상기 신규 화분 특이 발현 프로모터는 배추에서 분리된 것으로, 시스테인 프로테이나아제 유사단백질 유전자의 개시코돈 상위에 TATA box 등을 포함하는 약 2kb 영역으로 그 기능이 아직 명확하게 밝혀져 있지 않은 유전자의 프로모터이며, 하류 유전자의 일부 구조로부터 애기장대의 시스테인 프로테이나아제(cystein proteinase) 단백질 유전자와 유사한 기능을 갖는 것으로 추정된다.

상기 배추의 그 기능이 밝혀지지 않은 프로모터 영역은 유전자 코딩 부위의 상류 1,897bp에 해당하는 프로모터이다.

또한, 본 발명에 따른 프라이머는 상기 화분 특이 발현 프로모터를 증폭하기 위한 프라이머로서 서열번호:2로 구성되는 올리고누클레오티드 및 서열번호:3으로 구성되는 올리고누클레오티드로 이루어지는 것으로 특징지워진다.

상기 프라이머는 애기장대로부터 분리한 게노믹 DNA로부터 박테리아가 박테리오파지에 감염될 때 박테리아측 특이적으로 가지고 있는 재조합 핵산서열 부위를 일부 포함하면서 PBrRF1를 특이적으로 증폭할 수 있도록 설계된 각각 32bp로 이루어지는 순방향 프라이머와 역방향 프라이머로 구성된다. 상기 프라이머는 당업자에 게 공지된 올리고누클레오티드의 합성 방법에 의하여 제조될 수 있으며, 상업적으로 합성하여 사용할 수도 있다.

본 발명의 상기 프라이머는 프라이머를 구성하는 개별 염기서열의 일부에 변이가 일어난 변형서열을 포함할 수 있다. 상기 변형서열은 변이가 이루어진 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 결과와 미변형서열로 이루어진 프라이머(서열번호:2 및 서열번호:3)를 사용하여 PCR을 수행한 결과가 실질적으로 동일한 범위 내에서의 결실, 치환 또는 부가된 서열을 의미한다.

또한, 본 발명에서는 서열번호:1로 구성되는 프로모터 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현벡터 PBrRF1(이하, pBGWFS7-PBrRF1라 함)이 제공된다. 즉, 배추의 시스테인 프로테이나아제 유사단백질 유전자의 개시코돈 상위에 TATA box 등을 포함하는 약 2kb 영역(서열번호 1)을 분리하고, 애기장대로부터 분리한 게노믹 DNA로부터 박테리아가 박테리오파지에 감염될 때 박테리아측 특이적으로 가지고 있는 재조합 핵산서열 부위를 일부 포함하면서 PBrRF1를 특이적으로 증폭할 수 있도록 설계된 서열번호 2와 3의 프라이머 세트를 제작하여 유전자 증폭 반응(PCR : polymerase chain reaction)을 통해 약 2kb의 프로모터 부위를 다시 분리한 다음, 증폭된 PCR 산물들은 박테리아가 박테리오파지에 감염될 때 박테리아측 특이 재조합 핵산서열 부위 전체를 포함하는 어댑터 프라이머 B1인 "5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3'"와B2인 "5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3'를 사용하여 각각 재 PCR하고, 2차로 PCR된 산물들을 박테리아가 박테리오파지에 감염될 때 박테리오파지 측 특이 재조합 핵산서열 부위를 포함하는 pDONR221 벡터 와 BP 재조합반응시켜 pDONR-PBrRF1과 pDONR-P35S의 클로닝 벡터를 제작하고, Egfp 와 Gus 유전자가 연결된 형태의 리포터 시스템이 내재되어 있는 pBGWFS7 벡터와 다시 LR 재조합 반응시켜 pBGWFS7-PBrRF1 운반체를 제작한다.

상기 발현벡터 pBGWFS7-PBrRF1에는 본 발명의 서열번호:1로 구성되는 프로모터, 제초제 저항성 유전자인 Bar 및 리포터 유전자인 Egfp:gus가 포함될 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호:1의 프로모터 서열을 포함하는 발현벡터 pBGWFS7-PBrRF1로 형질전환된 것을 특징으로 하는 식물체를 제공한다.

상기 형질전환되는 식물세포로는 배추, 상추 등의 십자화과 작물 외에도 담배 등 다양한 쌍자엽 식물 등을 들 수 있다.

