CN101948867A - 一种农杆菌介导的小油桐基因转化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种农杆菌介导的小油桐基因转化方法。以小油桐成熟种子的子叶切除其基部的1/3～1/4后的材料作为农杆菌感染的受体，转化受体与农杆菌共培养后先接种在无筛选剂的培养基上进行愈伤诱导培养4周后，再继代到选择培养基上筛选抗性芽，以硫酸卡那霉素作为筛选剂，通过筛选获得抗性芽，继代培养获得抗性植株，经分子检测，获得转基因小油桐植株。本发明与现有的小油桐转化方法相比，可获得较高的再生芽诱导率，简化了转化程序，缩短了转化周期，转化效率大大提高，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及小油桐转基因技术，具体涉及一种通过农杆菌介导基因转化技术获得小油桐转基因植株的方法方法。
背景技术
小油桐(Jatropha curcas L.)又名小桐子、麻疯树、膏桐等，属大戟科(Euphorbiaceae)麻风树属(Jatropha)多年生灌木或小乔木，广泛分布于热带和亚热带地区，是一种多用途的树种，在生物柴油、医药开发、生物农药和肥料等方面具有良好地应用前景。其种子含油率一般在30～40％，是目前国际上公认的最具发展潜力的能源植物之一。但小油桐目前在世界各地种植的产量普遍太低，无法满足生物柴油产业发展对原料的大量需求。由于木本植物的世代周期较长，采用常规的育种技术难以在较短的时间内选育出高产的新品种，因此，利用转基因技术提高小油桐的产量就具有重要的现实意义。
近几年来，国内外对小油桐的遗传转化进行了初步的研究，虽然已可以通过小油桐多种外植体，如真叶、叶柄、子叶、下胚轴和节等获得小油桐的再生植株，但这些再生体系仍未能转变为高效的转化方法。Li等(2008，Plant CellTissue and Organ Culture，92：173-181)以子叶作为外植体通过农杆菌介导的转化方法，用除草剂草铵膦作为筛选试剂首次获得了转基因小油桐，但转化效率不高。He等(2009，Silvae Genetica，58：123-128)和Mazumdar等(2010，South African Journal of Botany，76：337-344)尝试用硫酸卡那霉素和潮霉素(Trivedi et al.，2009，International Journal of Agriculture Sciences1：11-20)作为筛选试剂，但只获得了抗性的愈伤，无再生的转基因植株。最近，Purkayastha等(2010，Biologia Plantarum，54：13-20)用基因枪的方法也获得了再生的转基因植株。但基因枪轰击存在一些问题，如外源基因往往是多拷贝随机整合到受体基因组中，可能发生多种方式的重排，易造成转录或转录后水平的基因沉默，产生嵌合体等。农杆菌介导的转化方法是外源基因自然转移过程，外源基因能有效地整合到植物细胞染色体上，且大多数是单一位点整合，遗传稳定性较好。探索一种既能利用农杆菌介导的基因转化方法的优点又能提高小油桐转化效率的方法，对小油桐的转基因研究将起到很大的促进作用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有小油桐转基因技术的不足，提供一种以小油桐成熟种子的子叶为转化受体、通过农杆菌介导的转化方法获得小油桐转基因植株的方法。该方法采用含有pCAMBIA 2301质粒的农杆菌转化小油桐子叶，获得转基因植株，为生产上转化其他目的基因、获得转基因的小油桐优良株系提供有效的方法。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现。
除非另有说明，本发明所采用的百分数均为重量百分数。
一种农杆菌介导的小油桐基因转化方法，其特征在于：以小油桐成熟种子的子叶切除其基部的1/3～1/4后的材料作为农杆菌感染的受体，转化受体与农杆菌共培养后先接种在无筛选剂的培养基上进行愈伤诱导培养4周后，再继代到选择培养基上筛选抗性芽，以硫酸卡那霉素作为筛选剂，通过筛选获得抗性芽，继代培养获得抗性植株，经分子检测，获得转基因小油桐植株。
