CN114107376A - 一种烟草的农杆菌遗传转化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种烟草的农杆菌遗传转化方法，涉及农杆菌遗传转化方法技术领域，所述方法包括烟草无菌苗的培养、农杆菌介导的烟草叶盘转化和愈伤组织的筛选。通过将烟草遗传转化的外植体选择烟草小苗长大至三四片叶的无菌苗，由于三四片叶幼苗叶片再生能力最强，进而可实现无菌苗免除叶片消毒对叶片的伤害；通过首先将叶片侵染农杆菌前先培养两天，使叶片边缘膨化，进而可减少叶片侵染过程的伤害，提高叶片的被侵染效率；通过将农杆菌选择侵染的浓度是D600nm在1.0左右，时间为10min，可试下侵染率高，且对叶片伤害较小的效果，达到了最好的侵染效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种农杆菌遗传转化方法，特别涉及一种烟草的农杆菌遗传 转化方法。
背景技术
目前，植物遗传转化的方法多种多样，包括基因枪法、超声波法、电转 化法和花粉管通道法和农杆菌介导法等多种方法，其中农杆菌介导的遗传转 化技术是应用最广泛的植物的遗传转化的方法；但因为在不同种类的植物中 所需要的转化条件不同，且受到多种因素的影响，因此遗传转化体系的方法 大不相同；要想针对特定的植物进行遗传转化，就必须建立此种植物的相应 的农杆菌介导植物转化系统,并对影响遗传转化的多因素进行研究优化；外 植体的选择对转化效率具有重要的影响,外植体应尽量取健壮，再生能力强的，既可易于诱导生芽,也不易于死亡；农杆菌浸染时间的影响也很大，农 杆菌浸染时间过短，转化效率降低，农杆菌浸染时间过长,外植体易染菌， 抗性芽分化率较低；在农杆菌介导植物遗传转化体系的建立过程中,转化初 期使用合适的抗生素有效地筛选被转化的植物体和抑制多余的农杆菌的生 长，对遗传转化成功与否非常重要。此外，农杆菌浸染植物材料后，须用合 适的抗生素有效地杀死或抑制杂菌的生长,以防止杂菌危害植物组织并影响 植株再生。因此,确定合适的抗生素以及抗生素的使用量对提高遗传转化效 率具有重要意义。
以往的烟草农杆菌遗传转化体系存在着转化周期长，培养过程较为复杂， 污染率高，畸形苗和玻璃化现象严重等问题，且现有的烟草农杆菌遗传转化 方法，多采用叶盘转化法，只适应于一种烟草品种，另外因烟草外植体的选 择、农杆菌侵染的时间和浓度，抗生素的选择和浓度等方面影响，常造成转 化时间长，过程复杂，成苗率不高等问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种烟草的农杆菌遗传转化方法，对原来的烟草 农杆菌遗传转化方法进行优化，建立了一种稳定高效的烟草遗传转化体系， 可以适用于多种烟草品种，提高实验的效率和可靠性，以解决上述背景技术 中提出的的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种烟草的农杆菌遗传转 化方法，所述方法包括烟草无菌苗的培养、农杆菌介导的烟草叶盘转化和愈 伤组织的筛选；
所述烟草无菌苗的培养包括以下步骤：
S1、取10％NaClO清洗烟草种子两次，且每次清洗时间为10min，再取无 菌水清洗5次，且每次的清洗时间为2min；
S2、将灭菌后的烟草种子移至MS固体培养基上，将烟草种子萌发生长在 气候箱内；
S3、7天后，将萌发出的烟草幼苗转移至含有相同MS培养基的200ml组 织培养瓶中，同样条件下继续培养2-3周，小苗长大至三四片叶可用于叶盘 转化；
所述农杆菌介导的烟草叶盘转化包括以下步骤：
S4、在无菌条件下将无菌烟草苗的成熟叶片除去叶边缘，切成0.5*1.0cm 的小块，将叶片上表面接触培养基，8-9片/培养皿，排列于倒有共培养培养 基的培养皿中，置于23℃光照培养箱中，14h光照/10h黑暗条件下共培养48 h；