본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 이해될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 보호 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 한편, 하기 실시예들에서 특별히 언급되지 않은 일반적으로 사용된 DNA 실험방법들은 Sambrook 등의 “Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, second edition, 1989”를 참조하였다.

실시예 1

배추의 시스테인 프로테이나아제 유사단백질 유전자의 개시코돈 상위에 TATA box 등을 포함하는 약 2kb 영역(서열번호 1)을 분리한다.

별도로 애기장대 식물체의 잎 조직 소량을 에펜도르프 튜브에 넣고 Genomic DNA Purification Kit(I.J.BIO DNA System)을 이용하여 분리 정제한다. DNA 용출액 은 자외선 흡광도 분석기(UV spectrophotometer)를 이용하여 A₂₆₀/A₂₈₀를 측정하여 정량하였다. 애기장대로부터 분리한 게노믹 DNA로부터 박테리아가 박테리오파지에 감염될 때 박테리아측 특이적으로 가지고 있는 재조합 핵산서열 부위를 일부 포함하면서 PBrRF1를 특이적으로 증폭할 수 있도록 설계된 표 1의 서열번호 2와 3의 프라이머 세트를 제작하여 유전자 증폭 반응(PCR : polymerase chain reaction)을 통해 약 2kb의 프로모터 부위를 다시 분리하였다.

프라이머명	염기서열
RF1-B1	서열번호 2: 5'-AAAAAGCAGGCTAATTAACGAGCAGTACCTTT-3'
RF1-B2	서열번호 3: 5'-AGAAAGCTGGGTTGTCTTAGATTTTTGTTATA-3'

증폭된 PCR 산물들은 박테리아가 박테리오파지에 감염될 때 박테리아측 특이 재조합 핵산서열 부위 전체를 포함하는 어댑터 프라이머 B1인 "5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3'"와 B2인 "5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3'"를 사용하여 각각 재 PCR된다.

2차로 PCR된 산물들은 박테리아가 박테리오파지에 감염될 때 박테리오파지 측 특이 재조합 핵산서열 부위를 포함하는 pDONR221 벡터와 BP 재조합반응을 거쳐 pDONR-PBrRF1과 pDONR-P35S의 클로닝 벡터가 제작되었다. 서브 클로닝 된 두 종류의 이 운반체들은 최종 식물형질전환 운반체를 제작하기 위해 Egfp 와 Gus 유전자가 연결된 형태의 리포터 시스템이 내재되어 있는 pBGWFS7 벡터와 다시 LR 재조합 반응을 거쳐 도 1에 도시된 바와 같은 최종적인 pBGWFS7-PBrRF1 운반체(유전자 수탁 번호: KACC 95091P)를 완성시켰다. 도 1에 있어서, LB는 Left border(좌측면), Tnos는 nos 터미네이터, BAR은 제초제 저항성 유전자, Pnos는 nos 프로모터, PBrRF1은 배추 BrRF1 프로모터, P35S는 꽃양배추 바이러스 35S 프로모터, EGfp는 녹색형광단백질(green fluorescent protein) 유전자, GUS는 청색발색(β-glucuronidase) 유전자, T35S는 꽃양배추바이러스 35S 터미네이터, RB는 Right border(우측면)를 의미한다.

한편, 기본 운반체(binary vector)로 사용된 pBGWFS7는 벨기에의 겐트대학으로부터 구입한 것을 사용하였으며, 미생물 선발을 위한 스펙티노마이신(spectinomycin) 저항성 유전자를 가지며, 식물체 선발인자로 제초제 저항성 Bar유전자를 포함하고 있다. 제작된 형질전환용 운반체들은 액체질소를 이용한 직접적인 아그로박테리아 형질전환 방법(Holster 등의 freeze-thaw method, 1978)에 따라 아그로박테리아 튜메파시엔스튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 균주 GV3101 및 EHA105에 각각 형질전환하였다.