一种农杆菌介导的小油桐基因转化方法，包括以下步骤：
1、种子灭菌和外植体准备：
取小油桐成熟的种子，剥去外种皮，置无菌水中浸泡10～12小时后用75％的酒精灭菌30秒，无菌水冲洗2～3次，然后用0.8％～1.0％次氯酸钠溶液处理10分钟，无菌水冲洗3～4次，放置在无菌滤纸上除去多余的水分；取出胚，切除胚轴端1/3～1/4长度的子叶，剩余子叶部分作为外植体备用；
2、外植体与农杆菌共培养和转化
挑取含有pCAMBIA 2301质粒的农杆菌单克隆于含有50mg/L卡那霉素和25mg/L链霉素的YEP液体培养基中进行活化培养，在28℃下200rpm振荡培养12小时，转接并二次活化农杆菌，菌液浓度至OD600＝0.4～0.8，在4℃下4000rpm离心5分钟收集菌体，弃上清，用无菌液体MS基础培养基悬浮菌体至OD600＝0.4待用；
取制备好的子叶外植体置上述农杆菌菌液中，在28℃，150～200rpm摇床振荡培养20分钟，将浸染过的子叶外植体置无菌的滤纸上吸去多余的菌液，接种在共培养培养基MS-Jc1上暗培养3天；所述的共培养培养基MS-Jc1包括下述组份：MS基础培养基附加6-BA 3mg/L，IBA 0.01mg/L，蔗糖30g/L和琼脂7g/L，pH5.8；
3、外植体的愈伤诱导培养
共培养后的外植体材料用液体抑菌培养基MS-Jc1+500mg/L头孢霉素，洗去多余的菌，于滤纸上吸干材料表面的的液体，接种在不含筛选剂的含300mg/L头孢霉素的固体MS-Jc1抑菌培养基上，在12h光照/12h黑暗、温度为26±2℃条件下进行愈伤诱导培养4周；
4、抗性芽的筛选
愈伤诱导培养2～4周后，将培养材料继代至筛选培养基中培养，继续培养1～3周后将在子叶基部生长出抗性芽；所述的筛选培养基包括下述组份：MS-Jc1+300mg/L头孢霉素+15～25mg/L硫酸卡那霉素；
5、抗性芽的生根
抗性芽长至1.5～2cm高时，从愈伤块上切下，转接至生根诱导培养基上诱导生根，所述的生根诱导培养基RIM包括下述组份：1/2MS基础培养基，IBA0.1～0.2mg/L，NAA 0.1～0.2mg/L，头孢霉素100mg/L，硫酸卡那霉素20mg/L和蔗糖1.0％；
6、转基因植株的分子生物学方法鉴定
取所获得的抗性再生植株的叶片，采用PCR和Southern杂交等分子生物学方法进行转入基因的检测，或进行转入基因的蛋白质产物活性检测。
其中，所述的各种植物培养基在制备时，均调pH至5.8，120℃高压灭菌20min，当培养基温度冷至40～50℃时，再添加头孢霉素或硫酸卡那霉素，混匀分装后备用。
本发明与现有的小油桐转化方法相比，在转化受体、转化程序和周期以及转化效率等方面都具有明显的优势，具体表现在：
1转化受体再生芽能力强
小油桐的多个器官作为外植体进性愈伤诱导都相对较容易，但诱导出的愈伤组织较难分化出芽或芽的分化率不高，从而限制了小油桐的遗传转化效率。小油桐子叶具有较强的再生芽的能力，特别是在其基部。本发明所采用的转化受体为成熟种子的子叶，在其基部切出伤口用于农杆菌浸染，可获得较高的再生芽分化率。
2简化了转化程序，缩短了转化周期
与现有的农杆菌介导法相比，本发明的方法是经过较短时间的愈伤诱导就会有芽的分化，并再生出抗性芽，简化了遗传转化的程序，缩短了转化周期，三至四个月就可获得转基因小油桐。
3转化效率大大提高
通过目的基因的PCR和Southern杂交等分子检测，以及GUS活性染色结果表明，采用本发明方法的转基因小油桐的诱导率可达30.8％。
附图说明
图1为本发明以小油桐成熟种子的子叶为外植体采用农杆菌介导的转化方法获得转基因植株的过程以及转基因小油桐的GUS活性检测图。其中A.成熟种子的子叶和待转化的子叶外植体；B.子叶外植体与农杆菌共培养；C.在不含筛选剂的抑菌培养基上诱导4周产生不定芽；D和E.在含硫酸卡那霉素筛选培养基上生长出的抗性芽；F.抗性植株在生根培养基上诱导生根；G.非转化植株叶片的GUS染色；H和I.转基因植株叶片的GUS染色。A-F：比例尺：1cm；G-I：比例尺：200μm.
