CN112715357B - 一种适合工厂化生产的大花虎刺梅的组培快繁方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于组织培养技术领域，是基于泰国引进的大花虎刺梅新品种进行2年的实验研究和生产基础上总结归纳的适合工厂化生产组培快繁研究方法，可操作性强，完全可用于指导生产。本发明首次建立了一套完整的具有高增殖倍数和生根率的适合工厂化生产的诱导、增殖、生根和炼苗的快繁方法，形成批量快速的繁殖局面，通过控制增殖代数、培养基激素浓度和配比随着代数的变化有所改变，确保种苗的稳定性、活力与增殖系数，提高产量和质量；本发明采用从第7代开始边增殖边生根的生产方式，降低生产成本的同时加快生产进度，保证增殖系数的同时确保出根苗的质量，完全适合大规模工厂化的生产，极大地提高大花虎刺梅繁育的效率。

Description

一种适合工厂化生产的大花虎刺梅的组培快繁方法

技术领域

本发明涉及组织培养技术领域，更具体地，涉及一种适合工厂化生产的大花虎刺梅的组培快繁方法。

背景技术

大花虎刺梅(Euphorbia milii)为大戟科大戟属植物，又名铁海棠、麒麟花等。大花虎刺梅茎粗、叶大、花朵繁茂、苞片明艳华丽色彩丰富，一年四季都能开花，花期长，更具有商品性。此外，虎刺梅可入药，具有拔毒、消肿和凉血、止血的作业。国内本土的虎刺梅主要以小花虎刺梅为主，大花虎刺梅花色较少。

目前，大花虎刺梅一般采用扦插的方式进行繁殖，但种苗母株有限，且繁殖系数低、速度慢，难以达到规模化、商品化、标准化的生产。

组织培养技术是目前植物快繁最有效的方法之一，具有繁殖系数高、成苗时间短和便于商品化和产业化生产的优势，且能保持品种的优良性状。目前，少许生产虎刺梅的公司和苗圃已开始利用组织培养技术进行小规模生产，快速繁殖出能够保持性状植株。

现有技术中关于大花虎刺梅的组培研究报道主要是针对单一品种进行组培快繁研究，且通过采用虎刺梅的子房、嫩叶或花瓣先诱导愈伤、再诱导丛芽的方式进行，容易导致组培苗变异。而关于适合工厂化的大花虎刺梅组培快繁的系统研究。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述技术缺陷，提供一种适合工业化生产的大花虎刺梅组培快繁方法，该方法能够批量快速的繁殖大花虎刺梅种苗，适应大规模种苗生产，满足市场需求。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

一种适合工厂化生产的大花虎刺梅的组培培养基，其特征在于，包括芽诱导培养基、增殖培养基、生根培养基；

所述芽诱导培养基为基础培养基+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA；

所述增殖培养基包括增殖培养基A、增殖培养基B和增殖培养基C，其中增殖培养基A为基础培养基+1.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA，增殖培养基B为基础培养基+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA，增殖培养基C为营养培养基1+0.5mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA；

所述生根培养基为营养培养基2+0.4mg/L IBA+0.02mg/L NAA。

其中，所述基础培养基的组成为：MS培养基添加蔗糖、卡拉胶；所述营养培养基1的组成为：MS培养基，添加蛋白胨、花宝2号、蔗糖、琼脂；所述营养培养基2的组成为：MS培养基，添加活性炭、蔗糖、琼脂。

本发明明确了大花虎刺梅工厂化生产控制的代数，优化了每个培养阶段所用培养基的组分含量和培养时间，生产上完全可以采用边增殖和边生根的方式培养。发明人经过大量实验研究发现，整个生产过程中从芽诱导诱导到最后一代增殖培养阶段所用激素是递减的，且每一阶段培养的代数范围也会对生产量和成本影响较大：芽诱导(0代)——增殖培养阶段I(第1-2代)——增殖培养阶段Ⅱ(第3-7代)——增殖培养阶段Ⅲ(7-13代)——生根培养(第7代可开始)。

本发明还提供一种适合工厂化生产的大花虎刺梅的组培快繁方法，包括以下步骤：

S1、芽诱导培养：以大花虎刺梅半张开的花朵为外植体，消毒后接种于芽诱导培养基中进行芽体诱导；

S2、将萌发的带外植体的芽体接种于增殖培养基A培养，或者在增殖培养阶段II，将萌发的丛芽接种于增殖培养基B培养，以分化出更多侧芽；或者在增殖培养阶段Ⅲ，将萌发的带侧芽的芽体接种于增殖培养基C培养，以分化出更多适合生根的侧芽；