실시예 2

파종한 후 22℃ 배양기에서 약 4주간 생육(16시간 낮/8시간 밤)된 애기장대(Arabidopsis thaliana ecotype Columbia) 식물체의 일차 추대를 제거하여 최소한 3 ∼ 4개의 이차 추대를 유도한 후, 실시예 1에서 제작된 식물 형질전환 운반체가 보유된 아그로박테리아 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) GV3101 배양액을 5% 슈크로오즈(sucrose)와 2500ppm 트윈(tween) 20이 함유된 용액에 OD 0.8 정도로 희석한 현탁액을 꽃봉우리에 분사하여 아그로박테리아를 감염시킨다. 충분한 습도와 암 조건을 유지한 상태로 하룻밤 동안 배양한 후 22℃ 배양기에서 4 ∼ 5일간 배양(16시간 낮/8시간 밤)한 후, 상기와 동일한 방법으로 배양희석한 아그로박테리아를 재차 화기조직에 분사하고 충분한 습도와 암 조건을 유지한 상태로 하룻밤 동안 배양한 다음, 22℃ 배양기에서 꼬투리 조직(silique)이 갈색으로 완전히 성숙할 때까지 약 3 ∼ 5주간 생육(16시간 낮/8시간 밤)시킨 후 채종하였다. 채종된 종자를 다시 파종하여 생육 10일째 일차, 17일째 이차로 0.3% 바스타를 살포함으로써 T1세대의 형질전환체를 선발하였다. T1 형질전환 식물체를 22℃ 배양기에서 꼬투리 조직(silique)이 갈색으로 완전히 성숙될 때까지 약 2달간 생육(16시간 낮/8시간 밤)시킨 후 T2 종자를 채종하였다.

실시예 3

pBGWFS7-PBrRF1를 담배에서 발현하고자 상기 실시예 1에서 제조한 아그로박테리아 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) EHA105를 담배 잎에 형질전환하였다.

소독한 담배 종자를 파종하여 2주 이상 무균 배양한 신선하고 어린 담배잎을 채취하였다. 흡광도 0.4로 정량된 아그로박테리아 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) EHA105를 상기 담배 자엽에 30분간 감염 후, MS 배지에 이틀간 암조건에서 공동 배양하였다. 이틀 후, MS-비타민 포함 배지(Duchefa)에 3.0% 슈크로오즈, 1mg/ℓ BA(benzyladenine), 0.1mg/ℓ NAA(napthalene acidic acid), 0.3% 파이타젤, 4mg/ℓ 피피티(phosphinothricin) 및 500mg/ℓ 카르베니실린을 첨가한 선발 배지(pH 5.8)에서 재분화를 유도하였다. 14일 간격으로 캘러스와 잎 조직을 계대하였다. 4주 후에 재분화된 줄기는 MS 배지에서 뿌리를 유도하였고 순화 과정을 거친 후 온실에서 재배하였다. 형질전환체를 판별하기 위해서 유모에 4일 간격으로 바스타 0.5%를 두번 처리 후 저항성을 갖는 형질전환체를 선발하였다.

실시예 4 : 형질전환 애기장대 및 담배의 GUS 청색발색 반응 및 GFP 형광분석

PBrRF1 및 P35S 형질전환 애기장대 T2 종자를 파종하여 생육 10일째 1차, 17일째 2차로 0.3% 바스타를 살포하여 선발된 형질전환 애기장대 식물체와 실시예 3에서 선발된 담배의 잎, 줄기, 뿌리, 꽃 및 꼬투리 등 여러 조직을 생육 단계별로 관찰하였다. 대조구로 비형질전환 애기장대 식물체는 바스타를 처리하지 않고 발아시켰다. 파종 후 7일, 21일, 42일의 형질전환 애기장대 식물체와 담배를 GUS-assay buffer[Sol. I: X-gluc(cyslohexyl ammonium salt) 20mM, Sol. II : NaH₂PO₄ H₂O 100mM, NaEDTA 10mM, Triton-X-100 0.1%, pH7.5]에 침지하고 37℃에서 24시간 처리 후, 70% 에탄올을 처리하여 클로로필(chlorophyll)을 제거하였다. 식물체는 광현미경(light microscope)를 이용하거나 육안으로 관찰하고, 사진을 촬영하여 도 2 내지 도 4에 도시하였다.