S5、待叶片边缘膨大后，浸泡在MS液体培养基悬浮的用于转化的农杆菌 EHA105菌液中，10min后取出叶片于灭菌的滤纸上吸去菌液，8-9片/培养皿， 排列于倒有共培养培养基的培养皿中，置于23℃光照培养箱中，14h光照/10 h黑暗条件下共培养48h；
S6、当看到烟草叶片与培养基接触边缘长出白色农杆菌时，将烟草叶片 转移至不加激素的MS液体培养基中，在28℃恒温摇床上振荡漂洗45-60min， 然后夹出叶片放于灭菌的滤纸上除去多余的液体培养基，将叶片上表面朝向 培养基，8片/皿排列于生芽筛选培养基上，置于23℃光照培养箱中，14h光 照/10h黑暗条件下培养1个月；
所述愈伤组织的筛选包括以下步骤：
S7、待愈伤组织长出绿芽时，切下绿芽并转入生根培养基中进行筛选， 且每3棵在一组培盒内，置于23℃光照培养箱中，14h光照/10h黑暗条件下 培养筛选；
S8、挑选能长出根的烟草幼苗植入土壤生长，2-3周后提取野生型和不同 株系转基因植株叶片的DNA，用于检测转基因植株。
作为本发明的一种优选技术方案，所述S2步骤中MS固体培养基包含4.74 g/LMS粉、30.00g/L蔗糖、8.00g/L琼脂，且pH为值为5.8-6.2。
作为本发明的一种优选技术方案，所述S2中烟草种子在气候箱光照为 14h，温度为28℃，黑暗为10h，温度为20℃，且气候箱的相对湿度为75％ 左右。
作为本发明的一种优选技术方案，所述S4和S5步骤中共培养培养基的 成分为4.74g/L MS粉、1.0mg/L Vitamin、2.0mg/L甘氨酸、3％蔗糖、0.6-0.7％ 琼脂，且共培养培养基的pH值为5.7-5.8。
作为本发明的一种优选技术方案，所述S6中生芽筛选培养基的成分为 4.74g/LMS粉、500.0mg/L羧苄青霉素、较高浓度转基因苗筛选抗生素、 0.1mg/L NAA、1.0mg/L BAP、0.59g/L MES、1.0mg/L Vitamin、2.0mg/L 甘氨酸、3％蔗糖、0.6-0.7％琼脂，且生芽筛选培养基的pH值为5.7-5.8。
作为本发明的一种优选技术方案，所述S7中生根培养基的成分为MS、 200mg/L羧苄青霉素、较低浓度转基因苗筛选抗生素、1mg/L Vitamin、2mg/L 甘氨酸、1.5％蔗糖、0.6-0.7％琼脂，且生根培养基的pH值为5.7-5.8。
作为本发明的一种优选技术方案，所述S5步骤中农杆菌EHA105菌液浓 度是D600nm在1.0左右。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明通过将烟草遗传转化的外植体选择烟草小苗长大至三四片叶 的无菌苗，由于三四片叶幼苗叶片再生能力最强，进而可实现无菌苗免除叶 片消毒对叶片的伤害；通过首先将叶片侵染农杆菌前先培养两天，使叶片边 缘膨化，进而可减少叶片侵染过程的伤害，提高叶片的被侵染效率；通过将 农杆菌选择侵染的浓度是D600 nm在1.0左右，时间为10min，可试下侵染率 高，且对叶片伤害较小的效果，达到了最好的侵染效果。
2、本发明的技术突破了植物转化针对不同品种的局限性，可适用于多种 烟草品种，成功率可以达到100％，周期可以低到2-3月，可实现实验过程简 单，节约了实验的周期和减少了工作量。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所 描述的实施例，仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本 发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得 的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种烟草的农杆菌遗传转化方法的技术方案：所述方法包 括烟草无菌苗的培养、农杆菌介导的烟草叶盘转化和愈伤组织的筛选；
