CN112154916B - 芫花外植体培养繁育方法用培养基及芫花外植体培养繁育方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及芫花种苗繁育领域，具体公开了一种用于芫花外植体培养繁育方法的培养基及芫花外植体培养繁育方法。其培养基由诱导培养基、增殖培养基和生根培养基组成，各个培养基为花宝1号、花多多1号、6‑苄氨基嘌呤、萘乙酸、鲜榨椰子汁、蔗糖和琼脂等制备而成。本申请的芫花组培苗繁育方法为选用当年生春季嫩稍枝芽饱满的半木质化枝条茎尖作为外植体，进行消毒后分阶段置于诱导培养基中萌芽、增殖培养基中培养丛生芽、再于生根培养基中生根，直至培养出无菌种苗后，再驯化培养得到可用于工厂生产的正常种苗。其具有增殖倍率高、生根率达到95%以上的效果，适宜大规模生产芫花种苗。
Description
技术领域
本申请涉及芫花繁育领域，更具体地说，它涉及一种芫花外植体培养繁育方法用培养基及芫花外植体培养繁育方法。
背景技术
芫花(Daphne genkwa Sieb.et Zucc)，别名：药鱼草、闹鱼花、头痛花、闷头花、蜀桑等。瑞香科、瑞香属落叶灌木，高0.3～1米，多分枝；树皮褐色，无毛；小枝圆柱形，细瘦，干燥后多具皱纹，幼枝黄绿色或紫褐色，密被淡黄色丝状柔毛，老枝紫褐色或紫红色，无毛。为我国具有药用价值的乡土植物，近年来由于其花色艳丽，常被采挖培育成园艺作物。
常规的种苗繁育方法为种子扦插繁殖和分株繁殖，利用植物组织培养的方式进行种苗繁育未见报道。但是种子播种或分株繁殖，存在生产周期极其漫长，且不能规模化生产的问题。
发明内容
为了缩短芫花繁殖周期，提高量产效率，降低生产成本，本申请提供一种芫花外植体培养繁育方法用培养基及芫花外植体培养繁育方法。
第一方面，本申请提供一种芫花外植体培养繁育方法用培养基，采用如下的技术方案：一种芫花外植体培养繁育方法用培养基，由诱导培养基、增殖培养基和生根培养基组成，该三种培养基分别配制且依次用于芫花外植体培养繁育方法的初代培养步骤、继代培养步骤和生根培养步骤，
所述诱导培养基中按照比例加入下列物质，使得各物质浓度分别为花宝1号1g/L、花多多1 号1g/L、6-苄氨基嘌呤2.3～2.7mg/L、萘乙酸0.3～0.7mg/L、鲜榨椰子汁100ml/L、蔗糖30g/L 和琼脂6g/L，调节溶液pH值为5.85；
所述增殖培养基中按照比例加入下列物质，使得各物质浓度分别为花宝1号1g/L、花多多1 号1g/L、6-苄氨基嘌呤0.1～0.5mg/L、鲜榨椰子汁100ml/L、蔗糖30g/L和琼脂6g/L，调节溶液pH值为5.85；
所述生根培养基以MS基本培养基为基础，按照比例加入下列物质，使得各物质浓度分别为萘乙酸0.8～1.2mg/L、蔗糖15g/L、活性炭0.5g/L和琼脂6g/L，调节溶液pH值为5.85。
通过采用上述技术方案，花宝1号和花多多1号为花用肥料，富含各种化学营养成分和微量元素，但不含蔗糖和琼脂，适合植物成长及根、茎强壮用；MS培养基为Murashige和Skoog研制的通用培养基，具有较高的无机盐浓度，为组织生长提供充足的矿物质营养并加速愈伤组织的生长；椰汁中含有多种氨基酸，用来提供植物所需营养；萘乙酸有助于植物生根；6-苄氨基嘌呤是一种细胞分裂素，促进芽的形成；蔗糖作为碳源提供能量；琼脂起固定作用，为植物提供养料。在含有以上物质的培养基中，可以快速促进腋芽萌发，诱导产生丛生芽，进而生根后成长为无根苗，最后形成无菌有根苗。
可选的，所述诱导培养基中按照比例加入下列物质，使得各物质浓度分别为花宝1号 1g/L、花多多1号1g/L、6-苄氨基嘌呤2.5mg/L、萘乙酸0.5mg/L、鲜榨椰子汁100ml/L、蔗糖 30g/L和琼脂6g/L，调节溶液pH值为5.85。