도 2 및 도 3a,3b,3c,3d로부터 알 수 있는 바와 같이 PBrRF1 애기장대 형질전환체는 유묘단계에서는 GUS 발현이 전혀 관찰되지 않았고 21일 및 42일째의 식물체의 꽃 기관에서만 GUS 청색발색이 관찰된 반면, 비형질전환 애기장대에서는 GUS 청색발색이 전혀 보이지 않았다. 꽃의 발달 단계별로 GUS 청색발색을 관찰한 결과, 1mm이하의 꽃봉오리 단계에서는 거의 발색되지 않거나 아주 미약한 발색을 관찰하였고 개화직전 꽃에서 약 조직에서 GUS 발현이 관찰되었다. 개화 후에는 약의 융단조직과 화분에서 강한 발현을 보이며 수분과정을 거친 암술조직에서도 강한 발색을 보였다. 또한, 개화 직전 및 개화 후의 약의 융단 조직으로부터 화분에 강한 발색을 관찰할 수 있어 PBrRF1는 화분 특이적 발현 프로모터임을 확인할 수 있었다.

또한, 도 4a,4b,4c로부터 알 수 있는 바와 같이 PBrRF1 담배 형질전환체는 잎, 줄기, 뿌리에서는 GUS 발색이 전혀 관찰되지 않았으며 꽃의 발달 단계별로 GUS 청색발색을 관찰한 결과, 3cm 이하의 꽃봉오리 단계에서는 GUS 발색을 관찰할 수 없었고 개화 후의 약 조직에서만 강한 발색을 보였다. 또한 대조구인 비형질전환 담배의 꽃 봉오리 및 개화된 꽃에서는 GUS 발색을 관찰할 수 없는 반면, 개화 후의 약 융단 조직에서는 강한 GUS 청색 발색을 관찰할 수 있었고 또한 형질전환 담배의 화분에서 강한 GFP 형광을 관찰할 수 있어 PBrRF1는 화분 특이적 발현 프로모터임을 확인할 수 있었다.

실시예 5 : 형질전환 식물체의 RT-PCR 반응

PBrRF1 형질전환 담배 식물체의 잎, 줄기, 뿌리, 꽃 등 여러 조직으로부터 실시예 1과 동일한 방법으로 추출한 전체 RNA 약 10㎍ 주형으로 50uM oligo dT 프라이머를 이용해 50℃에서 50분, 85℃에서 5분 처리 후 얼음에서 식힌 다음, 여기에 다시 RNase H를 1㎕ 첨가하고 37℃에서 20분간 처리하여 cDNA를 합성(10X RT buffer, 25mM MgCl_2,0.1M DTT, RNase OUT, SuperScript_TMRT)하고, 합성된 cDNA를 주형으로 청색발색 유전자 GUS 특이 프라이머 세트, 즉 "5'-ACCTGCGTCAATGTAATGTTCTGC-3'" 염기서열의 GUS-F 프라이머와 "5'-CTCCCTGCTGCGGTTTTTCA-3'" 염기서열의 GUS-R 프라이머 세트와 사용된 RNA의 상대적인 양이 균일함을 증명하기 위하여 담배 액틴 유전자(actin) 프라이머 세트인 "5'-CTATTCTCCGCTTTGGACTTGGCA-3'"의 Nt-Act2A 프라이머와 "5'-AGGACCTCAGGACAACGGAAACG-3'"의 Nt-Act2B 프라이머를 이용하여 95℃에서 7분간 변성 후, 95℃에서 30초간 반응시키고, 60℃에서 30초간 어닐링반응, 72℃에서 21초간의 중합반응을 행하는 일련의 반응을 40회 실시한 후, 72℃에서 7분간의 PCR 조건으로 각각의 PCR을 수행하였다.

증폭된 유전자 밴드를 전기영동 사진 촬영하여 도 5에 도시하였다. 도 5에 있어서, M은 1kb Plus DNA Ladder 마커, GUS는 청색발색(β-glucuronidase) 유전자, Actin은 담배 액틴 유전자를 나타내고, 1은 비형질전환 담배의 꽃봉오리 Ⅰ단계(1mm이하), 2는 비형질전환 담배의 꽃봉오리 Ⅱ단계(약1 ∼ 1.5mm), 3은 비형질전환 담배의 꽃봉오리 Ⅲ단계(약1.5mm), 4는 비형질전환 담배의 개화 꽃(open flower), 5는 비형질전환 담배의 잎, 6은 비형질전환 담배의 줄기, 7은 비형질전환 담배의 뿌리, 8은 PBrRF1로 형질전환된 담배의 꽃봉오리 Ⅰ단계(1mm이하), 9는 PBrRF1로 형질전환된 담배의 꽃봉오리 Ⅱ단계(약1 ∼ 1.5mm), 10은 PBrRF1로 형질전환된 담배의 꽃봉오리 Ⅲ단계(약1.5mm), 11은 PBrRF1로 형질전환된 담배의 개화 꽃(open flower), 12는 PBrRF1로 형질전환된 담배의 잎, 13은 PBrRF1로 형질전환된 담배의 줄기, 14는 PBrRF1로 형질전환된 담배의 뿌리의 증폭된 유전자 밴드 전기영동 사진이다.

