CN114807219B - 一种农杆菌介导的芝麻子叶转基因方法 - Google Patents
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Abstract
本申请属于基因工程操作技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的芝麻子叶转基因方法。该方法包括：获得外植体、制备侵染液、侵染共培养、组织培养、抗性筛选、诱导生根和移栽等步骤。本申请以常用的农杆菌侵染子叶进行转基因方法为基础，结合芝麻组培再生体系的构建，提供了一种具有转化周期短、转化率高的基于芝麻子叶的转基因遗传转化方法。初步实验结果证实，相关植物添加物对实现芝麻再生植株健康生长和生根是必备条件，而通过相关培养基组分和培养条件的优化组合，可成功获得大批芝麻转基因植株。基于该遗传转化体系，可为后续开展芝麻重要基因功能验证、转基因突变体库构建及优异种质创制等研究奠定良好的技术基础。
Description
技术领域
本申请属于基因工程操作技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的芝麻子叶转基因方法。
背景技术
胡麻科胡麻属的芝麻（Sesamum indicum L., 2n=26），是最古老的油料作物之一。因其（芝麻）籽粒中富含丰富的油脂、蛋白及抗氧化物质木酚素，也被称作“油料皇后”。芝麻广泛分布在世界热带和亚热带地区，是重要的油料作物之一。世界上共有80余国家种植芝麻，世界年种植面积约800万公顷，年产量450万吨。印度、苏丹、缅甸和中国是世界芝麻主要主产国。我国年种植芝麻约53万公顷，居世界第四位；平均单产为1,182公斤/公顷，居世界第一位；平均总产量为62万吨，居世界第三位（2003-2012，FAO数据）。因品质优良、风味纯正，我国芝麻在国际贸易市场中占有重要地位。
受芝麻物种本身的生理特性决定，芝麻抗病抗逆性相对较差，单产水平也相对较低。在此情况下，如果常规采用现有育种材料和育种手段，在短时间内很难实现优异新品种的突破。而随着转基因、分子育种等育种技术的快速发展，也为芝麻新品种培育提供了新的技术手段。但现有相关研究结果显示，由于芝麻植株再生十分困难（诸多文献报道均有证明，例如：陈占宽等， 芝麻人工构建雄性不育基因的转化研究初报，华北农学报，1996；Yadav et.al.，Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation ofsesame (Sesamum indicum L.)，Plant Cell Tiss Organ Cult，2010；Chowdhury et.al.，A new high-frequency Agrobacterium-mediated transformation technique forSesamum indicum L. using de-embryonated cotyledon as explant，Protoplasma，2014；Mitsuma et.al.，Activation of phenylpropanoid metabolism in sesame byover-expression of carrot calmodulin gene，Biol Pharm Bull，2004；Chowdhuryet.al.，Overexpression of a new osmotin-like protein gene (SindOLP) confe），转基因技术体系构建难度大，因此进展缓慢。并且截止目前，尚未见通过转基因技术实现芝麻基因在栽培种芝麻转基因植株中的功能特征分析的实例（参见：Miao et al.，TissueCulture and Genetic Transformation in Sesame[M]//The Sesame Genome，Springer，Cham， 2021）。
