CN102154363A

CN102154363A - 包含水稻胚乳特异性启动子的重组载体及其应用和植株

Info

Publication number: CN102154363A
Application number: CN 201010606233
Authority: CN
Inventors: 潘建伟; 叶晓帆; 王超; 潘伟槐
Original assignee: Zhejiang Normal University CJNU
Current assignee: Zhejiang Normal University CJNU
Priority date: 2010-12-27
Filing date: 2010-12-27
Publication date: 2011-08-17

Abstract

本发明公开了包含水稻胚乳特异性启动子OsGt1、OsGluB与OsYUCCA1-8基因的重组载体。还公开了所述的重组载体在转基因水稻中的应用。还公开了含有所述各个载体的水稻转基因植株。YUCCA基因是生长素合成生物途径中的限速步骤，该基因过表达后，植株体内IAA含量显著上升。本发明采用胚乳特异性启动子OsGt1和OsGluB来表达YUCCA基因，改良水稻籽粒中内源生长素IAA的生物合成效率，提高水稻光合作用的效率，从而提高水稻的产量或品质，有效地减少环境污染。因此，本发明将在作物产量、环境保护等绿色农业生产中具有重要应用价值。

Description

包含水稻胚乳特异性启动子的重组载体及其应用和植株

技术领域

本发明涉及转基因水稻技术领域，尤其涉及一种包含水稻胚乳特异性启动子的重组载体及其应用和植株。

背景技术

生长素是一类小分子化合物，在植物体内种类很多，如吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)，苯乙酸、吲哚丁酸、4-氯吲哚乙酸，但最主要的形式是吲哚乙酸IAA。生长素在植物生长和发育过程中起着极其重要的作用，几乎参与调控所有的发育过程，包括根系的发育、侧根与不定根的启动与形成、茎和叶的发育、叶原基和花原基的形成、花器官的发育、维管束组织的形成和分化、果实的生长与成熟、植株的顶端优势、器官衰老、离区的形成等。同时，生长素还参与调控植物的向性生长如向光性和向地性、逆境胁迫反应(如干旱、盐渍、低温和酸铝等)、病原体浸染反应等。

在最近10年中，人们利用模式植物拟南芥，对植物生长素生物合成途径的研究已经取得了一些可喜的成果。植物生长素IAA的生物合成途径已较为清楚，有色氨酸和非色氨酸两条途径，其中在植物体内以色氨酸途径为主，其生物合成前体为色氨酸，这条途径的下游又可分为4条支路：吲哚丙酮酸(indole-3-pyruvicacid，IPA)途径、色胺(tryptamine，TAM)途径、吲哚乙醛肟(indole-3-acetaldoxime，IAOx)途径及吲哚乙酰胺(indole-3-acetamide，IAM)途径(Woodward and Bartel，Ann Bot.95：707-735.2005)。控制合成吲哚乙酸的一些关键酶基因已经被克隆和鉴定，其中研究得最清楚是黄素单氧化物酶基因1(flavin monooxygenase-like enzyme1)。YUCCA1基因是在分离高IAA水平的突变体中被分离鉴定，该基因编码一个黄素类似单加氧酶，此酶能催化色胺形成N-羟基色胺，进一步催化形成IAA的中间产物IAOx，这是色胺途径中的限速步骤(Zhao et al.，science.291：306-309，2001)。在拟南芥基因组中，YUCCA基因家族共有11个成员(AtYUCCA1-11)，大部分成员的基因表达特性及其生物学功能已被鉴定(Cheng Y et al.，Genes Dev.20：1790-1799，2006；Plant Cell.19：2430-2439，2007)。有研究表明在拟南芥中2个或多个YUCCA基因同时失活时表现出明显的生长缺陷从而影响花器官的发育、叶片的发育、维管组织的形成以及胚胎发育。在水稻基因组中，有14个YUCCA基因，分别命名为OsYUCCA1-14(Fujino et al.，Mol Genet Genomic.279：449-507，2008)。在水稻中高表达OsYUCCA1表现为生长素水平增高和产生生长素过表达株系的表型，而沉默OsYUCCA1时所产生的表型与水稻生长素不敏感突变体的表型相似(Yamamoto Y et al.，Plant Physiol.143：1362-1371.2007)。这些结果都表明YUCCA基因对调控植物体内的IAA水平具有重要的意义。