도 5로부터 알 수 있는 바와 같이 역전사 PCR 반응의 결과, PBrRF1 형질전환 담배의 잎, 줄기, 뿌리 조직에서는 청색발색 단백질 유전자 GUS의 전사체가 검출되지 않는 반면, 꽃 조직에서는 GUS의 전사체가 뚜렷이 검출되었다. 이 때 담배 액틴 유전자를 이용하여 사용된 RNA의 상대적인 양이 균일함이 증명되었다.

도 1는 플라스미드 pBGWFS7-PBrRF1와 pBGWFS7-P35S의 유전자지도의 모식도이고,

도 2는 pBGWFS7-PBrRF1와 pBGWFS7-P35S로 형질전환된 애기장대의 기관 및 식물체 발달 과정 중의 청색발색 반응을 관찰한 사진이며,

도 3a,3b,3c,3d는 pBGWFS7-PBrRF1로 형질전환된 애기장대의 꽃 발달 과정 중 조직별 청색발색 반응을 관찰한 사진이고,

도 4a,4b,4c는 pBGWFS7-PBrRF1로 형질전환된 담배의 각 조직 및 꽃 발달과정중 웅성기관에서의 청색발색 및 화분의 GFP 형광 반응을 관찰한 사진이며,

도 5는 pBGWFS7-PBrRF1로 형질전환된 담배의 각 조직에서 추출한 전체 RNA를 이용하여 역전사 반응 후 청색발색 단백질 유전자 GUS와 양성 대조구로 담배 내재유전자인 actin 유전자를 각각 특이적으로 증폭하는 프라이머로 증폭된 유전자 밴드를 보여주는 전기영동 사진이다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT: RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> An anti-Phytophthora gene cluster specifically inhibiting the growth of Phytophthora spp., and the transformation strain containing thereof and the prevention method of Phytophthora using thereof <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2012 <212> DNA <213> Brassica rapa ssp.pekinensis <400> 1 aattaacgag cagtaccttt aattccctaa aatccgaaac cccaaacccc aaaacccata 60 ttccttatct tctacttcat atattccaaa ccccatcttt attttcattc caaaccacaa 120 ttcccacatt tacttattta taaaacaaac tcccacaatt tcttattcat aaaacaaact 180 cccacattac cttattcata aaacaaactc tcacattacc ttattcataa aacaaactac 240 acaaaatcaa atacatcaat cggatacatc gacattctcg tcatcactag aaatatcatc 300 attttcatta aactcgtctt ctacagcttc gtctgtggca tcatcggtaa gatcttcgta 360 ttcgtgatta tgcggatcaa tgagaaggat gtcatcaact tcttgttcag gttcctcgac 420 ttcatttatc tgttcttctt gcaatggtgg ttcttctcca ctgatgattc gtcctcgagg 480 tgtaactttg atcactgcta accaatttat acccgaatct ctcatccgag ggtatggaag 540 gaagctaact tggtctgctt gtgaagctaa gatgaaaggc tcgaatttgt tgtaccgacg 600 tccaccgttg acatcaacta caccaaattt gttagaccga acacctctgt tgacgacggg 660 gtcgaaccat tcacatttga agatgacgca tttcagcttc agtatccctg gaaattcgac 720 ttcaataatc tccgtcaaga tcccgtagaa atctgtttcc cctttcacac atattccata 780 gttactggtc gcccgctgtc taccatactc atatgtgtga aaagtgtagc ctcgtgtgaa 840 atacatctgt gatgtggtga cctttacaag tggagattga attacttcgt gtaaccactt 900 aggataatct gcatcgtcgt cataatcaac ctgcaaaaat aaagagaaca ttaaaataca 960 aatcatgtat gaaaaaatac gaatgacttg cttctaatac gaatgaagtt actcaagctt 1020 caatagtcac agacttacct aagaatggta gtattattaa tgtattagta accaatggca 1080 gtgcacatat ataagtaact tttgaaaata ttttgcttat ttggtaaaac aagattatat 1140 gaaatgaggt ttacataata gagatcttaa gagctaagac ttaggaacga agagttcctc 1200 gttctacttt ccggggttga aattatcaat atatgagttt gtagggtgca agcaacaaat 1260 aaaataattg agaacggaat attccattgg ctggtgtaac ctacaattaa taataaaacc 1320 atcatcgact tcaaaattgt attttttttt tatattttat gttgatacaa aatgtgtgta 1380 ctttataatt tccaaagtgc gtgtaacaca tatgacatat gggtcattgg ggttaggctg 1440 gtagtggtac ctacagagaa cggttagaag agtctgtaat aaactactct gtgaaaggtt 1500 caaattaggt tttccaaaac taagaaacac cctgtaaata ttaaagctgg agaagtttgg 1560 ttatgaaaac aaaccatgtg ttaaggtttg atatataaaa tctagcatct tgatgtaaaa 1620 atgaaacaag taaactatca gaagaagtaa tttatctaag ttttaattcg atataagcta 1680 cagtttaaac aataggtgac tttacacaaa gtaagcaaga aaagaaggct aaccccattg 1740 attctaatta tgaattacca attctctcta atcttaacat aatatagtat tgtattgata 1800 aaacgaaatt tcctgaaacc atgtgatgtg tgacattttt tcttctcttt tccagattaa 1860 actatattat agtattataa aaataatgac acgtcagagc caatacggag aacacatcta 1920 tccctctcga agacaaaact ttacttctct ataaatactt tcaccgcaac agttgcacaa 1980 atctcattga aatataacaa aaatctaaga ca 2012 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Brassica rapa ssp.pekinensis <400> 2 aaaaagcagg ctaattaacg agcagtacct tt 32 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Brassica rapa ssp.pekinensis <400> 3 agaaagctgg gttgtcttag atttttgtta ta 32