现有技术中，已有报道的芝麻转基因技术多以茎尖为外植体，通过农杆菌侵染方法获得转基因植株，发明人所属研究组对这些已公开报道的遗传转化方法进行了研究和重复，发现现有技术中栽培种芝麻阳性再生植株形成频率几乎为0（数据未公开发表），无法较好用于芝麻基因功能特征分析和优异新种质创制。究其原因，一方面，下胚轴、子叶节等外植体类型对芝麻丛生芽诱导和植株再生的频率影响较大。另一方面，从芝麻丛生芽到健康再生植株形成，成功率过低，最终导致了芝麻转基因阳性植株形成率低、成活率低，极大地阻碍了芝麻转基因技术体系的构建及应用（部分研究结论参见：Chowdhury et al.，Overexpression of a new osmotin-like protein gene (SindOLP) confers toleranceagainst biotic and abiotic stresses in sesame，Frontiers in plant science，2017）。因此，构建一种高效的芝麻遗传转化技术方法，对于芝麻转基因育种技术体系具有十分重要的技术意义。
发明内容
本申请目的在于提供一种相对高效的农杆菌介导的芝麻子叶转基因方法，从而克服现有技术中芝麻遗传转化效率低、转基因再生植株成活率低等技术问题，进而为芝麻的转基因育种等育种技术发展奠定一定技术基础。
本申请所采取的技术方案详述如下。
一种农杆菌介导的芝麻子叶转基因方法，该方法包括如下步骤：
（一）获得外植体
对芝麻种子消毒后，培养萌发，以子叶作为转基因用外植体材料；具体操作而言：
挑选饱满健康的芝麻种子，75%乙醇消毒90s后，用无菌水冲洗2次以确保冲洗干净；
随后，用3%的次氯酸钠消毒15min以上，再用无菌水洗涤3-5次；
再后，将灭菌后的种子置于无菌水中，室温（25~30℃左右）、黑暗、100-110 r/min摇床振荡培养不少于12h以确保种子萌发；
最后，用无菌刀片将萌发培养后的籽粒切成两半，切取靠近尖部1/3处的子叶组织（子叶远轴端0.2-0.5cm左右处），以此作为转基因用外植体材料；
（二）制备侵染液，并进行侵染共培养
在将带有目的基因的重组质粒转化农杆菌后，首先将所筛选的转化正确的重组农杆菌活化后，LB液体培养基中，25~30℃（具体例如28℃）、180~250r/min（具体例如220 r/min）振荡培养至OD600=0.6~0.8左右备用；
随后，将上述农杆菌菌液进行离心（10000 r/min下离心3 min）后，用液体共培养基M1重悬菌体，并调节OD600=0.6~0.8以作为侵染菌液备用；
所述液体共培养基M1，其配方为：MS + 6-BA 5.0 mg/L + IAA 1.0 mg/L + ABA1.0 mg/L + AgNO3 5.0 mg/L + 乙酰丁香酮100 mmol/L，pH=5.8；
再后，无菌、室温（25~30℃左右）条件下，将步骤（一）中所获得外植体材料置于上述侵染菌液中浸染8~20min（优选15min）；
最后，取出上述浸染后外植体材料，吸干外植体表面的水分后，置于固体型共培养基M1中，25~28℃、黑暗条件下共培养2~4d（具体例如为3d）；
所述固体型共培养基M1，其配方为：液体共培养基M1+ 琼脂粉7.5 g/L；
也即，固体型共培养基M1其配方为：MS + 6-BA 5.0 mg/L + IAA 1.0 mg/L + ABA1.0 mg/L + AgNO3 5.0 mg/L + 乙酰丁香酮100 mmol/L+ 琼脂粉7.5 g/L，pH=5.8；
（三）组织培养和进行抗性筛选
将步骤（二）中共培养后外植体转入诱导培养基M2中，25~28℃、暗培养8~12d（优选培养10d左右）后，转入25~28℃、光暗交替（要求参考：光16h/暗8h，光照强度为3000 Lux）条件下，继续培养18~25d（优选培养20d左右），以诱导形成丛生芽；
所述诱导培养基M2，其配方为：MS + 6-BA 5.0 mg/L + IAA 1.0 mg/L + ABA 1.0mg/L + AgNO3 5.0 mg/L + 头孢氨苄 400 mg/L + 琼脂粉 7.5 g/L，pH=5.8；
随后，将诱导出的丛生芽分切后转接至抗性筛选培养基M3中（培养条件不变，即，25~28℃、光照强度3000 Lux、光16h/暗8h），进行不少于两轮的抗性筛选，并将筛选所得幼苗培养至生长有2-4片真叶的幼苗（约30天）；培养期间，可每15d继代1次；
所述抗性筛选培养基M3，其配方为：MS + 6-BA 2.5mg/L + IAA 1.0 mg/L + ABA1.0 mg/L + AgNO3 5.0 mg/L + 头孢氨苄 300 mg/L +抗性筛选物（例如：针对pBI121质粒，可为20 mg/L的卡那霉素；针对pFGC5941质粒，可为草铵膦1 mg/L） + 植物添加物 5.0~10.0 g/L +琼脂粉 7.5 g/L，pH=5.8；