其中，增殖培养阶段I是指大花虎刺梅生长第1-2代；增殖培养阶段II是指大花虎刺梅生长第3-7代，增殖培养阶段Ⅲ是指大花虎刺梅生长第7代之后；

S3、生根培养：将S2中仅带2-3片嫩叶的小侧芽切成单株接种于生根培养基中培养，其他材料再转接到S2的增殖培养基中进行增殖培养，从大花虎刺梅生长的第7代开始根据生产计划反复进行S2和S3的转接。

优选地，S2所述芽增殖培养使诱导的芽体成指数增殖成丛芽和侧芽。增殖培养基A培养时间为50-60天，每代25-30天；所述增殖培养基B培养时间为125-150天，每代25-30天；所述增殖培养基C培养时间为130-180天，每代25-30天。

S2的培养条件为：前5天黑暗培养，之后光照培养，每天光照时间10～12h，强度为2000lux，温度为25℃。

优选地，S2中增殖培养基C添加蛋白胨和花宝2号，所述蛋白胨能明显促进侧芽出芽和生长，增加增值系数。所述花宝2号能明显促进侧芽生长，使芽体叶更绿且健壮。更具体地，所述蛋白胨浓度为0.3g/L，所述花宝2号为0.1g/L。

S1所述芽诱导培养使大花虎刺梅花朵的花芽诱导成芽体。一般开始芽体诱导的时间为外植体接种到芽诱导培养基上30-40天，也有50天以上的(与品种有关)，大花虎刺梅诱导出芽体后即可接种至S2所述芽增殖培养基上。

S1诱导芽体的条件：黑暗培养7天后转为光照培养，每天光照时间10～12h，强度为2000lux，温度为25℃。

优选地，S3所述生根培养得到有根的完整植株。所述得到有根的完整植株的时间为接种到生根培养基上30天后。

优选地，S1所述外植体的消毒方法为：大花虎刺梅半张开的花朵依次用75％酒精溶液和升汞溶液进行处理，最后用无菌水冲洗干净。

需严格控制消毒剂的浓度和消毒时间，防止杀死外植体细胞，影响诱导率。酒精具有强渗透性，此时酒精进入细菌的细胞内使蛋白变性，避免杀死细菌的同时损伤幼嫩的植物细胞，酒精处理方式为棉花擦拭。

具体的，S1所述升汞的浓度为0.1％，处理时间为5～15min。更优选地，所述升汞的浓度为0.1％，浸泡时间为7min。所述升汞使病菌的蛋白变性，且对细菌的消毒能力比真菌强。

优选地，S3操作为：待侧芽长至1.5～3cm，有2-3片嫩叶时，转接到生根培养基中进行培养，剩下的芽体转接回S2的增殖培养基中。

优选地，S3生根的苗长至4-6cm，根数6条以上时，移栽到室外培养。

优选地，所述移栽为炼苗移栽，是将生根成功的袋苗置于温室中炼苗7～10天，洗净并用1000倍多菌灵处理10min后于基质中栽培。

优选地，所述基质由进口泥炭土：珍珠岩按体积比3：2混合所得。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本专利是基于泰国引进的大花虎刺梅9个新品种进行2年的实验研究和生产基础上总结归纳的适合工厂化生产组培快繁研究方法，可操作性强，完全可用于指导生产。

本发明首次建立了一套完整的具有增殖倍数和生根率的适合工厂化生产的诱导、增殖、生根和炼苗的快繁方法，形成批量快速的繁殖局面，通过控制增殖代数、培养基激素浓度和配比随着代数的变化有所改变，确保种苗的稳定性、活力与增殖系数，提高产量和质量；本发明采用边增殖边生根的生产方式，本发明采用从第7代开始边增殖边出根的生产方式，在繁殖过程中苗形态正常，月出根系数可达1～2倍(可根据生产需求调配)，苗的品质优良；月繁殖系数达2～3倍，侧芽增殖活力强，无退化现象；在保证增殖系数的同时确保出根苗的质量，完全适合大规模工业化的生产，极大地提高大花虎刺梅繁育的效率。

附图说明

图1为培育出的大花虎刺梅B4的照片；

图2为大花虎刺梅B4组培过程中不同培养阶段和炼苗的照片；

图3为大花虎刺梅B7组培过程中不同培养阶段和炼苗的照片；

图4为大花虎刺梅B8组培过程中不同培养阶段和炼苗的照片；

图5为大花虎刺梅B9组培过程中不同培养阶段和炼苗的照片。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例1不同诱导培养基对大花虎刺梅芽诱导的影响

采集半张开的大花虎刺梅花朵，75％酒精棉花擦拭整朵花，装入干净袋子。再于超净工作台上0.1％升汞消毒7min，无菌水冲洗4次。去掉大部分花瓣纵向切开2份或者整个花朵接种芽诱导培养基(芽诱导培养基的具体配方见表1)进行芽体诱导培养。前7天用黑布遮光，之后光照培养。