Claims

서열번호:1로 구성되는 것을 특징으로 하는 화분 특이적 발현 프로모터 PBrRF1.
서열번호:2로 구성되는 올리고누클레오티드 및 서열번호:3으로 구성되는 올리고누클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 서열번호:1로 구성되는 화분 특이적 발현 프로모터 PBrRF1 증폭용 프라이머.
서열번호:1의 프로모터 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현벡터 pBGWFS7-PBrRF1.
청구항 3에 있어서, 발현벡터 pBGWFS7-PBrRF1는 배추로 부터 서열번호 1의 프로모터 부위를 분리하고, 애기장대로부터 분리한 게노믹 DNA로부터 박테리아가 박테리오파지에 감염될 때 박테리아측 특이적으로 가지고 있는 재조합 핵산서열 부위를 일부 포함하면서 PBrRF1를 특이적으로 증폭할 수 있도록 설계된 서열번호 2와 3의 프라이머 세트를 제작하여 유전자 증폭 반응을 통해 프로모터 부위를 다시 분 리한 다음, 증폭된 PCR 산물들을 박테리아가 박테리오파지에 감염될 때 박테리아측 특이 재조합 핵산서열 부위 전체를 포함하는 어댑터 프라이머 B1인 "5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3'"와B2인 "5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3'를 사용하여 각각 재 PCR하고, 2차로 PCR된 산물들을 박테리아가 박테리오파지에 감염될 때 박테리오파지 측 특이 재조합 핵산서열 부위를 포함하는 pDONR221 벡터와 BP 재조합반응시켜 pDONR-PBrRF1과 pDONR-P35S의 클로닝 벡터를 제작하고, Egfp 와 Gus 유전자가 연결된 형태의 리포터 시스템이 내재되어 있는 pBGWFS7 벡터와 다시 LR 재조합 반응시켜 제작한 것임을 특징으로 하는 발현벡터 pBGWFS7-PBrRF1.
서열번호:1의 프로모터 서열을 포함하는 발현벡터 pBGWFS7-PBrRF1로 형질전환된 것을 특징으로 하는 식물체.