所述植物添加物，为特油作物芝麻和紫苏叶片混合物（优选情况下，质量比计，芝麻：紫苏=1:1）；即：将特油作物芝麻、紫苏健康植株叶片等量清洗，干燥后研磨成粉末，组培应用时，将该固体粉末按量加入灭菌前培养基中随培养基灭菌即可；
（四）诱导生根和移栽
对步骤（三）中抗性筛选所得到组培幼苗，进一步分切后或者直接转入生根培养基中，继续培养（培养条件不变，即：25~28℃、光照强度3000 Lux、光16h/暗8h）15~30d以诱导生根；
所述生根培养基，其配方为：MS + NAA 2.0mg/L +头孢氨苄 200 mg/L +植物添加物 5.0g/L +琼脂粉 7.5 g/L，pH=5.8；
待生根后幼苗主根长至不短于3cm（一般选择3~5cm均可）时，即可移栽至营养钵中（基质为草炭和蛭石，V:V=2:1）进行适应性驯化，驯化5~7d后即可移至温室或大田进行种植；
进一步地，对移栽后芝麻转基因再生植株，可添加其基因组（例如采用CTAB法以叶片为样品来添加DNA）后，通过PCR方法来进行进一步鉴定，以确定转化植株是否为阳性转基因植株。
本申请所提供的芝麻遗传转化体系，以子叶为外植体，通过对农杆菌侵染后转基因组培体系优化，成功地获得了大批芝麻转基因植株。该方法可为后续大批量开展芝麻重要基因功能验证、芝麻转基因突变体库构建、转基因优异新种质创制以及转基因芝麻新品种选育等工作开展奠定良好的技术基础。
总体而言，与现有已报道的芝麻转基因技术相比，本发明具有如下技术优点：
（1）本发明通过优化侵染条件、优化相关抗性筛选培养基组分，可显著提高转基因效率，减少再生植株的假阳性率，且阳性再生植株生长健壮，成活率率高；
（2）本发明通过对相关培养基组分、尤其是生根培养基优化以及有益植物添加物的添加，可显著提高抗性再生植株的存活率和生根率，进而明显提高转基因效率；
（3）本申请通过对筛选用抗生素用量优化，显著提高了外植体的丛生芽诱导效率和再生频率，从而确保了较好的生长效果；
（4）通过对多种基因型芝麻试验材料的试验，阳性转化植株比例在90%以上，具有转化周期短、抗性植株成株率好、再生成功率高等优点，表明本申请所提供的转基因遗传转化体系适用性强、结果稳定可靠，具有较好的应用推广价值。
总体上，本申请以常用的农杆菌侵染子叶进行转基因方法为基础，结合芝麻组培再生体系的构建，提供了一种具有转化周期短、转化率高的基于芝麻子叶的转基因遗传转化方法。初步实验结果证实，相关植物添加物对实现芝麻再生植株健康生长和生根是必备条件，而通过相关培养基组分和培养条件的优化组合，可成功获得大批芝麻转基因植株。基于该遗传转化体系，可为后续开展芝麻重要基因功能验证、转基因突变体库构建及优异种质创制等研究奠定良好的技术基础。
附图说明
图1为芝麻转基因植株nptⅡ基因PCR检测结果，其中：泳道M为DNA marker DL2000；泳道1：PCR阴性对照1（清水）；泳道2：PCR阴性对照2（非转基因植株DNA）；泳道3：PCR阳性对照（PBI121质粒DNA）；泳道4、5、7、8、9、12、13：阳性转基因植株PCR结果，均扩增出了nptⅡ基因序列片段（带长720bp）；泳道6、10、11：阴性转基因植株PCR结果，未能扩增出nptⅡ基因序列片段；
图2为实施例1中获得的T2代转pBI121阳性植株GUS组织活性染色结果，其中：从左至右图片分别为已获得的T2代转pBI121阳性植株YA60和YA84的根、茎、叶、花组织GUS染色结果。组织染色后显示为蓝色，表明植株含有被转入的外源报告基因GUS基因；
图3为转pFGC5941载体的芝麻转基因植株外源基因Bar PCR检测结果，其中：泳道M为DNA marker DL 2000；泳道1：阴性对照1（清水）；泳道2：阴性对照2（非转基因植株DNA）；泳道3：阳性对照（pFGC5941质粒DNA）；泳道4、5、7、8、9、11、13、14：阳性转基因植株PCR结果，能够扩增出Bar基因序列片段（带长430bp）；泳道7、12：阴性转基因植株PCR结果，未能扩增出Bar基因序列片段。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。
生物材料：