目前有研究表明，植物激素参与调控作物生长发育的每个过程，作物的株高、分蘖、光合生产力和衰老均与作物的产量有密切的关系。在这些植物激素中，生长素吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，IAA；植物体内最主要的生长素形式)的生物合成途径相对较为清楚。人们对植物激素的化学特性与生理功能已经进行了广泛深入的研究，在作物特定生长期内，合理使用植物生长调节剂可使农作物明显增产。目前，人工合成了各类植物生长调节剂达100多个品种(如萘乙酸、2，4-D、防落素、青鲜素、6-苄基氨基嘌呤、乙烯利、增苷膦、比久、噻唑隆、助长素(Pix)、矮壮素、多效唑、烯效唑、增甜剂、复硝盐、芸苔素内酯、石油助长剂、抑芽敏、吲熟酯、水杨酸、三碘苯甲酸、调节安、异戊氨基嘌呤和疏果安等)，已被广泛应用到农业、林业和工业生产中，大大提高了粮食产量和人们的生活水平。

有研究表明，生长素IAA与水稻光合产物分配过程密切相关，是光合产物分配过程中许多限速和限量因子的调节剂，水稻源(叶片)和库(穗子)组织中都含有一定浓度的IAA，特别是发育中的籽粒，其IAA含量要比其它组织高得多。籽粒中的IAA含量动态变化与籽粒灌浆速率表现基本一致。在水稻灌浆期间，用外源IAA处理叶片能明显促进叶片的光合作用能力及其光合产物分配，提高种子的结实率(杨建昌等，江苏农学院学报.16：27-31.1995)；而外源IAA处理籽粒，可促进籽粒获取同化物的能力，增加粒重(段俊等，植物学报.41：75-77.1999)。外源IAA对水稻幼穗的处理能缩小强、弱势粒间结实的差异，使整穗的结实率都有所提高(陶龙兴等，中国水稻科学.17：149-155.2003)。这些结果表明，作物籽粒中IAA含量的上升有利于提高作物产量，对于农业生产具有十分积极的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种包含水稻胚乳特异性启动子OsGt1、OsGluB与OsYUCCA1-8基因的重组载体及其应用，和水稻转基因植株。

技术方案如下：

包含水稻胚乳特异性启动子OsGt1、OsGluB与OsYUCCA1-8基因的重组载体。

所述的重组载体在转基因水稻中的应用。

含有所述各个载体的水稻转基因植株。

YUCCA基因是生长素合成生物途径中的限速步骤，该基因过表达后，植株体内IAA含量显著上升。由于水稻转基因通过组培培养分化形成植株，组成型过表达YUCCA会造成高浓度IAA使植株再生困难，某些器官的分化异常。本发明采用胚乳特异性启动子OsGt1和OsGluB来表达YUCCA基因，改良水稻籽粒中内源生长素IAA的生物合成效率，提高水稻光合作用的效率，从而提高水稻的产量或品质，有效地减少环境污染。因此，本发明将在作物产量、环境保护等绿色农业生产中具有重要应用价值。

附图说明

图1技术路线图。

图2.pCambia-OsGt1/GluB::OsYUCCA1-8:GUS载体构建示意图。

图3.A.1，2均为GUSPCR片段，大约为1.8kb左右；B.pCambia2300-2×35S::GUS酶切鉴定，U为未酶切质粒(对照)，D为酶切质粒，都有1.8kb左右的条带切下，证明GUS连接到载体上。

图4.A.OsYUCCA2基因RT-PCR片段，1.2kb；B.pCambia2300-2×35S::OsYUCCA2:GUS酶切鉴定，U为未酶切质粒(对照)，D为酶切质粒，在1.2kb处都有酶切片段，证明OsYUCCA2片段连接到pCambia2300-2×35S::GUS载体上。