所述芽诱导培养基由基础培养基和激素组合组成，所述基础培养基包括以下组分：MS培养基，蔗糖30g/L，卡拉胶7g/L，pH值5.8。

每种处理接种10个外植体，试验重复3次。根据生长情况统计出芽时间、出芽率。

平均出芽率＝出芽总数/外植体总数。

表1

由表1可知，不同的激素浓度配比对芽体诱导率、出芽时间和芽体状态均有较大的影响。6-BA低于1.0，几乎诱导不出芽体，6-BA高于3.0，芽诱导率低于50％，且芽体不正常。6-BA在2.0较容易诱导出芽体，NAA比IBA更容易诱导成功且激素不能太低。结合后期芽增殖情况，6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L配方最适合大花虎刺梅芽体的芽诱导。

实施例2不同增殖培养基对大花虎刺梅增殖培养的影响

把实施例1中诱导的芽体接种到增殖培养基中(增殖培养基的具体配方见表2)进行1-7代增殖培养。培养光照强度为1500～2000lux，光照时间为10小时/天。

所述增殖培养基由基础培养基和激素组合组成，所述基础培养基包括以下组分：MS培养基，蔗糖30g/L，卡拉胶7g/L，pH值5.8。

本阶段数据为实验和大量生产时统计相应数据而得出的平均生根和增殖系数、苗长势。

表2不同激素组合对大花虎刺梅芽增殖的影响

据表2可知，不同激素组合对大花虎刺梅生长的代数影响较大，在第1～2代，总体增殖系数较低，较高的激素(1.0<6-BA<2.0)有利于大花虎刺梅的增殖和生长。而在第3～7代时，随着代数的增加总体增殖系数增大，较高的激素反而不利于大花虎刺梅的增殖，容易诱导出过大的愈伤，抑制出芽；此时较低的激素组合反而有利于稍高代数的大花虎刺梅增殖与生长。因为植物体内的内源激素随着代数的增加不断地累积，导致代数越高时，所需的外源激素下降。根据大量的实验和生产分析得出，在第1～2代时，6-BA 1.5mg/L+NAA0.2mg/L为最佳激素组合，增殖系数最高，苗健壮且生长快。在第3～7代时，6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L为最佳激素组合，增殖系数较高，苗健壮且数量多。

实施例3不同增殖培养基对大花虎刺梅后期增殖培养的影响

把实施例2中诱导的芽体接种到后期增殖培养基中(后期增殖培养基的具体配方见表3)进行7-13代增殖培养。培养光照强度为1500～2000lux，光照时间为10小时/天。

所述后期增殖培养基由营养培养基和激素组合组成，所述基础培养基包括以下组分：MS培养基，蛋白胨0.3g/L，花宝2号0.1g/L，蔗糖30g/L，卡拉胶7g/L，pH值5.8。

本阶段数据为实验和大量生产时统计相应数据而得出的平均增殖系数、苗长势。

表3不同激素和有机物组合对大花虎刺梅芽后期增殖的影响

据表3可知，随着增殖代数的增加，大花虎刺梅生长所素激素逐渐下降，低浓度的激素组合BA 0.5+NAA0.05诱导侧芽出芽率最高，芽体生长较快，且愈伤小。试验表明，添加蛋白胨和花宝2号均对芽体增殖和生长有促进作用，蛋白胨能明显促进侧芽出芽，提高增殖率；而花宝2号则侧重于促进芽体快速生长，提高生长量。为了能快速地诱导出更多适合后续生根的健壮侧芽，BA0.5+NAA0.05+蛋白胨+花宝2号的组合是大花虎刺梅第7-13代增殖较佳配方。

实施例4不同生根培养基对大花虎刺梅组培苗生根的影响

增殖的同时分切出带2-3叶片的侧芽接种到生根培养基上(生根培养基的具体配方见表4)进行生根培养，培养光照强度为2000～2500lux，光照时间为10小时/天。根据实验和生产数据统计平均生根率、根系情况和植株长势。

所述生根培养基由基础培养基和激素组合组成，所述基础培养基包括以下组分：MS培养基，活性炭0.3g/L，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH值5.8。

生根率＝生根植株树/总植株树×100％。

表4不同激素配比对大花虎刺梅组培苗生根的影响

如表4可知，大花虎刺梅较难生根，不同的激素组合对根系情况和植株长势影响较明显。一定范围内，激素越高越有利于植株的生长，出新叶快，叶柄粗壮，叶片大且翠绿。IBA/NAA的比值低于10不太利于出根，因为NAA比例大很容易诱导出愈伤，从而抑制底部生根。而仅含IBA能促进生根，但植株生长较慢。实验表明：IBA 0.4mg/L+NAA 0.02mg/L是最佳的激素组合，植株明显最健壮、高大、叶片大且翠绿，生根率最高。