pBI121质粒载体（含有卡那霉素抗性和筛选标记GUS报告基因）、载体pFGC5941（含有卡那霉素抗性和筛选标记草铵膦抗性基因Bar）、农杆菌LBA4404，均为基因工程中常用质粒和菌株，可公开获得；
豫芝11号，常见的芝麻栽培品种，可由公开渠道获得。
相关培养基：
参考现有常规组培技术，配制相关组分、并灭菌消毒即可，不再赘述其制备方法。
实施例1
本实施例以pBI121空表达载体（载体本身含有卡那霉素抗性和筛选标记GUS报告基因，也即，遗传转化中，GUS基因相当于目的基因）为例，以我国主推芝麻品种豫芝11号作为转基因原始材料，就农杆菌介导的芝麻子叶转基因遗传转化体系的构建方法简介如下。
（一）获得外植体
选取饱满干净的豫芝11号成熟籽粒，在无菌操作台上，75%乙醇消毒90s后，用无菌水冲洗2次；随后，用3%的次氯酸钠消毒15min后，用无菌水洗涤5次；
将无菌种子置于无菌水中，在室温（25℃左右）、黑暗条件下，100 r/min摇床振荡培养12h，确保种子萌发；
最后，用无菌刀片将培养萌发后的籽粒切成两半，切下两片子叶，切取靠近尖部1/3处的子叶组织（子叶远轴端0.2-0.5cm左右处），以此作为转基因用外植体材料；
（二）制备侵染液，并进行侵染共培养
参考现有转基因常规操作，将转化有质粒载体PB121的农杆菌菌株，在LB液体培养基中，28℃、220r/min振荡培养至OD600=0.6~0.8左右备用；
随后，将上述农杆菌菌液进行离心（10000 r/min离心3 min）后，弃去上清液，用液体共培养基M1重悬菌体，并调节OD600=0.7以作为侵染菌液备用；
所述液体共培养基M1，其配方为：MS + 6-BA 5.0 mg/L + IAA 1.0 mg/L + ABA1.0 mg/L + AgNO3 5.0 mg/L + 乙酰丁香酮100 mmol/L，pH=5.8。
再后，无菌、室温（25℃左右）条件下，将步骤（一）中所获得外植体材料置于上述侵染菌液中充分浸染15min；
最后，取出上述浸染后外植体材料，吸干外植体表面的水分后，置于固体型共培养基M1中，28℃、黑暗条件下共培养3d；
所述固体型共培养基M1，其配方为：液体共培养基M1+ 琼脂粉7.5 g/L；
也即，固体型共培养基M1其配方为：MS + 6-BA 5.0 mg/L + IAA 1.0 mg/L + ABA1.0 mg/L + AgNO3 5.0 mg/L + 乙酰丁香酮100 mmol/L+ 琼脂粉7.5 g/L，pH=5.8。
（三）组织培养和进行抗性筛选
将步骤（二）中共培养后外植体转入诱导培养基M2中，28℃、暗培养10d后，转入28℃、光16h/暗8h条件下（光照强度为3000 Lux），继续培养20d左右，以诱导形成丛生芽；
所述诱导培养基M2，其配方为：MS + 6-BA 5.0 mg/L + IAA 1.0 mg/L + ABA 1.0mg/L + AgNO3 5.0 mg/L + 头孢氨苄 400 mg/L + 琼脂粉 7.5 g/L，pH=5.8；
随后，将诱导出的丛生芽分切后转接至抗性筛选培养基M3中（培养条件不变），进行两轮的抗性筛选，并将筛选所得幼苗培养至生长有2-4片真叶的幼苗（约30天）；培养期间，每15d继代1次；
所述抗性筛选培养基M3，其配方为：MS + 6-BA 2.5mg/L + IAA 1.0 mg/L + ABA1.0 mg/L + AgNO3 5.0 mg/L + 头孢氨苄 300 mg/L + 卡那霉素（为确定合适浓度，分别设计了：0、10、20、30 mg/L ）+ 植物添加物（分别设计0、5、10g/L ）+琼脂粉 7.5 g/L，pH=5.8。
实验过程中，基于丛生芽诱导率和抗性筛选效果考量，以卡那霉素和植物添加物为影响因素，设计了双因素试验。双因素试验共设置12个处理：每个处理和对照分别培养60个外植体，3次重复。具体设计如下表1所示。
表1，卡那霉素和植物添加物双因素处理设计
。
培养过程中，筛选培养第一轮后统计抗性芽块数，第二轮后统计抗性再生苗数；根据PCR检测结果统计阳性再生苗数量。
需要解释的是，基于发明人长期工作经验积累，发明人认为，芝麻、紫苏等特油作物叶片中含有某些特定的有益营养物质，具有防止细胞老化的作用。因此，本申请以芝麻叶和紫苏叶作为添加物对芝麻再生影响效果进行了系统试验（部分结果见表2）。就本申请所涉及相关试验而言：