所述烟草无菌苗的培养包括以下步骤：
S1、取10％NaClO清洗烟草种子两次，且每次清洗时间为10min，再取无 菌水清洗5次，且每次的清洗时间为2min；
S2、将灭菌后的烟草种子移至MS固体培养基上，将烟草种子萌发生长在 气候箱内；
S3、7天后，将萌发出的烟草幼苗转移至含有相同MS培养基的200ml组 织培养瓶中，同样条件下继续培养2-3周，小苗长大至三四片叶可用于叶盘 转化；
所述农杆菌介导的烟草叶盘转化包括以下步骤：
S4、在无菌条件下将无菌烟草苗的成熟叶片除去叶边缘，切成0.5*1.0cm 的小块，将叶片上表面接触培养基，8-9片/培养皿，排列于倒有共培养培养 基的培养皿中，置于23℃光照培养箱中，14h光照/10h黑暗条件下共培养48 h；
S5、待叶片边缘膨大后，浸泡在MS液体培养基悬浮的用于转化的农杆菌 EHA105菌液中，10min后取出叶片于灭菌的滤纸上吸去菌液，8-9片/培养皿， 排列于倒有共培养培养基的培养皿中，置于23℃光照培养箱中，14h光照/10 h黑暗条件下共培养48h；
S6、当看到烟草叶片与培养基接触边缘长出白色农杆菌时，将烟草叶片 转移至不加激素的MS液体培养基中，在28℃恒温摇床上振荡漂洗45-60min， 然后夹出叶片放于灭菌的滤纸上除去多余的液体培养基，将叶片上表面朝向 培养基，8片/皿排列于生芽筛选培养基上，置于23℃光照培养箱中，14h光 照/10h黑暗条件下培养1个月；
所述愈伤组织的筛选包括以下步骤：
S7、待愈伤组织长出绿芽时，切下绿芽并转入生根培养基中进行筛选， 且每3棵在一组培盒内，置于23℃光照培养箱中，14h光照/10h黑暗条件下 培养筛选；
S8、挑选能长出根的烟草幼苗植入土壤生长，2-3周后提取野生型和不同 株系转基因植株叶片的DNA，用于检测转基因植株。
S2步骤中MS固体培养基包含4.74g/LMS粉、30.00g/L蔗糖、8.00g/L 琼脂，且pH为值为5.8-6.2。
S2中烟草种子在气候箱光照为14h，温度为28℃，黑暗为10h，温度为 20℃，且气候箱的相对湿度为75％左右。
S4和S5步骤中共培养培养基的成分为4.74g/L MS粉、1.0mg/L Vitamin、 2.0mg/L甘氨酸、3％蔗糖、0.6-0.7％琼脂，且共培养培养基的pH值为5.7-5.8。
S6中生芽筛选培养基的成分为4.74g/L MS粉、500.0mg/L羧苄青霉素、 较高浓度转基因苗筛选抗生素、0.1mg/L NAA、1.0mg/L BAP、0.59g/L MES、 1.0mg/L Vitamin、2.0mg/L甘氨酸、3％蔗糖、0.6-0.7％琼脂，且生芽筛选 培养基的pH值为5.7-5.8。
S7中生根培养基的成分为MS、200mg/L羧苄青霉素、较低浓度转基因苗 筛选抗生素、1mg/L Vitamin、2mg/L甘氨酸、1.5％蔗糖、0.6-0.7％琼脂，且 生根培养基的pH值为5.7-5.8。
S5步骤中农杆菌EHA105菌液浓度是D600nm在1.0左右。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，例如，可以是固定连接，也 可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是 直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两 个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定，对于本领域的普通技术人员 而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而 言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行 多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限 定。