图2为本发明转基因小油桐的分子检测图。
其中A.GUS基因片段(355bp)的PCR检测；B.NPTII基因片段(380bp)的PCR检测；M，1kb的DNA标记；泳道1，阳性对照(pCAMBIA2301质粒)；泳道2，阴性对照(非转基因植株)；泳道3-15，不同的转基因小油桐植株；C和D.5微克的基因组DNA被内切酶EcoRI消化、电泳分离后的Southern杂交分析；图C和D泳道1为阳性对照(pCAMBIA2301质粒)；图C和D泳道2为阴性对照(非转基因植株)；图C泳道2-4和图D泳道3-7为不同的转基因小油桐植株。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步地详细说明，但它们并非是对本发明的限定。
实施例1
取小油桐成熟的种子，剥去外种皮，置无菌水中浸泡10小时后用75％的酒精灭菌30秒，无菌水冲洗2～3次，然后用1.0％次氯酸钠溶液处理10分钟，无菌水冲洗3～4次，放置在无菌滤纸上除去多余的水分；用无菌的镊子和解剖刀剥开胚乳，取出胚，切除胚轴端1/3～1/4长度的子叶，剩余子叶部分作为转化受体备用(图1A)。
挑取含pCAMBIA 2301质粒的LB4404农杆菌单克隆于含有50mg/L硫酸卡那霉素和25mg/L链霉素的YEP液体培养基中进行活化，28℃200rpm振荡培养12小时，转接并二次活化农杆菌菌液浓度至OD600＝0.4，4℃ 4000rpm离心5分钟收集菌体，弃上清用无菌液体MS基础培养基悬浮菌体至OD600＝0.4待用。
将制备好的转化受体置上述农杆菌菌液中，28℃ 200rpm摇床振荡培养20分钟，将浸染过的子叶置无菌的滤纸上吸去多余的菌液后，接种在共培养培养基上暗培养3天(图1B)。共培养培养基MS-Jc1组成：MS基础培养基附加6-BA 3mg/L，IBA 0.01mg/L，蔗糖30g/L和琼脂7g/L，pH5.8。
共培养后的材料用液体抑菌培养基(MS-Jc1+500mg/L头孢霉素)洗去多余的菌，于滤纸上吸干材料表面的液体，接种在不含筛选剂的含300mg/L头孢霉素的固体MS-Jc1抑菌培养基上，在光照培养进行不定芽的诱导4周(12h光照/12h黑暗、温度26±2℃)。
培养4周后，子叶基部的切点位置便形成少量的愈伤组织和萌出的芽点(图1C)，将上述材料继代至含硫酸卡那霉素的筛选培养基(MS-Jc1+300mg/L头孢霉素+20mg/L硫酸卡那霉素)上培养，获得抗性芽(图1D和E)。
抗性芽长至1.5～2cm高时便可从愈伤块上切下，转接至生根诱导培养基上诱导生根(图1F)。生根诱导培养基RIM组成：1/2MS基础培养基添加IBA 0.2mg/L，NAA 0.1mg/L，头孢霉素100mg/L，硫酸卡那霉素20mg/L，蔗糖1.0％。
取筛选出的抗性小桐子苗的叶片进行GUS基因和NPT II基因的PCR以及GUS基因的Southern杂交检测，证明目的基因有效地整合到小油桐基因组中(图2A-D)。对阳性株系的叶片进一步进行GUS活性染色，转基因植株也表现出GUS活性(图1G-I)，转基因小油桐的诱导率可达30.8％。
实施例2
重复实施例1，有以下不同点：愈伤诱导培养的时间为3周，然后继代到含硫酸卡那霉素的筛选培养基上培养。
实施例3
重复实施例1，有以下不同点：愈伤诱导培养的时间为2周，然后继代到含硫酸卡那霉素的筛选培养基上培养。
实施例4
