CN112813096B - 一种毛竹幼胚离体再生及遗传转化的方法 - Google Patents

一种毛竹幼胚离体再生及遗传转化的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种毛竹幼胚离体再生及遗传转化的方法，该方法包含：毛竹幼胚愈伤组织的诱导、毛竹愈伤组织的增殖、转化载体pER8‑WUS‑RdCodA的构建、农杆菌侵染、毛竹抗性愈伤组织的筛选与不定芽的分化、转基因植株再生与炼苗移栽和毛竹转基因再生植株检测。其中，转化载体pER8‑WUS‑RdCodA的构建包含：将雌二醇诱导载体pER8进行Xho I/Spe I双酶切；在玉米WUS基因两端加入载体同源序列，将其插入酶切后的pER8载体中，将Rd29A启动子诱导的CodA基因完整表达框插入EcoR V位点，以构建转化载体pER8‑WUS‑RdCodA。本发明的方法能够缩短转化周期，提高转化效率。

Description

一种毛竹幼胚离体再生及遗传转化的方法
技术领域
本发明涉及一种遗传转化的方法，具体涉及一种毛竹幼胚离体再生及遗传转化的方法。
背景技术
竹子是重要的森林资源之一，具有分布广、生长快、用途多、生态和经济价值高等特点。竹子开花周期长，开花后死亡，杂交育种非常困难，缺乏生产上急需的优新品种。自上世纪80年代以来，已经对毛竹属(Phyllostachys)、牡竹属(Dendrocalamus Nees)、麻竹属(Dendrocalamus)、赤竹属(Sasa Makinoet Shibata)以及泰竹属(Thysostachys Gamble)等20余属70多个竹种不同的外植体和培养条件进行组织培养研究，获得了愈伤组织或丛生芽，并在一些竹种上诱导出了完整的再生植株。但是，目前竹子组织培养成功的报导中，90％集中于丛生竹种，且植株再生效率普遍较低。在麻竹中已有遗传转化的成功报道，但是仍然存在转化周期长和转化效率低等问题。
毛竹(Phyllostachys edulis)是大型散生竹种之一，是中国栽培悠久、面积最广、经济价值也最重要的竹种。Yuan等利用毛竹成熟种子诱导愈伤并获得了再生植株，但是该体系存在外植体灭菌困难，诱导和再生效率低等问题，毛竹中尚未有遗传转化的成功报道。
综上所述，毛竹再生体系尚不完善，尚无遗传转化体系。稳定高效的毛竹遗传转化体系已经成为制约毛竹生物技术育种的关键技术障碍。
发明内容
本发明的目的是提供一种毛竹幼胚离体再生及遗传转化的方法，解决了毛竹再生体系尚不完善的问题，能够提高抗性愈伤组织的增殖和状态的改善，缩短转化周期，提高转化效率。
为了达到上述目的，本发明提供了一种毛竹幼胚离体再生及遗传转化的方法，该方法包含：毛竹幼胚愈伤组织的诱导、毛竹愈伤组织的增殖、转化载体pER8-WUS-RdCodA的构建、农杆菌侵染、毛竹抗性愈伤组织的筛选与不定芽的分化、转基因植株再生与炼苗移栽和毛竹转基因再生植株检测。
所述毛竹幼胚愈伤组织的诱导，包含：对未成熟毛竹种子灭菌后，将胚剥离于愈伤诱导培养基上，25±1℃暗培养，以诱导出愈伤组织；其中，所述愈伤诱导培养基的组分包含：MS培养基、2.0～6.0mg/L2,4-D、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH＝5.8。其中，2,4-D浓度低于2.0mg/L则无法抑制胚芽萌发，不利于愈伤组织诱导，而浓度高于6.0mg/L则不利于后续愈伤组织的增殖和分化。
所述毛竹愈伤组织的增殖，包含：将所述愈伤组织转置于继代培养基中进行继代培养，25±1℃暗培养；其中，所述继代培养基的组分包含：MS培养基、0.1mg/L或1.0mg/L的2,4-D、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH＝5.8；采用含0.1mg/L2,4-D的继代培养基和1.0mg/L2,4-D的继代培养基交替进行继代培养。
所述转化载体pER8-WUS-RdCodA的构建，包含：将雌二醇诱导载体pER8进行Xho I/Spe I双酶切，以获得pER8线性化载体；在玉米WUS基因两端加入载体同源序列，并通过同源重组的方法将其插入pER8线性化载体中，获得重组载体pER8-WUS；采用EcoR V对重组载体pER8-WUS进行单酶切，获得载体片段；将Rd29A启动子诱导的CodA基因完整表达框插入经单酶切获得的pER8-WUS载体片段的EcoR V位点，以构建转化载体pER8-WUS-RdCodA。