所述植物添加物，具体制备方法参考如下：质量比计，芝麻：紫苏=1:1，将特油作物芝麻、紫苏健康植株叶片等量混合清洗干净，干燥后研磨成粉末，组培应用时，将固体粉末按量加入灭菌前培养基中随培养基灭菌即可。
（四）诱导生根和移栽
对步骤（三）中抗性筛选所得到组培幼苗，进一步分切后或者直接转入生根培养基中，继续培养（培养条件不变，即：28℃、光照强度3000 Lux、光16h/暗8h）15~30d（一般20d左右即可生根长至3cm左右）以诱导生根；
所述生根培养基，其配方为：MS + NAA 2.0mg/L +头孢氨苄 200 mg/L +植物添加物 5.0g/L +琼脂粉 7.5 g/L，pH=5.8；
待生根后幼苗主根长至不短于3cm（一般选择3~5cm均可）时，即可移栽至营养钵中（基质为草炭和蛭石，V:V=2:1）进行适应性驯化，驯化5~7d后即可移至温室或大田进行种植。
（五）转化结果鉴定
对转化植株分别进行了GUS染色鉴定和PCR检测鉴定，具体结果简介如下。
（1）转基因植株的PCR检测
首先，摘取待鉴定阳性芝麻转基因植株样本幼嫩叶片，采用CTAB法添加样本DNA；
随后，以卡那霉素抗性标记基因nptⅡ（新霉素磷酸转移酶基因）为PCR检测目标基因，设计引物对序列如下：
Forward primer：5’ –GAGGCTATTCGGCTATGACTG-3’ ，
Reverse primer：5’ –TAGAAGGCGATGCGCTGCGA-3’；
最后，以前述所添加DNA为模板，进行PCR扩增，20μL扩增体系设计如下：
模板DNA，1.0μL；
Mix，10.0μL
正、反向引物，各1.0μL（10μM）；
超纯水，7μL；
PCR反应程序：94℃预变性1min；94℃变性30s，58℃变性30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，4℃保温。
扩增完成后，对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。
PCR扩增过程中，以pBI121质粒DNA为阳性对照，以清水为阴性对照。
目标基因nptⅡ，长度为720bp ，序列如SEQ ID No.1所示，具体可参考如下：
GAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGATGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTA。
（2）转基因植株GUS组织化学检测
采用GUS基因组织化学染色法分别对转基因再生植株的 根、茎、叶和花组织进行染色体检测，以判定转基因阳性率。具体操作可参考如下：
将取得的芝麻组织放入到1.5 mL无菌离心管中，加20μL GUS染色液在37℃过夜；
GUS染色液组成：50 mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 7.0)、5 mmol/L K4Fe(CN)6、5mmol/LK3Fe(CN)6、10 mmol/L EDTA、0.1% TritonX-100和1.0 mg/mL X-Gluc,用0.45μm滤器过滤除菌。
试验数据：
抗性芽块诱导率%=（抗性芽块数/接种的总外植体数）；
抗性再生植株形成率%=（抗性再生植株数/接种总外植体数）×100%；
遗传转化率（%）=（PCR检测阳性植株/接种总外植体数）×100%。
（3）植物添加物和筛选抗生素浓度影响结果
结合转化鉴定结果，对不同浓度筛选抗生素（卡那霉素）和不同添加比例植物添加物处理（T1-T12）对芝麻遗传转化效果数据进行了统计，具体结果如下表2所示。
表2，不同筛选浓度卡那霉素和不同比例植物添加物处理组对芝麻转基因抗性丛生芽诱导和抗性再生植株形成频率的影响结果（表中：“1%极显著水平”列所对应的“A”、“B”、“BC”等字符仅是数据统计中字符标注，不具有特殊技术含义）
。
对上表数据进行分析，可以看出：
在不添加植物添加物的情况下，分别采用0、10、20、30mg/L卡那霉素（T1-T4处理）对诱导形成的丛生芽进行抗性筛选时，抗性丛生芽块诱导率的变化范围为47.22%（T4）-83.33%（T1）；也即，随着抗生素浓度的增加，抗性丛生芽块诱导发生率逐渐降低。但是在从丛生芽培养形成再生苗过程中，T1-T4处理均可获得健康的抗性再生苗。