图5.A.1为OsGluB PCR产物片段，条带大小约为1.4kb；2为载体pCambia2300-2×35S::OsYUCCA:GUS双酶切2×35S后得到的图，2×35S条带大小为750bp左右；3为未酶切的载体pCambia2300-2×35S::OsYUCCA2:GUS(即)对照；B.pCambia2300-OsGluB::OsYUCCA2:GUS酶切结果：D为酶切后质粒，在1.4kb处有条带，证明OsGluB连接到pCambia2300-2×35S::OsYUCCA2:GUS上，un为对照。

图6农杆菌介导的水稻转基因流程：A.日本晴成熟胚在诱导培养基上诱导愈伤10天；B.继代后的愈伤；C.经农杆菌共培养后，抗性愈伤的筛选；D.抗性愈伤的分化；E.转基因幼苗生根；F.炼苗。

图7.pCambia2300-GluB::OsYUCCA2:GUS转基因植株不同株系间的GUS染色以及RT-PCR结果。

图8.pCambia2300-GluB::OsYUCCA2:GUS转基因植株不同株系与对照的结实率情况。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

水稻谷蛋白启动子GluB1(Wu et al.，Plant J.23(3)：415-421.2000)和Gt1(张宪银等.作物学报.28(1)：110-114.2002)都在胚乳中特异性表达，从水稻日本晴DNA中克隆得到胚乳特异性启动子OsGluB1和OsGt1。利用RT-PCR分别克隆了OsYUCCA1-8cDNA，然后在其C端与GUS(编码β-葡萄糖苷酸酶，能与X-Gluc发生反应生成蓝色产物，肉眼可见，便于实验操作)融合，构成OsYUCCA1-8:GUS，然后分别与OsGluB1和OsGt1融合，即为水稻胚乳特异性表达载体：

OsGluB1::OsYUCCA1:GUS，OsGt1::OsYUCCA1:GUS，

OsGluB1::OsYUCCA2:GUS，OsGt1::OsYUCCA2:GUS，

OsGluB1::OsYUCCA3:GUS，OsGt1::OsYUCCA3:GUS，

OsGluB1::OsYUCCA4:GUS，OsGt1::OsYUCCA4:GUS，

OsGluB1::OsYUCCA5:GUS，OsGt1::OsYUCCA5:GUS，

OsGluB1::OsYUCCA6:GUS，OsGt1::OsYUCCA6:GUS，

OsGluB1::OsYUCCA7:GUS，OsGt1::OsYUCCA7:GUS，

OsGluB1::OsYUCCA8:GUS，OsGt1::OsYUCCA8:GUS，

OsYUCCA1-8 ID number(RAP-DB)：

OsYUCCA1，Os01g0645400；OsYUCCA2，Os05g0528600；OsYUCCA3，Os01g0732700；OsYUCCA4，Os01g0224700；OsYUCCA5，Os12g0512000；OsYUCCA6，Os07g0437000；OsYUCCA7，Os01g0732700；OsYUCCA8，Os03g0162000；

本发明利用农杆菌介导的转化方法已分别获得了上述16个载体的转基因苗。本发明所采用的技术路线如图1所示。

(1)在水稻灌浆期对日本晴幼穗喷施不同浓度的外源生长IAA，统计结果显示适量的外源生长素处理能提高水稻的结实率。结果如表1所示。

表1.不同浓度外源IAA处理抽穗后两天的穗子各30个，统计结实和百粒重

外源生长素IAA浓度	结实率	百粒重
			0uM	25.30％	2.26
100uM	44.70％	2.26
			200uM	32.10％	2.23
300uM	22.00％	2.12

(2)克隆水稻YUCCA1-8、OsGluB和OsGt1，分别构建YUCCA1-8胚乳特异性表达载体。下面以构建pCambia2300-OsGluB::OsYUCCA2:GUS为例说明水稻胚乳特异性表达载体。技术路线如图2所示。

①用GUS-PBI121-BamHI-F+GUS-PBI121-KpnI-R引物从PBI121载体扩增GUS。

②双酶切(PstI和BamHI)将GUS插入到pCambia2300载体(含有2×35S)上，构成pCambia2300-2×35S::GUS载体，如图3所示。

③用OsYUCCA2-KpnI-F+OsYUCCA2-BamHI-R引物，以cDNA为模板扩增全长OsYUCCA2。

④双酶切(BamHI和KpnI)将OsYUCCA2插入到pCambia2300-2×35S::GUS载体的BamHI和KpnI两个酶切位点之间，产生pCambia2300-2×35S::OsYUCCA2:GUS。如图4所示。