所述农杆菌侵染，包含：将所述转化载体pER8-WUS-rdCodA通过电激法转化农杆菌感受态细胞EHA105，挑单克隆于含50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的YM培养基上划线，28±1℃培养；收集农杆菌菌体，将其悬浮于液体继代培养基中，不断晃动至菌体OD600为0.3～0.6，得到侵染液，在侵染液中添加乙酰丁香酮，乙酰丁香酮的浓度为100μmol/L；在侵染时，挑选白色愈伤组织加侵染液侵染，结束后吸干叶片上残留的侵染液，叶片移至共培养基上，在温度25±1℃，暗培养；其中，所述共培养基的组分包含：所述继代培养基和100μmol/L乙酰丁香酮。
所述毛竹抗性愈伤组织的筛选与不定芽的分化，包含：将共培养后的愈伤组织转入筛选培养基，培养温度25±1℃，暗培养，将新长出的愈伤在筛选培养基上继代培养后转入分化培养基，培养条件为温度25±1℃，光照；其中，所述筛选培养基的组分包含：所述继代培养基、1～5μmol/L雌二醇、20mg/L潮霉素、300mg/L头孢霉素；所述分化培养基的组分包含：MS培养基、2.0mg/L6-BA、1.0mg/LKT、0.5mg/LNAA、20mg/L潮霉素、300mg/L头孢霉素、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH＝5.8。对于筛选培养基，在不添加雌二醇的继代筛选培养基上，WUS基因不表达；添加雌二醇后，WUS基因被诱导表达，继代筛选过程中，抗性愈伤组织恢复由原来的8个继代周期缩短为5个继代周期，整个转化周期由原来的9个月缩短为6个月，转化效率由原来的3％提高至5.7％。雌二醇浓度在1μmol/L以上时均可诱导WUS基因表达，在5μmol/L及以上时WUS基因表达量提高2.3倍并趋于稳定。
所述转基因植株再生与炼苗移栽，包含：选取健壮的不定芽，移入生根培养基，培养温度25±1℃，光照，待根系形成后将幼苗移入生长培养基，培养温度25±1℃，光照；待根系发达，苗长到5cm以上时进行移栽；其中，所述生根培养基的组分包含：1/2MS培养基、2.0mg/L吲哚丁酸、300mg/L头孢霉素、20g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH＝5.8；所述生长培养基的组分包含：MS培养基、30g/L蔗糖、300mg/L头孢霉素、7g/L琼脂，pH＝5.8。
所述毛竹转基因再生植株检测，包含：采用CTAB法提取毛竹转基因再生植株基因组DNA，以非转基因毛竹为阴性对照，以含有CodA基因的质粒为阳性对照，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物，进行PCR扩增，对PCR产物进行凝胶电泳及成像检测，确定转基因阳性植株。
优选地，所述转化载体pER8-WUS-RdCodA的构建方法，包含：
采用Xho I/Spe I对pER8载体质粒进行双酶切，酶切反应体系包含：pER8质粒、XhoI、Spe I、CutSmart buffer、ddH2O，在37℃反应，待双酶切后经凝胶电泳，切取目的条带，采用凝胶回收试剂盒进行回收纯化，获得pER8线性化载体；
采用核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物，进行PCR扩增，经凝胶电泳后回收PCR产物，获得玉米WUS基因两端加入载体同源序列；
利用同源重组酶将WUS基因和pER8线性化载体回收产物进行连接反应，反应体系包含：得玉米WUS基因两端加入载体同源序列、pER8线性化载体、5×CE II Buffer、
Figure BDA0002890289170000041
II，在37℃反应；然后，将连接产物热激转化大肠杆菌感受态DH5a，涂布于含有卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单克隆摇菌，以获得重组载体pER8-WUS；
采用EcoRV对重组载体pER8-WUS进行单酶切，回收载体片段；
采用核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物，对Rd29A-CodA-Nos表达框进行PCR扩增，回收PCR产物，利用同源重组酶与单酶切的pER8-WUS载体片段连接，转化大肠杆菌感受态，以获得转化载体pER8-WUS-RdCodA。
优选地，所述毛竹幼胚愈伤组织的诱导中，所述未成熟毛竹种子灭菌为：将未成熟毛竹种子经75％酒精表面灭菌，无菌水冲洗，再浸泡于0.1％氯化汞溶液，最后经无菌水冲洗。
优选地，所述毛竹幼胚愈伤组织的诱导中，将胚剥离于愈伤诱导培养基上暗培养21天。