通过采用上述技术方案，当诱导培养基中6-苄氨基嘌呤含量为2.5mg/L且萘乙酸含量为0.5mg/L时，萌芽生长的效果较佳。
可选的，所述增殖培养基中按照比例加入下列物质，使得各物质浓度分别为花宝1号 1g/L、花多多1号1g/L、6-苄氨基嘌呤0.3mg/L、鲜榨椰子汁100ml/L、蔗糖30g/L和琼脂6g/L，调节溶液pH值为5.85。
通过采用上述技术方案，当增殖培养基中6-苄氨基嘌呤的含量为0.3mg/L时，外植体增殖倍率较高。
可选的，所述生根培养基以MS基本培养基为基础，按照比例加入下列物质，使得各物质浓度分别为萘乙酸1.0mg/L、蔗糖15g/L、活性炭0.5g/L和琼脂6g/L，调节溶液pH值为5.85。
通过采用上述技术方案，当生根培养基中萘乙酸的含量为1.0mg/L时，顶芽生根的效果较佳。
第二方面，本申请提供一种芫花外植体培养繁育方法，应用如上述任一项所述的芫花外植体培养方法用培养基，包括以下步骤：
S1：外植体选择，选用当年生春季嫩稍枝芽饱满的半木质化枝条茎段尖端5～15cm长的部分作为外植体；
S2：外植体消毒，将外植体的叶片剪去，清水洗净后，消毒液浸泡，浸泡完成后将外植体取出放入无菌水中漂洗，得到消毒完成后的外植体；
S3：初代培养，将消毒完成后的外植体接种到诱导培养基中，培养至外植体萌芽；
S4：继代培养，将外植体萌芽转接到增殖培养基中，培养至生长出丛生芽；
S5：生根培养，取2～3cm的丛生芽的顶芽，接种入生根培养基，培养至诱导出根须，得到无菌种苗。
通过采用上述技术方案，对外植体进行消毒可以减少空气中的细菌、病毒对外植体产生感染的情况，提高萌芽率；当外植体生长出萌芽时，移植入增殖培养基，加速细胞增殖，从而生长出顶芽；再对顶芽进行生根培养，直至顶芽生长出根须，得到无菌种苗。
可选的，所述步骤S3、步骤S4和步骤S5中培养条件均为，每天先于光照强度1500Lx条件下光照16h，温度为25℃；然后于黑暗条件下培养8h，温度为23℃。
通过采用上述技术方案，在此光照强度和温度下，给予了外植体、萌芽和丛生芽顶芽合适的生长条件。
可选的，所述步骤S2中的消毒液由商品漂白水和无菌水按1:4的比例配制而成。
通过采用上述技术方案，商品漂白水可以是常规的家用白猫牌漂白水，一般次氯酸钠浓度为5wt％-10wt％，能有效对外植体进行消毒杀菌，降低其被细菌、病毒等感染的可能性，提高繁育成功率。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1.由于本申请采用了诱导培养基、增殖培养基和生根培养基在适宜条件下对芫花外植体进行繁育培养，获得了增殖倍率高、生根率达到95％以上的效果，适宜大规模生产芫花种苗。
2、本申请中优选采用春季生嫩稍芽尖作为外植体，原料易得，成本较低。
具体实施方式
原料来源
MS培养基是Murashige和Skoog研制的通用培养基，采购于西格玛公司；花宝1号为美国产园艺通用速效水溶肥料；花多多1号为美国产园艺通用速效水溶肥；20-20-20水溶性均衡肥为德国诺贝尔化学矿业集团生产；供试材料采自江苏东郁植物科技有限公司苗圃的健康芫花，外植体选用当年春季嫩稍枝芽饱满的半木质化枝条茎段尖端长5-15cm的部分。
培养基的制备例
制备例1
向去离子水中按照比例加入下列物质，使得各物质浓度分别为花宝1g/L、花多多1号1g/L、 6-苄氨基嘌呤2.3mg/L、萘乙酸0.7mg/L、鲜榨椰子汁100ml/L、蔗糖30g/L和琼脂6g/L，混合均匀得到诱导培养基，调节溶液pH值为5.85；
向去离子水中按照比例加入下列物质，使得各物质浓度分别为花宝1号1g/L、花多多1号1g/L、 6-苄氨基嘌呤0.5mg/L、鲜榨椰子汁100ml/L、蔗糖30g/L和琼脂6g/L，混合均匀得到增殖培养基，调节溶液pH值为5.85；