而在不添加抗生素卡那霉素的情况下，添加不同浓度（0、5、10g/L）植物添加物（T1、T5、T9处理）情况下，抗性丛生芽诱导和再生植株形成率进行结果显示，三个处理下平均抗性丛生芽块诱导率分别为83.33%、83.33%和80.55%(差异不显著，P>0.01）。也即，在没有抗生素筛选的情况下，T1、T3、T9等三个处理下抗性再生植株形成率分别为0%、5.56%和51.11%，遗传转化效率分别为0%、0.56%和8.89%，植物添加物浓度的升高有利于抗性丛生芽的诱导和抗性再生植株的形成。
综合两因素的6个处理（T6-T8，T10-T12）结果，可以看出：在抗生素卡那霉素和植物添加物物双因素影响下，抗性丛生芽的诱导率范围为31.67%-76.67%，但遗传转化效率均较抗生素、植物添加物单一处理明显提高；在T11处理（20mg/L卡那霉素浓度、10g/L植物添加物）条件下，芝麻遗传转化效率为最高（32.78%），此时，抗性丛生芽诱导率为58.33%，抗性再生植株形成率为36.67%。
综合上述结果，可以得到如下结论：特定植物添加物的添加与否直接决定了能否成功获得芝麻抗性再生植株，也因此，特油植物营养添加物是实现芝麻遗传转化效率0突破的关键性限制性因素之一；而合适浓度的筛选用抗生素卡那霉素则有利于抗性丛生芽诱导和筛选，对提升芝麻遗传转化效率具有重要作用。
（4）PCR方法检测的转基因植株转化结果
以PBI121质粒中的nptⅡ基因为检测目的基因，部分再生植株PCR检测结果如图1所示。
可以看出，阳性再生植株均能成功扩增出目的条带（720bp），而阴性对照、非转基因植株等均未扩增出目的条带，这一结果表明相关检测目的基因选择、和相关引物设计是合理和正确的。
统计结果表明，在初步抗性筛选获得的340株芝麻转基因再生植株（即，前述抗性筛选、植物添加物双因子实验处理组中所有获得的转基因再生植株）中，PCR检测确定有156个再生植株为阳性转基因植株，占比为45.88%。其中，T11组处理获得了59株阳性转基因植株，占抗性再生植株（64株）的比例为92.18%。这一结果进一步表明，添加植物添加物是成功构建芝麻遗传转化技术体系、获得大批阳性转基因植株的必要条件和关键步骤。
（5）转基因再生植株GUS染色结果
分别取pBI121阳性再生植株YA60和YA84株系的（相关编号仅是实验记录编号，不具有特殊意义）根、茎、叶、花等组织，分别进行了GUS组织活性染色。同时，以未转化的野生型植株叶片作为对照。染色过程中，将待测材料放入配置好的GUS染色液中，37°C恒温处理12h，然后用75%乙醇脱色至阳性对照呈白色。
结果如图2所示。GUS染色后显示为蓝色的样本即为阳性转基因材料；染色后未出现蓝色的样本即为非转基因材料或阴性转基因材料。可以看出，阳性植株的根、茎、叶、花组织均有gus基因表达，这一结果也进一步证明了PCR检测结果的准确性和可靠性。
实施例2
为说明本申请所提供遗传转化体系的通用性，发明人进一步以pFGC5941表达载体（含草铵膦抗性基因Bar）为例，就相关遗传转化体系构建过程及实验结果简介如下。
相关实验操作参考实施例1，仅就部分区别操作简要说明如下。
步骤（三）中，由于pFGC5941表达载体携带有草铵膦抗性基因，因此抗性筛选培养基M3配方调整为：
MS + 6-BA 2.5mg/L + IAA 1.0 mg/L + ABA 1.0 mg/L + AgNO3 5.0 mg/L + 头孢氨苄 300 mg/L +抗性筛选物草铵膦1 mg/L + 植物添加物 5.0g/L +琼脂粉 7.5 g/L，pH=5.8。
针对转基因植株进行进一步PCR检测判定时，针对抗草铵膦基因Bar进行PCR检测时，设计PCR扩增用引物对如下：
正向引物序列：5’ AGAAACCCACGTCATGCCAG 3’；
反向引物序列：5’ GTCTGCACCATCGTCAACCA 3’。
扩增操作参考前述实施例1即可，扩增片段长度430bp，序列具体如下：