对比例1 NAA和IBA对大花虎刺梅增殖培养效果的比较

以实施例2、实施例3中所筛选出最佳芽诱导培养和增殖培养基为基础，基础培养基、细胞分裂素6-BA浓度和生长素浓度不变，更改生长素的种类(即以NAA替换IBA)配制增殖培养基。

所述培养基由基础培养基和激素组合组成，所述基础培养基包括以下组分：MS培养基，蔗糖30g/L，卡拉胶7g/L，pH值5.8。

表5 NAA和IBA对大花虎刺梅芽诱导培养效果的比较

序号	激素组合	诱导时间(d)	芽诱导率(％)	芽体长势
					1	BA 2.0+NAA 0.2	30～40	80	芽体正常翠绿，生长快
2	BA 2.0+IBA 0.2	35～45	55	芽体较小，生长慢

表6 NAA和IBA对大花虎刺梅芽增殖培养效果的比较

由表5、表6可知：在芽诱导和芽增殖培养基中，NAA和IBA对大花虎刺梅生长有较明显的区别，NAA更利于大花虎刺梅芽的诱导、增殖和苗的生长，但也容易诱导出愈伤且叶片变黄。而IBA相比较对大花虎刺梅的芽诱导和促进效果差，但不容易诱导愈伤且叶片翠绿。所以从整个生产的成本和效率看，NAA更适合作为大花虎刺梅工厂化组培快繁的生长素，不过要尽量控制浓度。

图2到图5分别是不同品种的大花虎刺梅按照本发明上述方法进行快繁的组培照片，说明本发明所提供的上述组培培养基以及组培方法适合各种品种大花虎刺梅的组培快繁。

Claims (6)

1.一种适合工厂化生产的大花虎刺梅的组培快繁方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、芽诱导培养：以大花虎刺梅半张开的花朵为外植体，消毒后接种于芽诱导培养基中进行芽体诱导；

S2、在增殖培养阶段I，将萌发的带外植体的芽体接种于增殖培养基A培养，在增殖培养阶段II，将萌发的丛芽接种于增殖培养基B培养，以分化出更多侧芽；在增殖培养阶段Ⅲ，将萌发的带侧芽的芽体接种于增殖培养基C培养，以分化出更多适合生根的侧芽；

其中，增殖培养阶段I是指大花虎刺梅生长第1-2代；增殖培养阶段II是指大花虎刺梅生长第3-7代，增殖培养阶段Ⅲ是指大花虎刺梅生长第7代之后；

S3、生根培养：将S2中仅带2-3片嫩叶的小侧芽切成单株接种于生根培养基中培养，其他材料再转接到S2的增殖培养基中进行增殖培养，从大花虎刺梅生长的第7代开始根据生产计划反复进行S2和S3的转接；

所述芽诱导培养基为基础培养基+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA；

所述增殖培养基包括增殖培养基A、增殖培养基B和增殖培养基C，其中增殖培养基A为基础培养基+1.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA，增殖培养基B为基础培养基+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA，增殖培养基C为营养培养基1+0.5mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA；

所述生根培养基为营养培养基2+0.4mg/L IBA+0.02mg/L NAA；

其中，所述基础培养基的组成为：MS培养基添加蔗糖、卡拉胶；所述营养培养基1的组成为：MS培养基，添加蛋白胨、花宝2号、蔗糖、琼脂；所述营养培养基2的组成为：MS培养基，添加活性炭、蔗糖、琼脂。

2.根据权利要求1所述适合工厂化生产的大花虎刺梅的组培快繁方法，其特征在于，S1所述外植体的消毒方法为：大花虎刺梅半张开的花朵依次用75%酒精溶液和升汞溶液进行处理，最后用无菌水冲洗干净。

3.根据权利要求1所述适合工厂化生产的大花虎刺梅的组培快繁方法，其特征在于，S3操作为：待侧芽长至1.5～3cm，有2-3片嫩叶时，转接到生根培养基中进行培养，剩下的芽体转接回S2的增殖培养基中。

4.根据权利要求1所述适合工厂化生产的大花虎刺梅的组培快繁方法，其特征在于，S3生根的苗长至4-6cm，根数6条以上时，移栽到室外培养。

5.根据权利要求4所述适合工厂化生产的大花虎刺梅的组培快繁方法，其特征在于，所述移栽为炼苗移栽，是将生根成功的袋苗置于温室中炼苗7～10天，洗净并用1000倍多菌灵处理10min后于基质中栽培。

6.根据权利要求5所述适合工厂化生产的大花虎刺梅的组培快繁方法，其特征在于，所述基质由进口泥炭土：珍珠岩按体积比3：2混合所得。

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