向MS培养基中按照比例加入下列物质，使得各物质浓度分别为萘乙酸0.5mg/L、蔗糖15g/L、活性炭0.5g/L和琼脂6g/L，混合均匀得到生根培养基，调节溶液pH值为5.85。
制备例2-5
制备例2-5以制备例1为基础，区别在于下列物质浓度不同，其他物质含量均相同，具体见表1。
表1制备例2-5各原料比例
实施例
实施例1
一种芫花外植体培养繁育方法用培养基，选用制备例1中所制得的诱导培养基、增殖培养基和生根培养基，该三种培养基分别配制且依次用于芫花外植体培养繁育方法的初代培养步骤、继代培养步骤和生根培养步骤。
一种芫花外植体培养繁育方法，包括以下步骤，
S1：外植体选择，选用当年生春季嫩稍枝芽饱满的半木质化枝条茎段尖端10cm长的部分作为外植体；
S2：外植体消毒，将外植体的叶片剪去，清水冲洗干净后，在超净工作台上用医用酒精擦拭干净，然后用家用白猫漂白水(次氯酸钠浓度为5wt％)和无菌水按1：4的比例配制消毒液，将外植体用消毒液浸泡15min，期间进行轻微摇晃3次，消毒完成后将外植体取出放入无菌水中漂洗3次；
S3：初代培养，将消毒完成后的外植体接种到诱导培养基中，条件保持为光照强度1500Lx，光照时间为每天16h，温度为25℃；黑暗下每天8h，温度为23℃，于无菌条件下培养，直至培养出无菌萌芽外植体；
S4：继代培养，将无菌萌芽外植体转接到增殖培养基中，条件保持为光照强度1500Lx，光照时间为每天16h，温度为25℃；黑暗下每天8h，温度为23℃，且每隔6周转接入新的增殖培养基，直至外植体生长出丛生顶芽；
S5：取2cm的顶芽，接种入生根培养基，在培养环境为光照强度1500Lx、温度25℃的条件下，光照16h；同时黑暗条件，温度23℃，培养8h，每天进行。在生根培养基中培养4周，诱导出4条须根，得到无菌种苗；
S6：为了进一步提高无菌种苗移栽后的成活率，完成生根培养后，将无菌种苗转移至温室大棚中，保持温度在27℃，湿度75％，覆盖85％遮光率遮阳网两层，保持15天；然后去掉一层遮阳网后，继续保持14天，得到驯化种苗。
S7：将驯化种苗移栽于72穴育苗穴盘中，移栽介质配制为1份蛭石及1份珍珠岩，移栽完成后，立即使用600目喷头浇水，浇水后覆盖塑料薄膜和90％遮光率的遮阳网3天，移除塑料薄膜，覆盖单层90％遮光率的遮阳网再培养4天，然后移除遮阳网，600目喷头补肥水进行叶面施肥。叶面肥用20-20-20水溶性均衡肥，晴天每天上午10点喷施一次，半个月后统计驯化种苗的移栽成活率大于99.9％。
实施例2-5
实施例2-5均涉及一种芫花外植体培养繁育方法用培养基，以实施例1为基础，区别仅在于选用如表2所示的培养基。
表2实施例2-5培养基来源
| 实施例 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 |
| 所选培养基来源 | 制备例2 | 制备例3 | 制备例4 | 制备例5 |
实施例6
实施例6以实施例5为基础，区别仅在于用75％酒精与无菌水按照1:4的比例配制消毒液，并采用此消毒液进行外植体的消毒处理。
对比例
对比例1
一种芫花外植体培养繁育方法，与实施例5的区别仅在于初代培养前，不进行消毒液前期处理，只利用清水清洗4次。
对比例2
一种芫花外植体培养繁育方法，与实施例5的区别仅在于将诱导培养基和增殖培养基中的6- 苄氨基嘌呤替换为等量的激动素。
对比例3
一种芫花外植体培养繁育方法，与实施例5的区别仅在于将诱导培养基和生根培养基中的萘乙酸替换为等量的赤霉酸。
对比例4
一种芫花外植体培养繁育方法，与实施例5的区别仅在于将诱导培养基和增殖培养基中的6- 苄氨基嘌呤替换为等量的激动素，同时将诱导培养基和生根培养基中的萘乙酸替换为等量的赤霉酸。