⑤用OsGluB-HindIII-F+OsGluB-KpnI-R引物，以水稻日本晴DNA为模板PCR扩增OsGluB启动子。

⑥双酶切(KpnI和HindIII)将OsGluB启动子替代pCambia2300载体上的2×35S，产生pCambia2300-OsGluB::OsYUCCA2:GUS载体。如图5所示。

⑦将构建好的表达载体进行测序验证，用于后续水稻转基因研究。

(3)农杆菌介导的水稻转基因研究：将成熟日本晴种子消毒后接种于NB培养基上诱导愈伤，培养15d后去除胚乳和芽，将愈伤组织继代培养10d；取胚性愈伤与含有YUCCA载体的农杆菌EHA105共培养3d，3d后洗脱农杆菌；将侵染后的胚性愈伤置于抗性筛选培养基上，筛选抗性愈伤30d左右；挑取抗性愈伤置于分化培养基上，分化成苗；分化出的无根苗在生根培养基上生根；待苗生根健壮后打开盖子，炼苗7d后种于大田或水培。如图6所示。

(4)转基因植株的鉴定(GUS染色)：由于载体中YUCCA基因与GUS基因融合，水稻转基因阳性克隆鉴定只需采集水稻的幼嫩时期的种子做GUS染色即可，而且种子GUS染色的强弱能间接反应OsYUCCA基因的表达强弱。如图7所示(以2300-GluB::OsYUCCA2:GUS转基因株系为例，分别从OsYUCCA2和GUS基因中设计5’引物和3’引物用于RT-PCR扩增，鉴定OsYUCCA2与GUS融合基因的表达，排除内源水稻YUCCA的干扰)。

(5)转基因植株农艺性状的统计：对阳性转基因植株的结实率、千粒重做统计。实验证明转胚乳特异性表达YUCCA的外源基因的各株系在逆境胁迫下均能提高转基因植株的结实率和千粒重(至少提高2-3％)。以pCambia2300-OsGluB::OsYUCCA2:GUS为例，转基因植株的结实率明显比对照高。如图8所示。

目前，通过喷施外源生长素(植物生长调节剂)来提高作物的产量或品质已得到了广泛的应用。植物生长调节剂主要以药液喷洒和分粉剂喷洒为主，散落在农田、土壤、水或漂浮于大气中与尘埃吸附形成气溶胶，对我国农田、饮用水源和渔业水源等造成了大面积的污染。而且大部分人工合成的植物生长调节剂属于低毒或微毒农药(潘瑞炽，生物学通报.37：4-7.2002)，长期食用受植物生长调节剂污染的食物对人体健康有较大的影响。所以本发明通过特异性地提高水稻籽粒的内源生长素IAA的含量，促进种子发育，提高结实率和千粒重，从而提高水稻产量或品质。

生长素在植物生长和发育过程中起到极其重要的作用，几乎参与调控所有的发育过程，例如根系的发育、茎和叶的发育、叶原基和花原基的形成、花器官的发育、维管束组织的形成和分化、果实的生长与成熟、植株的顶端优势、植物的向性生长和调控逆境胁迫反应(如干旱、盐渍、低温和酸铝等)等。有研究表明，生长素IAA与水稻光合作用产物分配过程密切相关，是水稻光合产物分配过程中的许多限速和限量因子的调节剂，水稻源(叶片)和库(穗子)组织中都含有一定浓度的IAA，特别是发育中的籽粒，其IAA含量要比其它组织高得多。在水稻灌浆期喷施人工合成调节剂能提高水稻的结实率和增加千粒重，能缩小水稻强弱势之间的结实差异，提高整株的结实率。人工合成植物生长调节剂在喷施过程中容易造成水体、土壤、大气等的污染，而且存在一定量的药剂残留问题会对人体健康造成影响。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.包含水稻胚乳特异性启动子OsGt1、OsGluB与OsYUCCA1-8基因的重组载体。

2.根据权利要求1所述的重组载体在转基因水稻中的应用。

3.含有权利要求1所述任一载体的水稻转基因植株。