AGAAACCCACGTCATGCCAGTTCCCGTGCTTGAAGCCGGCCGCCCGCAGCATGCCGCGGGGGGCATATCCGAGCGCCTCGTGCATGCGCACGCTCGGGTCGTTGGGCAGCCCGATGACAGCGACCACGCTCTTGAAGCCCTGTGCCTCCAGGGACTTCAGCAGGTGGGTGTAGAGCGTGGAGCCCAGTCCCGTCCGCTGGTGGCGGGGGGAGACGTACACGGTCGACTCGGCCGTCCAGTCGTAGGCGTTGCGTGCCTTCCAGGGGCCCGCGTAGGCGATGCCGGCGACCTCGCCGTCCACCTCGGCGACGAGCCAGGGATAGCGCTCCCGCAGACGGACGAGGTCGTCCGTCCACTCCTGCGGTTCCTGCGGCTCGGTACGGAAGTTGACCGTGCTTGTCTCGATGTAGTGGTTGACGATGGTGCAGAC。
部分PCR扩增结果如图3所示。统计结果显示，在对200个芝麻子叶外植体转基因组培再生后，共获得抗性再生植株110株。经PCR检测确定为阳性的再生植株共有89株，遗传转化率为44.5%，表现出较好的应用效果。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南省农业科学院芝麻研究中心
<120> 一种农杆菌介导的芝麻子叶转基因方法
<130> none
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 720
<212> DNA
<213> pBI121载体
<400> 1
gaggctattc ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt 60
ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct 120
gaatgaactg caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg 180
cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt 240
gccggggcag gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc 300
tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc 360
gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga 420
tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg 480
catgcccgac ggcgatgatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat 540
ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg 600
ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc 660
tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta 720
Claims (3)
1.一种农杆菌介导的芝麻子叶转基因方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
（一）获得外植体
对芝麻种子消毒后，培养萌发，以子叶作为转基因用外植体材料；
（二）制备侵染液，并进行侵染共培养
在将带有目的基因的重组质粒转化农杆菌后，将转化正确的重组农杆菌活化、培养，并制备成侵染菌液；
将步骤（一）中所获得外植体材料置于侵染菌液中浸染8~20min；
取出浸染后外植体材料，黑暗条件下共培养2~4d；
侵染菌液中，农杆菌浓度为OD600=0.6~0.8；
制备侵染液时，以液体共培养基M1重悬农杆菌菌体制备获得；
共培养时，采用固体型共培养基M1进行培养；
所述液体共培养基M1，其配方为：MS + 6-BA 5.0 mg/L + IAA 1.0 mg/L + ABA 1.0mg/L + AgNO3 5.0 mg/L + 乙酰丁香酮100 mmol/L，pH=5.8；
所述固体型共培养基M1，其配方为：液体共培养基M1+ 琼脂粉7.5 g/L；
（三）组织培养和进行抗性筛选
将步骤（二）中共培养后外植体转入诱导培养基M2中，以诱导形成丛生芽；