对比例5
一种芫花外植体培养繁育方法，与实施例5的区别仅在于诱导培养基中6-苄氨基嘌呤浓度为 2.1mg/L、萘乙酸浓度为0.9mg/L。
对比例6
一种芫花外植体培养繁育方法，与实施例5的区别仅在于诱导培养基中6-苄氨基嘌呤浓度为 2.9mg/L、萘乙酸浓度为0.1mg/L。
对比例7
一种芫花外植体培养繁育方法，与实施例5的区别仅在于诱导培养基中6-苄氨基嘌呤浓度为 2mg/L。
对比例8
一种芫花外植体培养繁育方法，与实施例5的区别仅在于诱导培养基中萘乙酸浓度为0.9 mg/L。
对比例9
一种芫花外植体培养繁育方法，与实施例5的区别仅在于增殖培养中6-苄氨基嘌呤的浓度为 0.7mg/L。
对比例10
一种芫花外植体培养繁育方法，与实施例5的区别仅在于增殖培养中6-苄氨基嘌呤的浓度为 0.1mg/L。
对比例11
一种芫花外植体培养繁育方法，与实施例5的区别仅在于生根培养基中萘乙酸的浓度为 0.6mg/L。
对比例12
一种芫花外植体培养繁育方法，与实施例5的区别仅在于生根培养基中萘乙酸的浓度为 1.4mg/L。
对比例13
一种荛花外植体培养繁育方法，与实施例5选用相同培养基和培养方法进行繁育。
对比例14
一种瑞香外植体培养繁育方法，与实施例5选用相同培养基和培养方法进行繁育。
对上述实施例1-6、对比例1-14观察以下指标。
试验相关指标计算公式如下:
消毒成功率(％)＝(消毒外植体数-25d内死亡外植体数-25d内腐烂外植体数)×100；
萌芽率(％)＝25d内萌芽外植体数/外植体总数×100；
增殖倍率＝外植体移栽至增殖培养基中6周内生长出的丛生芽数量；
生根率(％)＝4周内生根培苗数/生根培养基中培苗总数×100。
生根系数＝4周内每柱培苗的生根数
芽高＝4周后丛生芽的生长高度
实验结果如表2和表3所示：
表3实施例1-6实验结果
表4对比例1-14实验结果
结合实施例1～6并结合表3可以看出，通过本申请中原料配比的诱导培养基、增殖培养基和生根培养基，可以实现在短期内利用芫花外植体进行芫花的培养繁育量产。外植体的萌芽率均达到70％及以上，增殖倍率在4～7倍左右，生根系数在3～5之间，同时生根率均在95％以上，可以推断出当本外植体繁育方法应用于量产时，可以实现快速繁殖。
结合实施例1～6并结合表3可以看出，顶芽长出时间均在40天以内，生长周期相较于种子扦插繁殖和分株繁殖方式短很多。且通过表中萌芽高度一栏可以发现萌芽高度性状较为平均，可以推断出当驯化后的培苗移栽到自然条件下生长后，所得苗木将规格较为整齐，性状稳定。
结合对比例1和表4可以看出，当外植体不采用本申请中的消毒液进行消毒处理时，外植体的死亡和腐烂情况严重，仅有少量外植体可以不被病毒和细菌感染，可以存活。且萌芽率和生根率都远低于实施例，无法应用于量化培养。而应用本申请中配制的消毒液对外植体进行消毒处理后，所得外植体的消毒成功率均达到60％以上，效果差异明显。
结合对比例2-4和表4可以看出，当将培养基中的6-苄氨基嘌呤和萘乙酸其中任一中替换为同类物质时，萌芽率和生根率相应均降低，效果变差。
结合对比例5-8和表4可以看出，当将诱导培养基中的6-苄氨基嘌呤含量和萘乙酸含量不在本申请所选范围内时，外植体萌芽率都会变低。因此推断出当诱导培养基中6-苄氨基嘌呤浓度为2.3～2.7mg/L、萘乙酸为0.3～0.7mg/L时，两者协同配合效果更佳。
结合对比例9-10和表4可知，当增殖培养基中6-苄氨基嘌呤的浓度高于或者低于0.1～ 0.5mg/L时，外植体的增殖效果变差。
结合对比例11-12和表4可知，当生根培养基中萘乙酸的浓度高于或者低于0.3～0.7mg/L时，顶芽生根率和生根系数均下降。