优选地，所述毛竹愈伤组织的增殖中，将诱导出的愈伤组织转置于继代培养基中暗培养，每隔21天继代。
优选地，所述农杆菌侵染中，挑单克隆于所述YM培养基上培养3天。
优选地，所述农杆菌侵染中，在侵染时，挑选白色愈伤组织加侵染液侵染15min。
优选地，所述农杆菌侵染中，在侵染后，叶片移至共培养基上在温度25℃暗培养2～4天。
优选地，所述转基因植株再生与炼苗移栽中，移栽采用的栽培基质为泥炭土和蛭石；移栽先光照培养后转移至遮阴大棚培养，最后进入野外林地栽培。
优选地，所述栽培基质为体积比1:1的泥炭土：蛭石。
本发明的毛竹幼胚离体再生及遗传转化的方法，解决了毛竹再生体系尚不完善的问题，具有以下优点：
本发明的毛竹幼胚离体再生及遗传转化的方法，以未成熟毛竹种子为诱导愈伤组织的材料，对未成熟毛竹种子消毒后将胚剥离，确保毛竹幼胚不被污染，愈伤诱导率高。而且，本发明构建了转化载体pER8-WUS-RdCodA，将干细胞决定基因WUS构建到诱导型载体中，通过在筛选培养基中添加雌二醇诱导剂来提高抗性愈伤组织的增殖和状态的改善，从而缩短转化周期，提高转化效率。
附图说明
图1为本发明构建的转化载体pER8-WUS-RdCodA的图谱。
图2为采用本发明的方法对毛竹幼胚愈伤组织诱导、基因转化及植株再生的过程。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种毛竹幼胚离体再生及遗传转化的方法，该方法包含：
(1)毛竹幼胚愈伤组织的诱导：
将未成熟毛竹种子经75％酒精表面灭菌60s，无菌水冲洗2次，再浸泡于0.1％氯化汞溶液20min，无菌水冲洗5次后，将胚剥离于愈伤诱导培养基上，25℃，暗培养21d，获得愈伤组织。
采用的诱导培养基为：MS+2.0～6.0mg/L2,4-D+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH＝5.8。
(2)毛竹愈伤组织的增殖：
将诱导出的愈伤组织转置于继代培养基中进行增殖，25℃暗培养，每隔21d(天)继代，以满足后续的遗传转化需求。
采用的继代培养基为：MS+0.1～1.0mg/L2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH＝5.8。
(3)转化载体构建：
将雌二醇诱导载体pER8进行Xho I/Spe I双酶切，在玉米WUS基因两端加入载体同源序列，并通过同源重组的方法将其插入pER8中；将Rd29A启动子诱导的CodA基因完整表达框插入EcoR V位点，构建为转化载体pER8-WUS-RdCodA，载体图谱如图1所示，具体步骤如下：
(3.1)采用Xho I/Spe I(购自NEB)对pER8载体质粒进行双酶切，酶切反应体系为：1μg pER8质粒、1μL Xho I、1μL Spe I、2.5μL CutSmart buffer，补ddH2O至25μL，37℃水浴3h；双酶切后经凝胶电泳，切取目的条带，采用凝胶回收试剂盒进行回收纯化，获得pER8线性化载体。
(3.2)根据玉米ZmWUS2基因序列设计引物，并在两端加上载体同源臂序列，以转基因毛竹基因组DNA为模板进行PCR扩增，经凝胶电泳后回收PCR产物。PCR扩增引物序列，如下：
WUS-F(SEQ ID NO.1)：
5’-TAGTCGACTCTAGCCTCGAGATGGCGGCCAATGCGGGCGG-3’；
WUS-R(SEQ ID NO.2)：
5’-GGAGGCCTGGATCGACTAGTTCACATACTCCCTGCAGCAG-3’。
(3.3)利用同源重组酶将WUS基因和pER8线性化载体回收产物进行连接反应，反应体系为：4μL PCR产物、2μL pER8线性化载体、4μL5×CE II Buffer、2μL
Figure BDA0002890289170000061
II，37℃30min。将连接产物热激转化大肠杆菌感受态DH5a，涂布于含有卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单克隆摇菌，经菌液PCR鉴定及测序后确定正确重组载体pER8-WUS。
(3.4)采用EcoR V对pER8-WUS载体进行单酶切，回收载体片段；设计同源重组PCR引物，对Rd29A-CodA-Nos表达框进行PCR扩增，回收PCR产物，利用同源重组酶与单酶切的pER8-WUS载体片段连接，转化大肠杆菌感受态，测序鉴定后获得正确重组载体。具体方法同上述WUS基因连接方法。其中，同源重组PCR引物，如下：
Rd-F(SEQ ID NO.3)：
5’-AGCTTGCATGCCTGCAGGATCTGCAAGAATCTCAAACACG-3’；