重复实施例1，有以下不同点：筛选培养基中硫酸卡那霉素浓度为15mg/L。
实施例5
重复实施例1，有以下不同点：筛选培养基中硫酸卡那霉素浓度为25mg/L。
Claims (3)
1.一种农杆菌介导的小油桐基因转化方法，其特征在于：以小油桐成熟种子的子叶切除其基部的1/3～1/4后的材料作为农杆菌感染的受体，转化受体与农杆菌共培养后先接种在无筛选剂的培养基上进行愈伤诱导培养4周后，再继代到选择培养基上筛选抗性芽，以硫酸卡那霉素作为筛选剂，通过筛选获得抗性芽，继代培养获得抗性植株，经分子检测，获得转基因小油桐植株。
2.根据权利要求1所述的农杆菌介导的小油桐基因转化方法，其特征在于具体包括以下步骤：
(1)种子灭菌和外植体准备：
取小油桐成熟的种子，剥去外种皮，置无菌水中浸泡10～12小时后用75％的酒精灭菌30秒，无菌水冲洗2～3次，然后用0.8％～1.0％次氯酸钠溶液处理10分钟，无菌水冲洗3～4次，放置在无菌滤纸上除去多余的水分；取出胚，切除胚轴端1/3～1/4长度的子叶，剩余子叶部分作为外植体备用；
(2)外植体与农杆菌共培养和转化
挑取含有pCAMBIA 2301质粒的农杆菌单克隆于含有50mg/L卡那霉素和25mg/L链霉素的YEP液体培养基中进行活化培养，在28℃下200rpm振荡培养12小时，转接并二次活化农杆菌，菌液浓度至OD600＝0.4～0.8，在4℃下4000rpm离心5分钟收集菌体，弃上清，用无菌液体MS基础培养基悬浮菌体至OD600＝0.4待用；
取制备好的子叶外植体置上述农杆菌菌液中，在28℃，150～200rpm摇床振荡培养20分钟，将浸染过的子叶外植体置无菌的滤纸上吸去多余的菌液，接种在共培养培养基MS-Jc1上暗培养3天；所述的共培养培养基MS-Jc1包括下述组份：MS基础培养基附加6-BA 3mg/L，IBA 0.01mg/L，蔗糖30g/L和琼脂7g/L，pH5.8；
(3)外植体的愈伤诱导培养
共培养后的外植体材料用液体抑菌培养基MS-Jc1+500mg/L头孢霉素，洗去多余的菌，于滤纸上吸干材料表面的的液体，接种在不含筛选剂的含300mg/L头孢霉素的固体MS-Jc1抑菌培养基上，在12h光照/12h黑暗、温度为26±2℃条件下进行愈伤诱导培养4周；
(4)抗性芽的筛选
愈伤诱导培养2～4周后，将培养材料继代至筛选培养基中培养，继续培养1～3周后将在子叶基部生长出抗性芽；所述的筛选培养基包括下述组份：MS-Jc1+300mg/L头孢霉素+15～25mg/L硫酸卡那霉素；
(5)抗性芽的生根
抗性芽长至1.5～2cm高时，从愈伤块上切下，转接至生根诱导培养基上诱导生根，所述的生根诱导培养基RIM包括下述组份：1/2MS基础培养基，IBA0.1～0.2mg/L，NAA 0.1～0.2mg/L，头孢霉素100mg/L，硫酸卡那霉素20mg/L和蔗糖1.0％；
(6)转基因植株的分子生物学方法鉴定
取所获得的抗性再生植株的叶片，采用PCR和Southern杂交等分子生物学方法进行转入基因的检测，或进行转入基因的蛋白质产物活性检测。
3.根据权利要求2所述的农杆菌介导的小油桐基因转化方法，其特征在于：所述的各种植物培养基在制备时，均调pH至5.8，120℃高压灭菌20min，当培养基温度冷至40～50℃时，再添加头孢霉素或硫酸卡那霉素，混匀分装后备用。
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