随后，将诱导出的丛生芽分切后转接至抗性筛选培养基M3中，进行抗性筛选，并将筛选所得幼苗培养至生长有2-4片真叶的幼苗；培养期间，
所述抗性筛选培养基M3，培养基中添加有：植物添加物 5.0~10.0 g/L；
所述植物添加物，为特油作物芝麻和紫苏叶片混合物；
诱导形成丛生芽时，诱导培养基M2配方为：MS + 6-BA 5.0 mg/L + IAA 1.0 mg/L +ABA 1.0 mg/L + AgNO3 5.0 mg/L + 头孢氨苄 400 mg/L + 琼脂粉 7.5 g/L，pH=5.8；
抗性筛选时，抗性筛选培养基M3配方为：MS + 6-BA 2.5mg/L + IAA 1.0 mg/L + ABA1.0 mg/L + AgNO3 5.0 mg/L + 头孢氨苄 300 mg/L +抗性筛选物+ 植物添加物 5.0~10.0 g/L +琼脂粉 7.5 g/L，pH=5.8；
（四）诱导生根和移栽
对步骤（三）中抗性筛选所得到组培幼苗，进一步分切后或者直接转入生根培养基中，继续培养以诱导生根；
所述生根培养基，其配方为：MS + NAA 2.0mg/L +头孢氨苄 200 mg/L +植物添加物5.0g/L +琼脂粉 7.5 g/L，pH=5.8；
所述植物添加物，为特油作物芝麻和紫苏叶片混合物；
待生根后幼苗主根长至不短于3cm时，可移栽至营养钵中进行适应性驯化，驯化5~7d后移至温室或大田进行种植。
2.如权利要求1所述农杆菌介导的芝麻子叶转基因方法，其特在于，步骤（一）中，所述芝麻的芝麻品种为豫芝11号；所述转基因用外植体材料指芝麻种子萌发后靠近尖部1/3处的子叶组织。
3.如权利要求1所述农杆菌介导的芝麻子叶转基因方法，其特在于，所述抗性筛选物，针对pBI121质粒，为20 mg/L的卡那霉素；针对pFGC5941质粒，为草铵膦1 mg/L。
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Citations (5)
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| CN101948867A (zh) * | 2010-08-13 | 2011-01-19 | 中国科学院西双版纳热带植物园 | 一种农杆菌介导的小油桐基因转化方法 |
| CN102492721A (zh) * | 2011-12-12 | 2012-06-13 | 河南省农业科学院 | 一种农杆菌介导的芝麻遗传转化方法 |
| CN102517327A (zh) * | 2011-12-22 | 2012-06-27 | 内蒙古民族大学 | 一种建立农杆菌介导蓖麻遗传转化体系的方法 |
| CN112119912A (zh) * | 2020-08-28 | 2020-12-25 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 一种快速高效的芝麻毛状根遗传转化体系的建立方法 |
| CN112514794A (zh) * | 2020-12-11 | 2021-03-19 | 郑州大学 | 一种芝麻离体再生培养方法以及百里香酚作为所用培养基添加剂的应用 |
-
2022
- 2022-04-15 CN CN202210394766.7A patent/CN114807219B/zh active Active
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| "An efcient protocol for in vitro direct shoot organogenesis of Sesamum indicum L. using cotyledon as explant";A. J. Debnath et al.;《3 Biotech》;第8卷;第1-13页 * |
| "芝麻子叶基因转化受体系统的建立";魏利斌等;《分子植物育种》;第9卷(第6期);第770-778页 * |
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|---|---|
| CN114807219A (zh) | 2022-07-29 |
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