Nos-R(SEQ ID NO.4)：
5’-GGCAAGCTTGGATCCACGATGATCTAGTAACATAGATGAC-3’。
(4)农杆菌侵染：
将载体质粒pER8-WUS-rdCodA通过电激法转化农杆菌感受态EHA105，挑单克隆于含卡那霉素50mg/L和利福平25mg/L的YM培养基上划线(筛选阳性菌和抑制杂菌)，28℃培养3天。收集农杆菌菌体，将其悬浮于液体继代培养基中，不断晃动30min后至菌体OD600为0.3～0.6，即为侵染液，在侵染液中添加乙酰丁香酮，乙酰丁香酮的浓度为100μmol/L，用于转化。乙酰丁香酮通过诱导农杆菌Vir区基因的活化与表达，促进T-DNA的加工与转移，从而促使农杆菌T-DNA更容易进入植物基因组并与其整合。
在侵染时，挑选白色愈伤组织100粒加100mL侵染液，侵染时间15min；用滤纸吸干叶片上残留的侵染液，叶片移至共培养基上培养时间2～4天。
共培养条件为：温度25℃，暗培养。
采用的共培养基为：继代培养基+乙酰丁香酮100μmol/L。
(5)毛竹抗性愈伤组织的筛选与不定芽的分化：
将共培养后的愈伤组织转入筛选培养基，培养温度25℃，暗培养，每2周换培养基一次，四周后愈伤逐渐褐化，有少量新的愈伤长出。将新长出的愈伤在筛选培养基上继代培养3个月后转入分化培养基，培养条件为温度25℃，每天光照16h。
采用的筛选培养基为：继代培养基+雌二醇1～5μmol/L+潮霉素20mg/L+头孢霉素300mg/L。构建的基因载体的T-DNA区含有潮霉素筛选标记，转化植物后需要在培养基中添加潮霉素进行筛选以获得抗性愈伤及再生植株，经过研究潮霉素的浓度影响，研究浓度0至40mg/L，以20mg/L筛选效果最佳。头孢霉素的作用为抑制农杆菌的生长。
采用的分化培养基为：MS+2.0mg/L 6-BA(6-苄基腺嘌呤)+1.0mg/L KT(激动素)+0.5mg/L NAA(萘乙酸)+20mg/L潮霉素+300mg/L头孢霉素+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH＝5.8。对分化培养基中各激素的浓度影响研究，设置6-BA浓度0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L，KT浓度0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L，NAA浓度0.1mg/L、0.3mg/L、0.5mg/L，通过L9(33)正交实验设计，不定芽分化率在32.34～62.58％，在添加2.0mg/L 6-BA、1.0mg/L KT、0.5mg/L NAA时，不定芽分化率在最高。
(6)转基因植株再生与炼苗移栽：
选取健壮的不定芽，移入生根培养基。培养温度25℃，光照每天16h，2周后根系形成，即可将幼苗移入生长培养基，培养温度25℃，光照每天16h。待根系发达，苗长到5cm以上时进行移栽，栽培基质为泥炭土：蛭石＝1:1(v/v)，置于光照培养箱内培养，光照强度20000Lx，每天光照16h，黑暗8h，光照时温度为25℃，黑暗时温度为20℃，1月后即可转移至遮阴大棚培养，2月后可进入野外林地栽培。
采用的生根培养基为：1/2MS+2.0mg/LIBA(吲哚丁酸)+300mg/L头孢霉素+20g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH＝5.8。其中，1/2MS培养基是把微量元素减少到原来的1/2。对于生根培养基，研究IBA添加浓度的影响，添加浓度从0.5mg/L至2.0mg/L，随着IBA浓度升高，生根越快，生根率越高，其中IBA为2.0mg/L时，一周便有根长出，2周后根可达3～4cm，生根率可达95％以上。
采用的生长培养基为：MS+30g/L蔗糖+300mg/L头孢霉素+7g/L琼脂，pH＝5.8。
(7)毛竹转基因再生植株检测。
采用CTAB法提取毛竹转基因再生植株基因组DNA，以非转基因毛竹为阴性对照，以含有CodA基因的质粒为阳性对照，以CodA基因序列设计PCR扩增引物，设置PCR扩增体系和扩增程序，对PCR产物进行凝胶电泳及成像检测，确定转基因阳性植株。其中，以CodA基因序列设计的PCR扩增引物，如下：
Cod-F(SEQ ID NO.5)：
5’-AATCGGGCTACGACTGG-3’；
Cod-R(SEQ ID NO.6)：
5’-GCGTCCTCGTTGGTTTC-3’。