Claims (7)
1.一种烟草的农杆菌遗传转化方法，其特征在于：所述方法包括烟草无菌苗的培养、农杆菌介导的烟草叶盘转化和愈伤组织的筛选；
所述烟草无菌苗的培养包括以下步骤：
S1、取10％NaClO清洗烟草种子两次，且每次清洗时间为10min，再取无菌水清洗5次，且每次的清洗时间为2min；
S2、将灭菌后的烟草种子移至MS固体培养基上，将烟草种子萌发生长在气候箱内；
S3、7天后，将萌发出的烟草幼苗转移至含有相同MS培养基的200ml组织培养瓶中，同样条件下继续培养2-3周，小苗长大至三四片叶可用于叶盘转化；
所述农杆菌介导的烟草叶盘转化包括以下步骤：
S4、在无菌条件下将无菌烟草苗的成熟叶片除去叶边缘，切成0.5*1.0cm的小块，将叶片上表面接触培养基，8-9片/培养皿，排列于倒有共培养培养基的培养皿中，置于23℃光照培养箱中，14h光照/10h黑暗条件下共培养48h；
S5、待叶片边缘膨大后，浸泡在MS液体培养基悬浮的用于转化的农杆菌EHA105菌液中，10min后取出叶片于灭菌的滤纸上吸去菌液，8-9片/培养皿，排列于倒有共培养培养基的培养皿中，置于23℃光照培养箱中，14h光照/10h黑暗条件下共培养48h；
S6、当看到烟草叶片与培养基接触边缘长出白色农杆菌时，将烟草叶片转移至不加激素的MS液体培养基中，在28℃恒温摇床上振荡漂洗45-60min，然后夹出叶片放于灭菌的滤纸上除去多余的液体培养基，将叶片上表面朝向培养基，8片/皿排列于生芽筛选培养基上，置于23℃光照培养箱中，14h光照/10h黑暗条件下培养1个月；
所述愈伤组织的筛选包括以下步骤：
S7、待愈伤组织长出绿芽时，切下绿芽并转入生根培养基中进行筛选，且每3棵在一组培盒内，置于23℃光照培养箱中，14h光照/10h黑暗条件下培养筛选；
S8、挑选能长出根的烟草幼苗植入土壤生长，2-3周后提取野生型和不同株系转基因植株叶片的DNA，用于检测转基因植株。
2.根据权利要求1所述的一种烟草的农杆菌遗传转化方法，其特征在于：所述S2步骤中MS固体培养基包含4.74g/LMS粉、30.00g/L蔗糖、8.00g/L琼脂，且pH为值为5.8-6.2。
3.根据权利要求1所述的一种烟草的农杆菌遗传转化方法，其特征在于：所述S2中烟草种子在气候箱光照为14h，温度为28℃，黑暗为10h，温度为20℃，且气候箱的相对湿度为75％左右。
4.根据权利要求1所述的一种烟草的农杆菌遗传转化方法，其特征在于：所述S4和S5步骤中共培养培养基的成分为4.74g/L MS粉、1.0mg/L Vitamin、2.0mg/L甘氨酸、3％蔗糖、0.6-0.7％琼脂，且共培养培养基的pH值为5.7-5.8。
5.根据权利要求1所述的一种烟草的农杆菌遗传转化方法，其特征在于：所述S6中生芽筛选培养基的成分为4.74g/L MS粉、500.0mg/L羧苄青霉素、较高浓度转基因苗筛选抗生素、0.1mg/L NAA、1.0mg/L BAP、0.59g/L MES、1.0mg/L Vitamin、2.0mg/L甘氨酸、3％蔗糖、0.6-0.7％琼脂，且生芽筛选培养基的pH值为5.7-5.8。
6.根据权利要求1所述的一种烟草的农杆菌遗传转化方法，其特征在于：所述S7中生根培养基的成分为MS、200mg/L羧苄青霉素、较低浓度转基因苗筛选抗生素、1mg/L Vitamin、2mg/L甘氨酸、1.5％蔗糖、0.6-0.7％琼脂，且生根培养基的pH值为5.7-5.8。
7.根据权利要求1所述的一种烟草的农杆菌遗传转化方法，其特征在于：所述S5步骤中农杆菌EHA105菌液浓度是D600nm在1.0左右。
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