结合对比例12-14和表4可知，当本申请中的培养基和培养方法应用于与芫花同属瑞香科的其他品种植物繁育时，如荛花、瑞香等，萌芽率、增殖倍率和生根率都较低，且生根时间较长，难以用于量化繁殖。
结合实施例1-6、对比例1-14以及表3和表4可知，虽然都可以培养出种苗，但是本申请方案培养出的种苗在从芽高度上高于对比例中的从芽高度，生长情况较优。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (7)
1.一种用于芫花外植体培养繁育方法的培养基，由诱导培养基、增殖培养基和生根培养基组成，该三种培养基分别配制且依次用于芫花组培苗繁育方法的初代培养步骤、继代培养步骤和生根培养步骤，其特征在于：
所述诱导培养基中按照比例加入下列物质，使得各物质浓度分别为花宝1号1g/L、花多多1号1g/L、6-苄氨基嘌呤2.3～2.7mg/L、萘乙酸0.3～0.7mg/L、鲜榨椰子汁100ml/L、蔗糖30g/L和琼脂6g/L，调节溶液pH值为5.85；
所述增殖培养基中按照比例加入下列物质，使得各物质浓度分别为花宝1号1g/L、花多多1号1g/L、6-苄氨基嘌呤0.1～0.5mg/L、鲜榨椰子汁100ml/L、蔗糖30g/L和琼脂6g/L，调节溶液pH值为5.85；
所述生根培养基以MS培养基为基础，按照比例加入下列物质，使得各物质浓度分别为萘乙酸0.8～1.2mg/L、蔗糖15g/L、活性炭0.5g/L和琼脂6g/L，调节溶液pH值为5.85。
2.根据权利要求1所述的用于芫花外植体培养繁育方法的培养基，其特征在于：所述诱导培养基中按照比例加入下列物质，使得各物质浓度分别为花宝1号1g/L、花多多1号1g/L、6-苄氨基嘌呤2.5mg/L、萘乙酸0.5mg/L、鲜榨椰子汁100ml/L、蔗糖30g/L和琼脂6g/L，调节溶液pH值为5.85。
3.根据权利要求2所述的用于芫花外植体培养繁育方法的培养基，其特征在于：所述增殖培养基中按照比例加入下列物质，使得各物质浓度分别为花宝1号1g/L、花多多1号1g/L、6-苄氨基嘌呤0.3mg/L、鲜榨椰子汁100ml/L、蔗糖30g/L和琼脂6g/L，调节溶液pH值为5.85。
4.根据权利要求3所述的用于芫花外植体培养繁育方法的培养基，其特征在于：所述生根培养基以MS培养基为基础，按照比例加入下列物质，使得各物质浓度分别为萘乙酸1.0mg/L、蔗糖15g/L、活性炭0.5g/L和琼脂6g/L，调节溶液pH值为5.85。
5.一种芫花外植体培养繁育方法，其特征在于，应用权利要求1-4任一项所述的芫花外植体培养方法用培养基，包括以下步骤：
S1：外植体选择，选用当年生春季嫩稍枝芽饱满的半木质化枝条茎段尖端 5～15cm长的部分作为外植体；
S2：外植体消毒，将外植体的叶片剪去，清水洗净后，消毒液浸泡，浸泡完成后将外植体取出放入无菌水中漂洗，得到消毒完成后的外植体；
S3：初代培养，将消毒完成后的外植体接种到诱导培养基中，培养至外植体萌芽；
S4：继代培养，将外植体萌芽转接到增殖培养基中，培养至生长出丛生芽；
S5：生根培养，取2～3 cm的丛生芽的顶芽，接种入生根培养基，培养至诱导出根须，得到无菌种苗。
6.根据权利要求5所述的芫花外植体培养繁育方法，其特征在于：所述步骤S3、步骤S4和步骤S5中培养条件均为，每天先于光照强度1500Lx条件下光照16h，温度为25℃；然后于黑暗条件下培养8h，温度为23℃。
7.根据权利要求6所述的芫花外植体培养繁育方法，其特征在于：所述步骤S2中的消毒液由商品漂白水和无菌水按1:4的比例配制而成。
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