如图2所示，为采用本发明的方法对毛竹幼胚愈伤组织诱导、基因转化及植株再生的过程，A为毛竹未成熟种子，B、D为毛竹幼胚，C、E为毛竹幼胚诱导愈伤组织，F为愈伤组织增殖，G为转化后抗性愈伤筛选，F为抗性不定芽分化，I为移入生根培养基中生长，J为再生植株移栽，可以看出，本发明的方法能够以毛竹幼胚诱导的愈伤组织作为受体材料，对转化载体进行改造，利用农杆菌介导法获得转基因再生植株。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
序列表
<110> 中国林科院亚热带林业研究所
<120> 一种毛竹幼胚离体再生及遗传转化的方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
tagtcgactc tagcctcgag atggcggcca atgcgggcgg 40
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ggaggcctgg atcgactagt tcacatactc cctgcagcag 40
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
agcttgcatg cctgcaggat ctgcaagaat ctcaaacacg 40
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ggcaagcttg gatccacgat gatctagtaa catagatgac 40
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
aatcgggcta cgactgg 17
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
gcgtcctcgt tggtttc 17

Claims (10)

1.一种毛竹幼胚离体再生及遗传转化的方法，其特征在于，该方法包含：毛竹幼胚愈伤组织的诱导、毛竹愈伤组织的增殖、转化载体pER8-WUS-RdCodA的构建、农杆菌侵染、毛竹抗性愈伤组织的筛选与不定芽的分化、转基因植株再生与炼苗移栽和毛竹转基因再生植株检测；
所述毛竹幼胚愈伤组织的诱导，包含：
对未成熟毛竹种子灭菌后，将胚剥离于愈伤诱导培养基上，25±1℃暗培养，以诱导出愈伤组织；其中，所述愈伤诱导培养基的组分为：MS培养基、2.0～6.0mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH＝5.8；
所述毛竹愈伤组织的增殖，包含：
将所述愈伤组织转置于继代培养基中进行继代培养，25±1℃暗培养；其中，所述继代培养基的组分为：MS培养基、0.1mg/L或1.0mg/L的2,4-D、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH＝5.8；采用含0.1mg/L 2,4-D的继代培养基和1.0mg/L 2,4-D的继代培养基交替进行继代培养；
所述转化载体pER8-WUS-RdCodA的构建，包含：
将雌二醇诱导载体pER8进行Xho I/Spe I双酶切，以获得pER8线性化载体；在玉米WUS基因两端加入载体同源序列，并通过同源重组的方法将其插入pER8线性化载体中，获得重组载体pER8-WUS；采用EcoR V对重组载体pER8-WUS进行单酶切，获得载体片段；将Rd29A启动子诱导的CodA基因完整表达框插入经单酶切获得的pER8-WUS载体片段的EcoRV位点，以构建转化载体pER8-WUS-RdCodA；
所述农杆菌侵染，包含：
将所述转化载体pER8-WUS-RdCodA通过电激法转化农杆菌感受态细胞EHA105，挑单克隆于含50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的YM培养基上划线，28±1℃培养；收集农杆菌菌体，将其悬浮于液体继代培养基中，不断晃动至菌体OD600为0.3～0.6，得到侵染液，在侵染液中添加乙酰丁香酮，乙酰丁香酮的浓度为100μmol/L；
在侵染时，挑选白色愈伤组织加侵染液侵染，结束后吸干叶片上残留的侵染液，叶片移至共培养基上，在温度25±1℃，暗培养；其中，所述共培养基的组分为：所述继代培养基和100μmol/L乙酰丁香酮；
所述毛竹抗性愈伤组织的筛选与不定芽的分化，包含：
将共培养后的愈伤组织转入筛选培养基，培养温度25±1℃，暗培养，将新长出的愈伤在筛选培养基上继代培养后转入分化培养基，培养条件为温度25±1℃，光照；其中，所述筛选培养基的组分为：所述继代培养基、1～5μmol/L雌二醇、20mg/L潮霉素、300mg/L头孢霉素；所述分化培养基的组分为：MS培养基、2.0mg/L 6-BA、1.0mg/L KT、0.5mg/LNAA、20mg/L潮霉素、300mg/L头孢霉素、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH＝5.8；
所述转基因植株再生与炼苗移栽，包含：
选取健壮的不定芽，移入生根培养基，培养温度25±1℃，光照，待根系形成后将幼苗移入生长培养基，培养温度25±1℃，光照；待根系发达，苗长到5cm以上时进行移栽；其中，所述生根培养基的组分为：1/2MS培养基、2.0mg/L吲哚丁酸、300mg/L头孢霉素、20g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH＝5.8；所述生长培养基的组分为：MS培养基、30g/L蔗糖、300mg/L头孢霉素、7g/L琼脂，pH＝5.8；
所述毛竹转基因再生植株检测，包含：
采用CTAB法提取毛竹转基因再生植株基因组DNA，以非转基因毛竹为阴性对照，以含有CodA基因的质粒为阳性对照，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物，进行PCR扩增，对PCR产物进行凝胶电泳及成像检测，确定转基因阳性植株。
2.根据权利要求1所述的毛竹幼胚离体再生及遗传转化的方法，其特征在于，所述转化载体pER8-WUS-RdCodA的构建方法，包含：
采用Xho I/Spe I对pER8载体质粒进行双酶切，酶切反应体系包含：pER8质粒、Xho I、Spe I、CutSmart buffer、ddH2O，在37℃反应，待双酶切后经凝胶电泳，切取目的条带，采用凝胶回收试剂盒进行回收纯化，获得pER8线性化载体；
采用核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物，进行PCR扩增，经凝胶电泳后回收PCR产物，获得两端加入载体同源序列的玉米WUS基因；
利用同源重组酶将WUS基因和pER8线性化载体回收产物进行连接反应，反应体系包含：两端加入载体同源序列的玉米WUS基因、pER8线性化载体、5×CE II Buffer、
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II，在37℃反应；然后，将连接产物热激转化大肠杆菌感受态DH5a，涂布于含有卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单克隆摇菌，以获得重组载体pER8-WUS；
采用EcoRV对重组载体pER8-WUS进行单酶切，回收载体片段；
采用核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物，对Rd29A-CodA-Nos表达框进行PCR扩增，回收PCR产物，利用同源重组酶与单酶切的pER8-WUS载体片段连接，转化大肠杆菌感受态，以获得转化载体pER8-WUS-RdCodA。
3.根据权利要求1所述的毛竹幼胚离体再生及遗传转化的方法，其特征在于，所述毛竹幼胚愈伤组织的诱导中，所述未成熟毛竹种子灭菌为：将未成熟毛竹种子经75％酒精表面灭菌，无菌水冲洗，再浸泡于0.1％氯化汞溶液，最后经无菌水冲洗。
4.根据权利要求1所述的毛竹幼胚离体再生及遗传转化的方法，其特征在于，所述毛竹幼胚愈伤组织的诱导中，将胚剥离于愈伤诱导培养基上暗培养21天。
5.根据权利要求1所述的毛竹幼胚离体再生及遗传转化的方法，其特征在于，所述毛竹愈伤组织的增殖中，将诱导出的愈伤组织转置于继代培养基中暗培养，每隔21天继代。
6.根据权利要求1所述的毛竹幼胚离体再生及遗传转化的方法，其特征在于，所述农杆菌侵染中，挑单克隆于所述YM培养基上培养3天。
7.根据权利要求1所述的毛竹幼胚离体再生及遗传转化的方法，其特征在于，所述农杆菌侵染中，在侵染时，挑选白色愈伤组织加侵染液侵染15min。
8.根据权利要求1所述的毛竹幼胚离体再生及遗传转化的方法，其特征在于，所述农杆菌侵染中，在侵染后，叶片移至共培养基上在温度25℃暗培养2～4天。
9.根据权利要求1所述的毛竹幼胚离体再生及遗传转化的方法，其特征在于，所述转基因植株再生与炼苗移栽中，移栽采用的栽培基质为泥炭土和蛭石；移栽先光照培养后转移至遮阴大棚培养，最后进入野外林地栽培。
10.根据权利要求9所述的毛竹幼胚离体再生及遗传转化的方法，其特征在于，所述栽培基质为体积比1:1的泥炭土：蛭石。
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